维生素E经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路抑制oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤

【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。     

Study of the ROS generation and expression of NADPH oxidase in the retina pigment epithelial cell in aged rats

目的 衰老对大鼠视网膜色素上皮细胞(RPE)活性氧物质(ROS)生成及对尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶表达的影响.方法 实验分为青年组(3月龄)和老年组(16月龄)大鼠,二氢乙啡啶(DHE)染色检测RPE ROS的生成,HE染色观察RPE形态学变化,免疫组化检测视网膜及RPE蛋白激酶Cα(PKCα)、P47phox和NADPH氧化酶2(NOX2)的表达.结果 与青年组大鼠比较,老年组大鼠RPE ROS的生成明显增加.HE染色结果显示,青年组和老年组大鼠视网膜及RPE形态学未见明显差异.免疫组化结果表明,老年组大鼠视网膜及RPE PKCα、P47phox和NOX2的表达明显增加.结论 老年大鼠RPE ROS生成和NADPH氧化酶表达明显增加,NADPH氧化酶介导的ROS可能是年龄相关性视网膜病变的机制之一.     

衰老对大鼠视网膜色素上皮细胞ROS生成和NADPH氧化酶表达的影响

目的衰老对大鼠视网膜色素上皮细胞(RPE)活性氧物质(ROS)生成及对尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶表达的影响。方法实验分为青年组(3月龄)和老年组(16月龄)大鼠,二氢乙啡啶(DHE)染色检测RPE ROS的生成,HE染色观察RPE形态学变化,免疫组化检测视网膜及RPE蛋白激酶Cα(PKCα)、P47phox和NADPH氧化酶2(NOX2)的表达。结果与青年组大鼠比较,老年组大鼠RPE ROS的生成明显增加。HE染色结果显示,青年组和老年组大鼠视网膜及RPE形态学未见明显差异。免疫组化结果表明,老年组大鼠视网膜及RPE PKCα、P47phox和NOX2的表达明显增加。结论老年大鼠RPEROS生成和NADPH氧化酶表达明显增加,NADPH氧化酶介导的ROS可能是年龄相关性视网膜病变的机制之一。     

血管外膜损伤后血管组织氧化应激与内膜病变

目的:探讨NADPH氧化酶相关的氧化应激在外膜损伤致内膜病变中的作用.方法:选用纯种新西兰大白兔,采用胶原酶消化 钝性机械分离的方法建立血管外膜损伤动物模型,采用H-E染色观察外膜损伤血管的形态变化,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测外膜损伤后血管组织NADPH氧化酶亚单位p22phox、抗氧化酶HO-1的mRNA表达,荧光探针检测外膜损伤后血管组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成.结果:外膜损伤可致内膜增生性病变;外膜损伤导致p22phox/HO-1 mRNA表达明显升高,血管组织ROS产量增加.结论:血管外膜参与了内膜病变形成的病理过程;NADPH氧化酶活性升高导致的氧化应激可能是外膜损伤致内膜病变的机制之一.     

高糖对大鼠系膜细胞NADPH氧化酶的影响

目的 探讨高糖对大鼠系膜细胞NADPH氧化酶表达及活性的影响.方法 高糖体外培养大鼠系膜细胞,RT-PCR技术检测系膜细胞内NADPH氧化酶亚基p22phox mRNA的表达,流式细胞术检测超氧离子(.O2-)和过氧化氢(H2O2)反映NADPH氧化酶活性.结果 高糖(10mM)培养3天及5天组,p22phox mRNA表达较正常组和培养1天组升高(P<0.05).随着葡萄糖浓度升高和作用时间的延长随着葡萄糖浓度升高和作用时间的延长,.O2-和H2O2的表达增多(P<0.05).结论 高糖使系膜细胞NADPH氧化酶表达增多、活性增强.     

RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl-2蛋白的表达

目的 探讨遗传性视网膜色素变性中感光细胞凋亡及其可能的基因调控机制。方法 对RCS大鼠及对照SD大鼠的视网膜组织结构进行光镜观察、细胞凋亡及Bcl-2蛋白免疫组织化学检测。结果 RCS大鼠生后15d视网膜的感光细胞视杆层及外节增厚，视杆层的厚度在25d达到高峰。感光细胞的数目在25d时有所下降，到出生后60d，仅少许感光细胞存留。出生后25～40d，RCS大鼠视网膜可见外核层TUNEL染色阳性的感光细胞，阳性细胞数35d最多。30-40d内核层和节细胞层可见Bcl-2蛋白免疫组化阳性表达细胞，35d时内核层阳性表达细胞数最多。外核层一直未见明显Bcl-2蛋白阳性表达细胞。结论 RCS大鼠视网膜变性过程中。感光细胞发生了凋亡。Bcl-2原癌基因可能不参与感光细胞的保护机制。     

N-Arg对RCS大鼠遗传性视网膜变性视细胞凋亡的影响

目的:研究一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂对遗传性视网膜变性视细胞凋亡的影响.方法:测定出生后不同鼠龄RCS(Royal College of Surgeons)大鼠视网膜的诱生型一氧化氮合酶(inducible NOS,iNOS)活性;出生后第17天RCS大鼠玻璃体腔内注射NOS抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸(Nω-nitro-L-arginine,N-Arg),并于出生后第22、27和32天重复注射,于出生后第38天以TUNEL法检测视网膜视细胞凋亡.结果:RCS大鼠出生后第25天,视网膜iNOS活性达高峰;注射N-Arg后,视网膜TUNEL阳性视细胞核相对面积显著降低,外核层明显增厚,杆锥层显著变薄.结论:一氧化氮合酶抑制剂对遗传性视网膜变性具有潜在的临床治疗价值.     

