肾癌G250/MN/CAIX抗原基因在酿酒酵母中的诱导表达及意义

【目的】观察G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】应用基因重组技术将人G250cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NTC,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NTC-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Westernblot检测。【结果】成功构建pYES2/NTC-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8～12h达高峰。【结论】人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础。     

肾癌G250/MN/CAIX 抗原基因在酿酒酵母中的 诱导表达及意义

 【目的】 观察G250 抗原基因编码区cDNA 全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】 应用基因重组技术将人G250 cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NT C,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NT C-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Western blot检测。【结果】 成功构建pYES2/NT C-G250 重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8 ~ 12 h 达高峰。【结论】 人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250 疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础.     

表皮生长因子受体跨膜区编码序列的克隆

目的：克隆表皮生长因子受体跨膜区（Transmembrane,TM）编码序列，为构建跨膜型超抗原和细胞因子的表达载体奠定基础。方法：以表达c-erb-B2癌基因的中国卵巢癌细胞系HO－8910细胞的RNA逆转录产物(cDNA）为模板，用两条针对c-erb-B2全长基因序列中编码TM区序列特异性的引物，采用RT－PCR方法克隆TM区片段并测序。结果：实验克隆的TM编码序列，经测序证实与Genbank中接受号为M11730的TM区序列完全一致；与接受号为X03363的TM区序列存在G→A的多态性。结论：成功地克隆了TM编码序列，并证实源于中国的卵巢癌细胞系HO－8910中所包含的表皮生长因子受体基因中编码的TM区序列存在多态性。     

大鼠睾丸AQP8和绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体构建

目的：克隆Wistar大鼠睾丸水通道蛋白(AQP8)cDNA,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与大鼠AQP8的融合蛋白真核细胞表达载体。方法：用RT-PCR钓取AQP8 cDNA编码区全长序列,测序鉴定,将AQP8 cDNA亚克隆于pEGFP-C1基因的下游。结果：①AQP8 cDNA测序结果与登录在GenBank上的大鼠AQP8基因序列（GenBank登录号：NM_019158）高度同源,但PCR产物的序列分析结果中发现4个碱基序列与已发表的AQP8序列不同：NM_019158的第135~137位碱基分别是C、A和G,而测序结果缺乏这3个碱基,NM_019158的第311位为A,而测序结果为G;②酶切鉴定在表达载体pEGFP-C1中AQP8 cDNA融合于EGFP基因的下游。结论：pEGFP-C1-AQP8融合蛋白的表达载体构建成功。     

宫颈癌特异抗原MN/CA9的多糖蛋白表达载体的构建及鉴定

目的 克隆宫颈癌MN／CA9抗原的多糖蛋白cDNA，并构建表达载体。方法从宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA，RT—PCR法扩增MN／CA9抗原的多糖蛋白cDNA，将其插入载体pCA13，转化大肠杆菌3M109，构建MN／CA9抗原的多糖蛋白表达载体pCA13-MN。酶切及测序鉴定。结果酶切及序列分析结果证明，目的基因成功克隆入载体。结论成功构建了MN／CA9多糖蛋白表达载体。     

表达抗G250人源性抗体增殖缺陷型腺病毒的构建

目的构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。方法通过重叠延伸PCR、常规PCR方法,分别获得G250重链的可变区和恒定区（GH）eDNA序列及G250轻链（GL）eDNA序列,并克隆至pCLON12-IRES载体上,构建质粒pCLON12-GL-IRES—GH。酶切质粒pCLON12-GL—IRES—GH回收GL—IRES—GH片段,克隆至腺病毒载体pDC315,构建pDC315-GL—IRES—GH（pDC315-G250）。将pDC315-G250与腺病毒包装骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞,重组包装表达G250抗体的增殖缺陷型腺病毒AdDC315一G250。纯化病毒表达的G250抗体,免疫印迹实验检测该抗体能否与细胞表面抗原特异性结合。结果PCR及测序结果表明成功构建质粒pCLON12-GL—IRES—GH及腺病毒穿梭质粒pDC315-G250。PCR鉴定表明重组腺病毒AdDC315-G250含有目的基因,病毒包装成功。免疫印迹实验结果显示,纯化的抗体在G250抗原阳性的细胞中能检测到目的条带。结论成功构建表达抗G250人源性抗体的增殖缺陷型腺病毒。     

