人类ERMAP基因在诱导K562细胞向红系和巨噬系细胞分化过程中表达的研究

为了探讨人类ERMAP基因在红细胞分化发育过程中的作用,以Ara-C诱导K562细胞向红系方向分化,以十二氟波酯钠盐(TPA)诱导K562细胞向巨噬系方向分化,用荧光定量PCR检测上述过程中人类ERMAP基因表达量的变化。结果发现:终浓度为2.5×10-6mmol/L/L及1.0×10-6mmol/L/L的Ara-C可诱导K562细胞向红系方向分化,在此过程中人类ERMAP基因的表达量逐渐增加;终浓度为2.0×10-6mmol/L/L及1.0×10-6mmol/L/L的TPA可诱导K562细胞向巨噬系方向分化,在此过程中人类ERMAP基因的表达量无变化。结论:人类ER-MAP基因与红系分化增殖密切相关。     

人类ERMAP-siRNA对Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化过程的影响

为探讨人类ERMAP基因在红细胞分化发育过程中的作用,本研究设计ERMAP—dsDNA,制备ERMAP—shRNA表达质粒,并建立稳定表达ERMAP—shRNA的K562细胞系（即ERMAP—shRNA／K562细胞系）,观察Ara-C诱导ERMAP—shRNA／K562细胞向红细胞系分化过程中,细胞形态、联苯胺染色细胞阳性率和细胞表面标记等的变化,同时以FQ—PCR检测K562细胞人类ERMAP基因表达量的变化。结果发现：经Ara-C诱导72小时,ERMAP—shRNA／K562细胞与对照组比较,体积较大,胞浆量较少,着色大部分呈深蓝色或蓝紫色,部分细胞仍可见1—2个核仁;联苯胺染色阳性率由1．17％增加至2．04％（P〈0．05）,但仍低于Ara—C诱导K562组（P〈0．05）;CD36^-／CD235a^＋细胞比例从8．83％增至11．28％,CD36^＋／CD235a^＋细胞比例从1．23％增至2．64％,CD36^＋／CD235a^-细胞比例从0．59％增至1．47％,均明显低于Ara—C诱导K562细胞组;与此同时,ERMAP—shRNA／K562细胞ERMAP基因的表达量从诱导前的2．52×10^-3缓慢增加至诱导72小时后的4．53×10^-3,明显低于K562细胞组。结论：ER—MAP—shRNA可抑制Ara—C诱导K562细胞向红系分化的过程,这进一步提示人类ERMAP基因与红细胞分化发育过程有关。     

肿瘤相关基因chp2在白血病细胞中表达的研究

为了探讨人类肿瘤相关基因chp2在白血病原代细胞和白血病细胞系中表达的特点，选择24例白血病患者、4种白血病细胞系及10名正常人外周血单个核细胞（PBMNC），用实时定量PCR（RQ—PCR）方法检测chp2基因的表达水平。结果显示，10例正常对照细胞chp2mRNA的表达检出率为80％，阳性的表达量为（0．744±0．682）×10^5cps／μl。白血病原代细胞和白血病细胞系chp2mRNA的表达量较正常对照组明显增高（p〈0．05），原代细胞中的7例急性髓细胞白血病（AML）、6例慢性髓细胞白血病（CML）、7例急性淋巴细胞白血病（ALL）和4例慢性淋巴细胞白血病（CLL）的表达量分别是（11．637±5.588）、（6．122±3．785）、（4．262±2．561）和（3．434±1．974）×10^5cps／μl；白血病细胞系中K562细胞、Jurkat细胞、HL-60细胞和M07e细胞的表达量为（5．243±1.852）、（4．463±1．621）、（4．137±1．837）和（2．578±1．137）×10^6cps/μl，白血病细胞系的表达量高于原代细胞。结论：人类肿瘤相关基因chp2在白血病原代细胞和白血病细胞系中表达水平明显增高，提示其在白血病细胞生长过程中发挥着重要的作用。     

