听觉剥夺和耳蜗内电刺激引起幼鼠听觉通路bdnf和c-fos基因及蛋白改变

目的 观察耳聋幼鼠及耳聋后单耳植入电极电刺激后,其听皮层和下丘、耳蜗核三个部位的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, bdnf)、c-fos基因、蛋白表达水平的变化情况。方法 将66只SD幼鼠随机分为6组,每组11只,分别为注射药物后耳聋4周组(A1组)及对照组(A2组),耳聋6周组(B1组)和及对照组(B2组),注射药物后3周接受耳蜗内电刺激组(C组),5周接受耳蜗内电刺激组(刺激时间为1周,D组)。于幼鼠颈背部、两侧下腹部皮下注射庆大霉素(总量为350mg/kg),0.5h后于相同部位注射呋塞米(总量为200mg/kg)。分别于注射药物后不同时间取听皮层、下丘及耳蜗核三个部位的组织行实时荧光定量PCR及免疫组织化学方法,观察bdnf及c-fos基因及蛋白表达的变化。结果 A1组在听皮层、下丘及耳蜗核部位的bdnf及c-fos基因及蛋白表达均较A2组上升,较C组下降(P＜0.05)。B1组在听皮层、下丘及耳蜗核部位bdnf及c-fos基因及蛋白表达均较B2组和D组下降(P＜0.05)。各组之间的差异均有统计学意义。结论 听觉剥夺可导致幼鼠听皮层、下丘和耳蜗核部位的bdnf及c-fos基因及蛋白早期表达增多,而晚期表达下降。耳蜗植入电极电刺激可导致幼鼠听皮层、下丘和耳蜗核部位的bdnf及c fos基因及蛋白表达增多。bdnf及c-fos基因及蛋白表达的动态变化反映三个部位的可塑性变化。     

听觉剥夺后大鼠听皮层神经元的形态学变化和SHP-2基因的表达

目的研究双侧耳蜗毁损后大鼠听皮层神经元细胞的形态学变化和蛋白酪氨酸磷酸酶2型（src-homology domain containing protein tygosine phosphatase type 2,SHP -2）基因的表达。方法选取SD大鼠48只,随机分为4个实验组（2周组、4周组、6周组、8周组）和4个相应的对照组,每组6只。实验组动物行双侧耳蜗损毁术,通过HE染色和Nissl染色观察听皮层神经元细胞的形态学变化,用RT -PCR技术检测各组听皮层神经元细胞的SHP-2基因的表达,行相对定量分析。结果 HE染色和Nissl染色可见各实验组大鼠听皮层神经元细胞的凋亡形态随时间延长而加重,呈多样化表现;各对照组大鼠听皮层细胞形态正常。实验2、4、6、8周组SHP-2基因的RT -PCR相对表达量分别为1．1±0．28、1．5±0．04、2．5±0．08、11．0±0．06,随时间延长呈上升趋势,各实验组之间差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论听觉剥夺可导致听皮层神经元细胞凋亡,凋亡的程度随时间延长逐渐加重;SHP-2基因可促进听皮层神经元细胞的增生,增生的程度也随时间延长而加重;在这两个相互拮抗的因素中,凋亡是最终的结果。     