人G250真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的构建人G250真核表达载体,建立稳定表达人G250的小鼠黑色素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人G250基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo-sig中,并加入酶切位点和FLAG标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-sig-FLAG-G250。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR及免疫荧光检测人G250在B16细胞中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-sig-FLAG-G250重组质粒构建正确,最终建立的表达人G250基因的B16细胞系阳性率接近100%。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-sig-FLAG-G250,建立的稳定转染人G250小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达G250基因。该稳定转染细胞系的建立为G250在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

人CD38分子基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆并表达人CD38抗原分子的全长cDNA。方法：采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中克隆出CD38全长cDNA并将其插入pGEM-T载体中，重新设计引物，引入酶切 位点，二次PCR；从重组pGEMT载体上扩增CD38抗原分子的cDNA编码序列，再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，用脂质体法转染COS7细胞。用免疫荧光及A－PAAP方法检测CD38抗原的表达。结果：克隆的CD38抗原的全长cDNA，经酶切鉴定及序列分析表明，其序列与文献报道完全一致。免疫荧光及APAAP方法检测表明，CD38抗原分子在COS7细胞中获得表达。结论：成功构建了CD38真核表达载体，并在COS7细胞中获得表达，对研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

肾癌G250基因和hGM-CSF基因双顺反子表达质粒的构建及鉴定

目的 应用分子生物学技术,构建pIG250-GM双顺反子真核表达质粒并进行测序鉴定.方法 从肾癌组织中提取总KNA,采用RT PCR技术扩增肾癌G250抗原的基因编码区序列,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐荆hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIG250-GM真核表达质粒,并进行酶切鉴定.结果 酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.44kμ和0.47kμ,测序分析表明克隆的G250和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致.结论 成功构建双顺反子表达pIGM-G250质粒,为研究G250-GMCSF基因负载的DC疫苗防治肾癌提供了必要的实验基础.     

骆驼抗G250蛋白胞外区纳米抗体的制备及鉴定

目的 制备能与肾癌相关抗原G250胞外区特异性结合的纳米抗体.方法 通过瞬时转染方式将包含G250蛋白胞外区基因片段的质粒导入到真核细胞HEK 293F中表达G250胞外区,以该重组蛋白免疫新疆双峰驼,构建噬菌体展示纳米抗体库.通过体外定向筛选,得到能与G250蛋白胞外区特异性结合的噬菌体,以Monoclonal phage ELISA方法筛选出具有结合活性的噬菌体克隆.通过细胞ELISA和流式细胞仪再次验证淘选到的纳米抗体的细胞结合活性.结果 测序证明编码G250的重组DNA片段序列正确,Western blot检测结果证实G250重组蛋白成功表达.通过免疫新疆双峰驼,成功构建了库容为2.87×109的噬菌体展示骆驼VHH免疫文库.在体外对免疫纳米抗体库进行3轮固相筛选,使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集,阳性率高达54.3％.经过抗原ELISA、细胞ELISA鉴定,筛选出3个具有细胞结合活性的纳米抗体噬菌体克隆,取其中结合活性最高的Nb-G5进行表达、纯化,产量为1.5 mg/L培养物,流式细胞仪检测结果证实Nb-G5与G250表达阳性的细胞具有很强的特异性结合能力.结论 从纳米抗体库中淘选得到了在分子和细胞水平均能与G250蛋白胞外区特异性结合的纳米抗体.     

利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ

目的 利用原核表达系统制备肾癌相关抗原G250/MN/CA Ⅸ.方法 采用PCR法从原有质粒中扩增G250/MN/CA Ⅸ全长编码序列,将获得的编码序列片段插入pET32a( )表达载体,转化Rosseta大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,而后进行纯化及Western blot鉴定.结果 正确构建pET32a( )/G250重组质粒,重组质粒转化Rosseta菌后,经IPTG诱导,在58 000相对分子质量处有明确的条带.目的蛋白表达占菌体总蛋白的32.7%.89.9%的重组蛋白是可溶性的.Western blot结果显示纯化后的蛋白可以与G250单克隆抗体M75特异性结合.结论 在原核系统中成功进行G250/MN/CAⅨ的高效表达,为下一步的单克隆抗体制备和蛋白功能研究奠定了基础.     