ST1571诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡信号通路的研究

本研究应用基因芯片探讨酪氨酸激酶抑制剂（STI571）对K562细胞生长、增殖的影响，研究STI571诱导细胞凋亡过程中基因表达的变化及STI571诱导K562细胞凋亡的机制。用RD—PCR技术制备基因芯片探针，然后制成飚62细胞表达谱芯片；用相差显微镜观察K562细胞在STI571处理前后的形态变化；用MIT法检测K562细胞的凋亡，用制备的K562细胞表达谱芯片分析基因表达水平。结果表明，在体外培养条件下用1．0μmol／L的STI571处理K562细胞达到一定时间（24小时）后，K562细胞生长明显变缓，出现凋亡细胞的特征。用自制的l（562细胞基因表达谱芯片检测显示，STI571诱导K562细胞凋亡前后的基因表达有差异。杂交检测后发现，经STI571诱导后基因表达下调的基因有9个，表达上调的基因有4个。这些表达变化的基因主要包括细胞周期相关基因、细胞代谢通路相关基因、信号转导和转录调节相关基因及抗凋亡基因。结论：STI571能有效抑制K562细胞生长，诱导K562细胞凋亡；筛选获得的靶基因在K562细胞恶性转化过程中发挥了重要作用，这为药物靶基因的筛选提供了理论基础。     

阿霉素对K562细胞Gfi-1表达的影响及其与相关凋亡基因关系的研究

本研究探讨阿霉素体外作用于K562细胞的细胞效应及癌基因Gfi-1和相关凋亡基因表达变化的机制。用不同浓度的阿霉素作用于K562细胞24小时,然后应用DNA电泳和流式细胞术检测K562细胞凋亡;用RT-PCR、流式细胞术检测Gfi-1、Bcl-2、bax基因和蛋白表达的变化。结果表明：当阿霉素浓度在0、0.5、2.0mg/L作用K562细胞24小时,细胞凋亡增加,可见典型的DNA断裂电泳条带;同时,当ADM浓度自0.5增为2.0mg/L时,Gfi-1表达减少,bax表达增加;Bcl-2表达在ADM0.5-2.0mg/L之间变化不明显,mRNA及蛋白水平均无统计学差异;当阿霉素浓度大于2.0mg/L时,细胞凋亡率并不增加,而是下降,且出现细胞坏死。结论：一定浓度阿霉素能诱导K562细胞凋亡,细胞凋亡率表达的变化与阿霉素浓度呈一定的量效依赖关系,阿霉素诱导K562细胞凋亡可能与抑制Gfi-1基因的表达和激活bax基因的表达有一定的关系。     

干扰素-α2b对慢性髓系白血病抗血管生成作用的体外研究

本研究旨在应用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及K562细胞探讨干扰素-α2b在慢性髓系白血病(CML)中抗血管生成作用。用ELISA法检测K562细胞系培养上清液中VEGF和bFGF水平;应用real-time RT-PCR法检测103、102、10U/ml IFN-α2b作用K562细胞24、36、48小时VEGF、bFGF mRNA的表达;通过MTT法、Transwell室及体外微管形成实验研究K562细胞培养上清液及IFN-α2b对HUVEC增殖、迁移及体外分化的影响。结果表明:K562细胞系表达和分泌VEGF和bFGF,细胞培养上清液能明显促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,其作用随着细胞培养上清液浓度的增加而增强;IFN-α10U/ml作用K562细胞24、36、48小时,VEGF相对表达量为1.64±0.18、1.49±0.14、1.31±0.05,bFGF相对表达量分别为1.53±0.10、1.29±0.15、0.79±0.13(p=0.002),随着药物浓度增高,细胞VEGF、bFGF相对表达量无明显差异。结论:CML存在血管新生,K562细胞分泌和表达促血管新生因子VEGF和bFGF,促进HUVEC的增殖、迁移、体外微管形成,干扰素通过抑制HUVEC的增殖、迁移、微管形成,下调K562细胞VEGF和bFGF mRNA表达,具有一定程度的抗血管新生作用。     