耳蜗电刺激对听觉剥夺幼鼠学习记忆能力的实验研究

目的 建立听力障碍和耳蜗电刺激模型,探讨听力障碍及耳蜗电刺激对幼鼠认知功能的影响.方法 选用健康SD幼鼠随机分成4组:①听觉剥夺组(auditory deprivation,AD);②听觉剥夺+早期耳蜗电刺激组(early intracochlear electrical stimulation,ICES1);③听觉剥夺+晚期耳蜗电刺激组(late intracochlearelectrical stimulation,ICES2);④对照组(normal control,NC).AD组、ICES1组、ICES2组在出生后第7天开始用阿米卡星500 mg/kg.d皮下注射,直到出生后第16天.对听觉剥夺的幼鼠分别于生后3周龄(早期干预组,ICES1)和生后7周龄(晚期干预组,ICES2)进行电刺激,持续3小时/天,共1周.然后对各组进行行为学检测,并与同龄对照组比较.结果 Morris水迷宫实验结果①定位航行试验:早期耳蜗电刺激组(ICES1组)逃避潜伏期于训练后第3天及第4天逐渐达正常水平(与对照组比较,P值均＞0.05),明显短于听觉剥夺组(P值均<0.05);晚期耳蜗电刺激组(ICES2)每日逃避潜伏期虽较听觉剥夺组稍有缩短,但与正常组比较,仍明显延长(均为P<0.05).②空间探索实验:早期电刺激组幼鼠在平台象限的游泳时间明显长于听觉剥夺组,穿越平台的次数较听觉剥夺组明显增多(P<0.05),达同龄正常对照组水平.而晚期电刺激组幼鼠在平台象限的游泳时间、穿越平台的次数与听觉剥夺组比较无统计学意义(P>0.05).结论 听力丧失后学习和记忆能力受损,早期耳蜗电刺激可以改善听力障碍幼鼠的学习记忆能力.     

外周听觉活性改变诱导在体听皮层突触NMDA受体表达变化

目的 观察听觉剥夺和耳蜗电刺激对听皮质突触N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-as-partate receptor，NMDAR)表达的影响。方法 经两次不连续梯度超速离心，从初级听皮质提取高度纯化的突触体后，采用Western blotting对耳毒性聋组、听力正常组及电耳蜗内刺激0.5～2h的各实验组听皮质突触体NMDAR三个亚型的表达进行比较。结果 证实了听觉剥夺的成年或发育期大鼠耳蜗电刺激仅仅1.5小时可以诱导突触体NR2A蛋白的显著增加，但NR1和NR2B蛋白量的改变并不显著。结论 在体大鼠的听皮质存在活性依赖的突触的NR2A蛋白的表达。     

豚鼠脑震荡后耳蜗功能及螺旋神经节细胞的病理变化研究

目的探讨脑震荡后耳蜗毛细胞功能以及螺旋神经节细胞的病理变化,为临床患者脑震荡后耳聋的诊治及法医学的鉴定提供一定的实验依据。方法选用听力正常的白毛红目豚鼠40只,雌雄不限,随机分为四组,分别为正常对照组、撞击后4周组、撞击后6周组和撞击后8周组。应用听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）测试四组动物的听力和耳蜗功能,应用透射电镜观察各组耳蜗螺旋神经节细胞的病理改变。结果ABR阈值：撞击后4周、6周、8周组分别与正常对照组阈值比较均提高,差异有统计学意义（P〈0.05）;DPOAE结果：撞击后4周组与正常对照组在频率0.5kHz、0.7kHz、1kHz、2kHz比较有差异（P〈0.05）;撞击后6周组与正常对照组仅在频率4kHz比较有差异（P〈0.05）;撞击后8周组与正常对照组只在频率1kHz比较有差异（P〈0.05）。透射电镜发现实验各组螺旋神经节细胞有不同程度的受损,表现为线粒体肿胀,空泡样变,线粒体嵴消失或位于周边,粗面内质网扩张等。结论脑震荡伤后可以引起ABR、DPOAE的异常和耳蜗螺旋神经节细胞的损伤。     