以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体

目的 构建肾癌相关抗原G250重组腺病毒载体,以期用于基因转染树突状细胞(DC)治疗肾癌的实验研究.方法 利用AdMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC316-G250,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre以CaCL2法质粒共转染293细胞得到重组腺病毒Ad/G250,CsCl梯度离心纯化病毒,TCID50法测定病毒滴度.Ad/G250转染DC细胞,RT-PCR及流式细胞仪检测G250的表达.结果 采用双质粒共转染293细胞,Cre/loxP位点同源重组方法构建了E1和E3缺失的含外源基因的Ad/G250载体.经过PCR、RT-PCR和流式细胞仪证实腺病毒载体构建成功.病毒经过CsCl梯度离心纯化后,Ad/G250滴度达到5.6×109 U/ml.RT-PCR及流式细胞仪显示Ad/G250在DC中特异性表达.结论 成功构建了G250重组腺病毒载体.     

广州地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因序列分析

目的：探讨广州地区呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因变异的生物学意义，为研究广州地区BSV感染特点及RSV疫苗提供依据。方法：用PT—PCR的方法从广州地区呼吸道合胞病毒分离株98159株的细胞培养物中扩增出编码其表面蛋白G的基因片段，克隆至pGEM—T载体中并进行序列测定。结果：序列测定结果与A亚型原型株A2抹、1990年中国北京地区分离株B79G蛋白的核苷酸序列比较核苷酸同源率分别为92．7％及98．4％；由核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源率分别为88.3％及97．0％。一些重要的免疫反应位点发生了变异。结论：RSVG蛋白抗原结构变异大，在研制疫苗时应注意选用株的地区性。     

多囊蛋白-1胞内区cDNA的克隆与表达

目的：获取多囊蛋白-1胞内区片段。方法：用PCR法克隆多囊蛋白-1胞内区的cDNA片段,然后插入融合蛋白表达载体pProEXHta中,经测序证实后,转入大肠杆菌中表达并用亲和层析法进行纯化。结果：克隆到一个660bp的多囊蛋白-1胞内区cDNA片段,得到了一个相对分子质量为2.6万的融合蛋白。结论：多囊蛋白-1胞内区片段的融合蛋白为制备抗多囊蛋白-1单克隆抗体提供了基础。     

人LIGHT基因的克隆及其在293T细胞中的表达

目的克隆人LIGHT分子的全长cDNA,构建重组真核表达质粒pCI-neo-LIGHT并在293T细胞上获得稳定表达.方法从人T细胞cDNA文库中用PCR技术克隆人LIGHT全长cDNA,装入T-Easy载体,测序证实后,将LIGHT cDNA装入质粒pCl-neo中构建真核表达载体.用电穿孔法转染293T细胞,经G418筛选后,用流式细胞仪检测LIGHT分子的表达.结果测序证实克隆的LIGHT全长cDNA阅读框正确完整,酶切证实LIGHT-pCI-neo中LIGHT插入方向正确.转染的293T细胞经G418筛选3个月后,流式细胞仪检测有78.69%的细胞表达人LIGHT分子.结论成功克隆LIGHT基因并获得稳定表达膜型LIGHT分子的293T细胞系.     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

Cloning of human melanoma antigen MAGE-A9 and its expression in hepatocellular carcinomas

Objective：To express the melanoma associated gene MAGE-A9 recombinant protein, obtain the anti-MAGE-A9 monoclonal antibody and to examine the expression of MAGE-A9 in hapatocellular carcinoma specimens. Methods：MAGE-A9 cDNA was cloned from human hepatocellular carcinoma tissue by using RT-PCR, and then subcloned into the plasmid pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/gⅢ to construct the recombinant expression vector pBAD/gⅢ - MAGE-A9, and was transformed into E. coli TOP10. The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose, and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay. Results：The cDNA sequence of the cloned MAGE-A9 gene was consistent with the reported sequence. By affinity column and SDS-PAGE, the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35,000, and subsequently the anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was obtained. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected in 8 cases out of 39 （21%） hepatocellular carcinoma specimens. Conclusion：MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens, these patients might be suitable candidates for immune involving antigen, encoded by the MAGE-A9 gene.