shRNA干扰IER3IP1基因表达对K562细胞增殖和红系分化的影响

目的 探讨靶向干扰IER3IP1基因对K562细胞增殖和红系分化的影响.方法 针对IER3IP1基因设计并构建小发夹状(shRNA)真核表达载体,转染K562细胞后用RT-PCR方法鉴定沉默效果.采用MTT实验、联苯胺染色、光镜和电镜观察、流式细胞术以及RT-PCR,观察抑制IER3IP1基因表达后对K562细胞的影响;采用0.2μmoL/L伊屿替尼诱导K562细胞2 d,观察诱导分化过程中IER3IP1基因表达变化情况.抑制IER3IP1基因表达后对红系分化相关基因Gfi-1B、GPA和γ-globin以及细胞表面GPA蛋白表达的影响.结果 成功构建针对IER3IP1基因的shRNA真核表达载体,转染至K562细胞中,该基因mRNA表达水平明显降低,抑制率达76%(P<0.01).与对照组细胞相比,K562-shRNA-IER3IP1组bcr-abl mRNA表达升高(P<0.05);MTT检测结果显示细胞增殖能力增强(P<0.01);流式细胞术检测结果显示S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少(P<0.05);电镜可见细胞常染色质增加、异染色质减少,内质网部分扩张,囊泡样结构滞留.0.2μmol/L伊马替尼作用48 h后,K562-shRNA-IER3IP1组联苯胺染色阳性率由作用前的(44.7±2.5)%降低至(22.7±1.5)%(P<0.01),且红系分化相关基因Gfi-1B、GPA和γ-globin的mRNA表达水平明显降低,细胞表面GPA蛋白表达水平降低.同时伊马替尼作用过程中IER3IP1基因在作用3 h时表达明显升高,6 h时降低,12～48 h表达水平基本不变.结论 干扰IER3IP1基因表达后,K562细胞增殖加快,红系分化过程受阻,提示该基因可能在K562细胞增殖和向红系分化过程中发挥作用.     

黏附分子CD44表达对白血病细胞黏附、迁移及浸润的影响

目的 探讨黏附分子CD44表达对白血病细胞黏附、迁移、浸润的影响.方法 选择对数生长期的白血病细胞株SHI-1、THP-1、NB4、K562细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测各种白血病细胞株CD44 mRNA和蛋白的相对表达水平,并将各株白血病细胞分为对照组(加入同种同型IgG)和实验组(加入CD44单抗),然后观察白血病细胞与人静脉内皮细胞系ECV304细胞的黏附率;用包被ECV304细胞的Transwell小室培养法观察细胞迁移率;用包被人工基质膜Matrigel的Transwell小室培养法观察白血病细胞穿过人工基质膜的浸润能力.结果 SHI-1、THP-1、NB4细胞均表达CD44 mRNA和蛋白,而K562细胞CD44 mRNA和蛋白表达量少甚至不表达;SHI-1、THP-1 、NB4细胞CD44 mRNA的相对表达水平分别为0.0731±0.0072、0.0827±0.0151、0.1473±0.0365,与K562细胞(0.0002±0.0000)相比,差异均有统计学意义(P值均<0.01).黏附实验结果显示:实验组SHI-1、THP-1、NB4细胞黏附率均较对照组下降(分别为72.78%、64.09%、57.42%),而实验组K562细胞黏附率为106.16%.迁移实验结果显示:对照组SHI-1、THP-1、NB4细胞迁移率分别为55%、29%、25%,实验组细胞迁移率下降(分别为32%、18%、12%),而两组中K562细胞无明显变化(均为2%).浸润实验显示:对照组SHI-1、THP-1、NB4细胞穿过Matrigel的细胞率分别为24%、15%、13%,实验组均有所下降(分别为12%、8%、4%),而两组中K562细胞不能穿过.结论 CD44抗原可能通过改变细胞的黏附、迁移及浸润能力,参与白血病细胞的髓外浸润过程.     

亚硒酸钠对K562/ADR细胞系VEGF表达的影响

为了探讨亚硒酸钠对K562/ADR细胞VEGF表达的影响,分别以5、10μmol/L的亚硒酸钠对培养的K562及K562/ADR细胞进行处理,应用ELISA法检测亚硒酸钠处理前和处理后不同时间的K562及K562/ADR细胞上清液中VEGF含量,用MTT法检测逆转耐药倍数。结果表明：亚硒酸钠可以增加K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性,其逆转耐药的倍数为3.48倍;两种细胞系分泌的VEGF含量随培养时间的延长增加,并且各个时间段的K562/ADR细胞VEGF表达均高于K562细胞（P〈0.05）;5、10μmol/L的亚硒酸钠在72小时内均不能抑制K562细胞VEGF的分泌（P〉0.05）;而作用96小时时K562细胞上清液中VEGF水平虽有下降,但未达统计学意义;5、10μmol/L的亚硒酸钠在48小时内均不能抑制K562/ADR细胞VEGF的分泌（P〉0.05）,10μmol/L的亚硒酸钠在作用72和96小时可以明显抑制VEGF的分泌（P〈0.001）,5μmol/L的亚硒酸钠在作用96小时可以抑制VEGF的分泌（P〈0.001）。结论：VEGF可能与白血病多药耐药有关,而亚硒酸钠则能抑制白血病细胞分泌VEGF。     