慢性噪声暴露对大鼠听皮层及海马脑区胰岛素样生长因子－1表达的影响

目的：观察慢性噪声暴露后大鼠听皮层及海马脑区胰岛素样生长因子－1（insulin－like growth fac-tor－1,IGF－1）的表达,探讨其在长期噪声性中枢神经系统损伤中的作用。方法成年健康雄性 Wistar 大鼠16只,随机分为噪声组和对照组各8只,噪声组暴露于100 dB SPL 白噪声28天,每天4小时,制成慢性噪声暴露模型,对照组不予任何处理。造模结束后检测两组大鼠 ABR 反应阈,并采用免疫组织化学染色方法检测 IGF－1在听皮层和海马的表达。结果噪声组造模结束后 ABR 反应阈（80．62±4．58 dB SPL）较对照组（38．75±3．54 dB SPL）明显升高（P＜0．05）,听皮层及海马脑区 IGF－1阳性神经元数目和表达强度均较对照组显著增加（P＜0．05）。结论慢性噪声暴露可以使听皮层及边缘系统海马脑区 IGF－1表达增高,这可能与其对中枢神经系统噪声性损伤的保护作用有关。     

NADPH氧化酶在D-半乳糖诱导的老化大鼠听觉系统氧化损伤过程中的作用

目的研究NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）在D-半乳糖诱导的老化大鼠外周听觉系统耳蜗和中枢听觉系统听皮层组织中的表达,探讨老年性耳聋氧化性损伤的发生机制。方法 48只1个月龄雄性Spragua-Dawley大鼠按数字随机法分成两组,每组各24只。D-半乳糖组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖（500 mg/kg）,连续8周;对照组：每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。造模完成后,取两组大鼠外周听觉系统耳蜗和中枢听觉系统听皮层组织,利用免疫组织化学法检测DNA氧化损伤生物标记物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG）;利用实时定量PCR检测线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）普遍缺失（common deletion,CD）和NOX基因的表达;利用Western blot检测NOX蛋白表达;应用Taqman PCR检测mt DNA CD。所有实验数据采用两样本的t检验进行分析。结果 D-半乳糖组和对照组大鼠相比较,D-半乳糖诱导的老化大鼠8-OHdG的表达在耳蜗和听皮层组织中明显增多,两组比较差异具有统计学意义（t分别为6.341、10.589,P均〈0.05）;NOX3基因和蛋白的表达在耳蜗组织中明显增强,两组比较差异具有统计学意义（t分别为8.491、18.983,P均〈0.05）;NOX2基因和蛋白的表达在听皮层组织中明显增强,两组比较差异具有统计学意义（t分别为3.548、8.219,P均〈0.05）;mtDNA CD的累积在耳蜗和听皮层组织中明显增多,两组比较差异具有统计学意义（t分别为9.796、7.901,P均〈0.05）。结论在听觉系统老化过程中,NOX是活性氧的重要来源,可能是导致老年性耳聋氧化性损伤发生的重要原因。     

生长相关蛋白-43在听觉剥夺大鼠听皮层中的表达研究

目的探索听觉系统发育和损伤后修复的神经可塑性的分子机制,探索GAP-43与幼鼠听皮层发育和可塑性的关系;方法应用免疫组织化学方法,检测正常幼鼠(3周龄、4周龄及8周龄大鼠)及耳毒性药物致聋鼠发育的不同阶段(2周2天龄大鼠氨基糖苷类抗生素致聋后5天、12天及40天,即致聋的3周龄、4周龄及8周龄大鼠)GAP-43在听皮层的阳性神经元表达变化;结果发现GAP-43在刚出生大鼠听皮层阳性神经元高表达,随发育表达逐渐降低,出生后3周(NC P3W)的大鼠听皮层平均每高倍视野阳性神经元数为111.50±4.90,出生后4周(NC P4W)为84.17±3.24,出生后8周(NC P8W)为66.67±4.17;耳蜗损伤后早期GAP-43在幼鼠听皮层的表达反应性升高;结论 GAP-43与幼鼠听皮层发育和可塑性密切相关,GAP-43可作为听皮层乃至听觉系统发育和可塑性的重要标志。     