高三尖杉酯碱诱导的白血病耐药细胞基因表达谱的变化

目的 探讨高三尖杉酯碱(HHT)诱导的人白血病细胞耐药相关分子.方法 在前期建立的HHT诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT的基础上,采用基因芯片技术比较K562/HHT细胞、其亲本K562细胞以及用耐药逆转剂米非司酮(RU486)作用后的K562/HHT(K562/HHT/RU486)细胞三者基因表达谱的差异,选择在这三种细胞中呈动态变化的骨髓细胞X染色体上酪氨酸激酶(BMX)基因用RT-PCR和Western blot法在转录和翻译水平进行验证,进而转染BMX基因到K562和K562/HHT细胞,观察BMX过表达时这两种细胞内柔红霉素(DNR)含量的变化,确定BMX是否在K562/HHT细胞耐药形成中发挥作用.结果 耐药细胞K562/HHT与其亲本K562细胞相比,共有117个基因表达有显著差异,其中57个基因表达明显上调,60个基因表达明显下调,耐药细胞K562/HHT中多药耐药基因mdr1表达明显上调;K562/HHT/RU486细胞与K562/HHT细胞相比,13个基因表达明显上调,37个基因表达明显下调.这些差异表达的基因涉及耐药、细胞信号传导、细胞分化、细胞增殖、转录调节以及离子转运等.基因NM-001721(BMX)、NM-031459(SESN2)、NM-033642(FGF13)和AL 049309(SFRS12)在两组芯片中的表达均有显著差异.其中BMX基因在K562/HHT细胞中的表达与K562细胞相比,明显上调,在K562/HHT/RU486细胞则较K562/HHT细胞减低.进一步用RT-PCR和Western blot法检测得到了相同的结果.RT-PCR和Western blot证实BMX质粒转染的K562及K562/HHT细胞BMX表达均上调,流式细胞术检测到K562及K562/HHT细胞内DNR含量荧光强度分别为79.28±4.04和29.84±2.67,均较转染前荧光强度158.52±8.08和58.58±6.53显著减低.结论 BMX在高三尖杉酯碱诱导的人白血病多药耐药细胞株K562/HHT耐药性产生中发挥作用.     

RT-PCR检测白血病细胞VEGF异构体及其受体基因

目的 建立逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测白血病细胞血管内皮生长因子(VEGF)异构体及其受体基因的方法。方法 用TRIZOL试剂提取体外培养的细胞系总RNA,M—MLV逆转录酶生成模板cDNA,PCR扩增VEGF异构体基因以及VEGF受体Flt-1基因,扩增产物用含溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳后,直接分析电泳结果。结果 白血病细胞(K562和HL-60)出现3条VEGF条带(516bp、588bp、648bp),分别代表VEGF3种异构体(VEGF121,VEGF145,VEGF165)的基因扩增产物,而人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)无VEGF条带出现;此外,2种白血病细胞都可以测出VEGF的Flt-1受体基因,与Flt-1阳性细胞ECV304相似。结论 RT-PCR可用于白血病细胞VEGF多种异构体及其Flt-1受体基因的检测。     

WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究

本研究探讨WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性,为开展基于WT1基因调控的白血病基因治疗奠定基础。以EGFP做报告基因,构建含有WT1基因启动子和增强子的重组表达载体;利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染13个细胞株,包括WT1基因高表达的白血病细胞株(K562、NB4、THP-1、SHI-1),WT1基因低表达的白血病细胞株(U937和Jurkat);非造血细胞株中WT1基因高表达的MCF-7、T47D、293株细胞和WT1基因低表达的ECV304、SMMC7721、HT-29、SHG44细胞株;利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和(或)增强子的转录活性。结果表明:通过基因重组技术构建了含有WT1基因启动子的表达载体pEWP,以及含有WT1基因启动子和增强子的表达载体pEWPA。就启动子的转录活性而言,在非白血病细胞株中,ECV304细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体(pEGFP-1)的16.54±2.45倍,明显高于白血病细胞株(p<0.05);MCF-7和SHG44细胞次之,分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍,HT-29细胞表达最低,仅为0.99±0.02倍。在人类血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体pEGFP-1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI-1细胞株(p<0.05)。后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍。pEWPA可以使HT-29、SHI-1和K562细胞中WT1基因启动子的转录活性增强,分别增强到4.81、3.06和1.01倍。结论:WT1基因启动子的转录活性与细胞内在WT1基因的表达水平不相关,增强子增强部分细胞株中WT1基因启动子的转录活性,但不具有造血组织特异性。     