胱硫醚-γ-裂解酶在大鼠耳蜗的分布及其在噪声刺激后的表达变化

目的探讨大鼠耳蜗胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase,CSE）的分布情况及在噪声刺激后的表达变化。方法通过免疫组织化学及免疫荧光染色技术,观察CSE在正常成年SD大鼠耳蜗内的分布及定位。32只SD大鼠被分成4组：正常对照组、1天组、1周组、3周组,后3组分别暴露于110dBSPL宽带白噪声中。采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测大鼠接受强噪声刺激前后CSE在耳蜗内的表达变化。结果CSE主要表达在大鼠耳蜗的血管纹,螺旋突,以及耳蜗微小血管处;在耳蜗内外毛细胞、各类支持细胞、盖膜及蜗神经节处未见明显表达。随着噪声刺激时间的延长,CSE在mRNA水平的表达呈先增长后下降的趋势。结论CSE在耳蜗内的分布及其在噪声刺激后的表达变化,提示其在改善耳蜗血循环方面可能发挥重要作用。     

电针耳穴对年龄相关性听力损失豚鼠听觉中枢β－catenin表达的影响

目的：探讨电针耳穴对D －半乳糖所致的年龄相关性听力损失豚鼠模型听觉中枢β－链蛋白（β－catenin）表达的影响。方法取3月龄豚鼠30只,随机分成三组：D －半乳糖模型组、D －半乳糖＋电针组和对照组,每组各10只;18月龄豚鼠10只作为自然老化组。D－半乳糖模型组给予D －半乳糖（300 mg · kg －1· d－1）颈背部皮下注射,每天1次,连续6周;对照组给予等量生理盐水注射相同部位、相同频次、持续相同时间;D －半乳糖＋电针组给予相同剂量的D －半乳糖颈背部皮下注射,30 min后给予电针听宫穴和翳风穴治疗15分钟,每日1次,共6周。自然老化组豚鼠常规饲养。上述实验结束后采用蛋白质印迹（Western blot）方法检测四组豚鼠下丘和听皮层β－catenin蛋白的表达变化。结果①与对照组相比,D－半乳糖模型组和自然老化组豚鼠下丘β－catenin蛋白表达量下降;与D－半乳糖模型组相比,D －半乳糖＋电针组下丘β－catenin蛋白表达量增加;②D －半乳糖模型和自然老化组豚鼠听皮层β－catenin蛋白表达量下降,D－半乳糖＋电针组其表达量增加。结论β－catenin蛋白可能通过Wnt／β－catenin信号通路,调控细胞生长、分化及凋亡,参与下丘和听皮层的老化过程;电针听宫穴和翳风穴可能通过增加下丘和听皮层β－catenin蛋白表达,经Wnt／β－catenin信号通路延缓豚鼠年龄相关性听力损失的发生。     

Stimulation-dependent gene expression in the central auditory system

Acoustic or electrical stimulation activate specific populations of neurons in specific regions of the central auditory system to prepare for a molecular, structural, and functional remodeling within hours. Among the indicators for the initiation of neuronal remodeling is the expression of immediate early genes (IEGs). The IEG c-fos is one of the first genes to be expressed following sensory-evoked neuronal activity. In order to investigate activity-dependent neuroplasticity in the central auditory system we applied acute unilateral electrical intracochlear stimulation (EIS) in a rat model. By using different stimulation parameters we found that laterality, intensity, and frequency effect different kinds of neurons in different regions. We investigated the ventral and dorsal cochlear nucleus (VCN and DCN), the lateral superior olive (LSO), the central inferior colliculus (CIC), and the medial geniculate body (MGB). In each region a unique dynamic pattern of c-Fos expression was found.     

Activity-dependent plasticity in the adult auditory brainstem

Over the past few years we have studied the plasticity of the adult auditory brainstem in the rat following unilateral changes to the pattern of sensory activation, either by intracochlear electrical stimulation or by deafening. We discovered that modifications to afferent activity induced changes in the molecular composition and cellular morphology throughout the auditory brainstem, including its major centers: the cochlear nucleus complex, the superior olivary complex, and the inferior colliculus. The time window studied ranged from 2 h to over 1 year following induction of changes to afferent activity. The molecular markers employed include the NMDA receptor subunit type 1, the cAMP response element binding protein (CREB), the immediate early gene products c-Fos, c-Jun and Egr-1, the growth and plasticity-associated protein GAP-43 and its mRNA, the calcium binding protein calbindin, the cell adhesion molecule integrin-alpha(1), the microtubule-associated protein MAP-1b, and the neurofilament light chain (NF-L). As a consequence of the specific electrical stimulation of the auditory afferents or the loss of hearing, a cascade of events is triggered that apparently modifies the integrative action and computational abilities of the central auditory system. An attempt is made to relate the diverse phenomena observed to a common molecular signaling network that is suspected to bridge sensory experience to changes in the structure and function of the brain. Eventually, a thorough understanding of these events will be essential for the specific diagnosis of patients, optimal timing for implantation, and suitable parameters for running of a cochlear implant or an auditory brainstem implant in humans. In this report an overview of the results obtained in the past years in our lab is presented, flanked by an introduction into the history of plasticity research and a model proposed for intracellular signal cascades related to activity-dependent plasticity.     

长期注射水杨酸钠对大鼠下丘GAD67和GABAAα1、c-fos表达的影响

目的 通过观察长期注射水杨酸钠对大鼠听性脑干反应(ABR)及下丘GAD67和GABAAα1、c-fos表达的影响,探讨大鼠下丘GAD67、GABAAα1、c-fos表达的改变在水杨酸钠耳毒性中的可能机制。 方法 将24只成年健康Wistar大鼠随机分为2组:水杨酸钠组(肌肉注射10%水杨酸钠175 mg/kg,2次/d,连续28 d)、对照组(每天相同时间注射等量生理盐水,连续28 d)。两组大鼠在处死前进行ABR检测并观察ABR反应阈及波Ⅲ潜伏期的变化,然后将大鼠断头处死并迅速剥离下丘,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印迹(Western blot)方法检测下丘GAD67、GABAAα1、c-fos mRNA及蛋白表达的变化。 结果 ①药物注射28 d后,水杨酸钠组较注射前以及对照组ABR反应阈明显升高,波Ⅲ潜伏期明显延长,差异有统计学意义(P<0.01);②水杨酸钠组GAD67、GABAAα1、c-fos mRNA及其蛋白表达水平较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。 结论 GAD67、GABAAα1、c-fos均不同程度参与了水杨酸钠耳毒性的发生发展过程, c-fos表达的上调则可能与水杨酸钠作用于机体后引起听觉中枢神经活动增强有关。     

Expression of NMDA, AMPA and GABA(A) receptor subunit mRNAs in the rat auditory brainstem. II. Influence of intracochlear electrical stimulation

We investigated the effects of intracochlear electrical stimulation (ICES) on auditory pathways of neonatal rat deafened by daily amikacin injections. Expression of mRNAs encoding ionotropic glutamate receptor subunits such as alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole (AMPA) and N-methyl-D-aspartate (NMDA), and gamma-aminobutyric acid type A (GABA(A)) receptor subunits was assessed by in situ hybridization in the dorsal (DCN) and the ventral cochlear nucleus (VCN) and in the central nucleus of the inferior colliculus (CNIC). After 15 days of daily unilateral ICES, the expressions of NR1, NR2b and NR2c subunits of NMDA receptor, that of GluRA, B, C, D flop isoforms of AMPA receptor and that of some GABA(A) subunits (alpha1, beta1, gamma1, gamma2) were increased bilaterally in the DCN, VCN and the CNIC. These changes last over a week after stimulation for only NR1 and NR2c. These modifications might be related to long lasting synaptic plasticity of brainstem auditory pathways. As far as analogy to deaf children can be made, early electrical stimulation might be of interest to maintain neuronal networks.