mdr1和GSTπ基因缄默逆转K562/A02细胞多药耐药性的研究

目的研究短发夹状小分子干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)对白血病多药耐药细胞株K562/A02mdr1和谷胱甘肽S-转移酶(GST)π基因的表达和功能的影响。方法根据mdr1mRNA第79~99位和GSTπmRNA第308~327位核苷酸为作用靶点,合成针对靶区域序列的shRNA,克隆入pSilencer2.1-U6neo,克隆产物为pSilence-mdr1和pSilence-GSTπ,转染K562/A02细胞株。用实时荧光定量PCR检测K562/A02细胞mdr1和GSTπmRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞半数抑制浓度(IC50)。结果经pSilence-mdr1转染后的K562/A02细胞mdr1mRNA表达量下降了71.5%,从(2.80±1.65)×108拷贝/μg RNA下降至(3.90±2.37)×107拷贝/μg RNA(P<0.01);同时pSilence-GSTπ作用后,K562/A02细胞GSTπmRNA表达量较对照组下降了39.8%,从(2.30±1.14)×105拷贝/μg RNA下降至(5.40±2.45)×104拷贝/μg RNA(P<0.01);空载体转染后阿霉素的耐药指数为23,pSilence-mdr1转染后为8,pSilence-GSTπ转染后为10,差异有统计学意义(P<0.01)。结论shRNA可有效逆转K562/A02细胞mdr1和GSTπ的多药耐药性。     

K562和SiHA细胞株经γ-射线照射后细胞周期阻滞与ATM表达量的关系研究

共济失调毛细血管扩张症（ataxia telangiectasis,A-T）是由ATM（ataxia telangiectasis mutant）基因突变所致,其突出特点是对放射线敏感.为探讨K562和SiHA两种肿瘤细胞株ATM表达量与γ-射线照射后细胞周期阻滞即自我保护功能之间的关系,应用半定量RT-PCR测量它们的ATM mRNA表达,同时以6、10和15 Gy 60Co γ射线分别照射细胞,并于照射后6、12、24、48及60小时观察细胞周期阻滞现象和凋亡率的变化.结果显示,K562细胞株ATM RNA相对表达量为0.04,而在SiHA细胞株为0.80,SiHA的ATM RNA表达量约为K562的20倍.结论：照射后K562和SiHA细胞株均表现G2/M期阻滞,K562细胞周期阻滞即自我保护机制明显比SiHA差.     

siRNA对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制

为了探索CML的治疗新思路研究了siRNA(small interfering RNA)对K562细胞株bcr-abl融合基因表达的抑制作用。制备特异性对应bcr-abl融合基因的siRNA，转染K562细胞株，采用RT-PCR法测定bcr-abl融合基因mRNA的表达。结果表明：siRNA对bcr-abl基因表达的抑制作用随浓度的增加而增强，0.2ug siRNA能使bcr-abl融合基因mRNA的表达在24和48小时分别降低至对照组的19.9％和26.6％，但72小时时恢复到原水平，同时转染siRNA后细胞生长受到抑制。结论：siRNA可以有效的抑制K562细胞株中bcr-abl融合基因的表达。     

活化Chk1引起的G2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中的机制探讨

本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响,探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制.以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02(耐阿霉素)为研究对象,与阿霉素共孵育后,用流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平,Western blot检测转染前后Chk1磷酸化水平;靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后,用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况.结果表明阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞(36.99±1.28)%; Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异; Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79 ± 0.56,在K562细胞为0.27 ± 1.47,其差异有统计学意义.转染Chk1shRNA后,两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降.转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍.结论 Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导人血管内皮细胞凋亡的影响

目的研究尼莫地平对不同浓度氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡的影响。方法在人脐静脉内皮细胞株ECV304培养基中加入不同浓度氧化低密度脂蛋白和尼莫地平（1.2μg/ml）,作用6-24 h。透射电镜观察内皮细胞ECV304的凋亡情况;流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡率;用激光共聚焦显微镜检测钙离子浓度。结果不同浓度氧化低密度脂蛋白能明显诱导培养的内皮细胞发生凋亡,尼莫地平可显著降低氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡率（P〈0.01）。结论尼莫地平对氧化低密度脂蛋白诱导的人血管内皮细胞凋亡具有保护作用。