NADPH氧化酶在TGF-β1诱导大鼠小管上皮细胞表达炎症因子中的作用

【目的】观察转化生长因子β1（TGF—β1）对大鼠肾小管上皮细胞单核细胞趋化因子-1（MCP-1）及白细胞介素-6（IL-6）表达的影响，并探讨NADPH氧化酶在其中的作用。【方法】以大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）为研究对象，采用TGF—β1（10ng／mL）刺激0h，2h，4h，8h，12h，24h分别收取RNA；刺激0h，12h，24h，48h，72h分别收取细胞上清液；部分实验中培养的细胞在刺激前用NADPH氧化酶抑制剂DPI（0．1，1，5，10μmol／L）预处理1h，然后含10ng的TGF—β1无血清DMEM／F12培养液分别培养12h（收集RNA）和24h（收集细胞上清液）。所有实验重复3次。细胞内活性氧（ROS）的产生采用激光共聚焦显微镜观察。NADPH氧化酶p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox亚单位以及MCP-1和IL-6mRNA的表达采用RT—PCR检测。细胞上清液中MCP-1的含量采用ELISA检测。【结果】TGF—β1可显著上调NADPH氧化酶p67phox亚单位mRNA的表达，8h为对照的2．43倍（P〈0．01），24h达3．59倍（P〈0．01）。但对p22phox、gp91phox和p47phox亚单位mRNA表达无显著影响。TGF—β1显著增加细胞内ROS产生，DPI预处理后ROS产生较TGF—β1刺激组降低了43．69％（P〈0．05）。TGF—β1可显著上调MCP-1和IL-6mRNA及蛋白的表达。DPI预处理可明显逆转TGF—β1诱导的MCP-1和IL-6的上调表达。【结论】TGF—β1可促使细胞ROS产生增加。TGF—β1可能通过NADPH氧化酶依赖的ROS介导了大鼠肾小管上皮细胞MCP-1及IL-6的上调表达。     

NADPH氧化酶在TGF-β1诱导大鼠小管上皮细胞 表达炎症因子中的作用

 【目的】 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠肾小管上皮细胞单核细胞趋化因子-1(MCP-1)及白细胞介素-6 (IL-6) 表达的影响,并探讨NADPH氧化酶在其中的作用?【方法】 以大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)为研究对象,采用TGF-β1(10 ng/mL)刺激0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h分别收取RNA;刺激0 h, 12 h, 24 h,48 h, 72 h分别收取细胞上清液;部分实验中培养的细胞在刺激前用NADPH氧化酶抑制剂DPI (0.1, 1, 5, 10 μmol/L)预处理1 h, 然后含10 ng的TGF-β1无血清DMEM/F12培养液分别培养12 h (收集RNA)和24 h (收集细胞上清液)?所有实验重复3次?细胞内活性氧(ROS)的产生采用激光共聚焦显微镜观察?NADPH氧化酶p22phox?gp91phox?p47phox和 p67phox亚单位以及MCP-1和IL-6 mRNA的表达采用RT-PCR检测?细胞上清液中MCP-1的含量采用ELISA检测?【结果】 TGF-β1可显著上调NADPH氧化酶p67phox亚单位mRNA的表达, 8 h为对照的2.43倍 (P < 0.01),24 h达3.59倍(P < 0.01)?但对p22phox?gp91phox和p47phox亚单位mRNA表达无显著影响?TGF-β1可显著增加细胞内ROS产生, DPI预处理后ROS产生较TGF-β1刺激组降低了43.69% (P < 0.05)? TGF-β1可显著上调MCP-1和IL-6 mRNA及蛋白的表达?DPI预处理可明显逆转TGF-β1诱导的MCP-1和IL-6的上调表达?【结论】 TGF-β1可促使细胞ROS产生增加?TGF-β1可能通过NADPH氧化酶依赖的ROS介导了大鼠肾小管上皮细胞MCP-1及IL-6的上调表达?     

RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl-2蛋白表达的关系

①目的 探讨遗传性视网膜色素变性中感光细胞凋亡及其可能的基因调控机制。②方法 对：RCS大鼠及对照SD大鼠的视网膜组织结构进行光镜观察、细胞凋亡及Bcl-2蛋白免疫组织化学检测。③结果 RCS大鼠生后15d视网膜的感光细胞视杆层及外节增厚，视杆层的厚度在25d达到高峰。感光细胞的数目在25d时有所下降，到出生后60d，仅少许感光细胞存留。出生后25～40d，RCS大鼠视网膜可见外核层TUNEL，染色阳性的感光细胞，阳性细胞数35d最多。30～40d内核层和节细胞层可见Bcl-2蛋白免疫组化阳性表达，35d时内核层阳性表达细胞数最多，外核层一直未见明显Bcl-2蛋白阳性表达。④结论 RCS大鼠视网膜变性过程中，感光细胞发生了凋亡。Bcl-2原癌基因可能不参与感光细胞的保护机制。     

延边地区朝鲜族糖尿病肾病患者NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性的相关性研究

目的:研究延边地区朝鲜族糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者NADPH氧化酶p22phox亚基242位点基因多态性分布,探讨延边地区朝鲜族DN患者该基因多态性与DN发病相关情况。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术对延边地区人群中186例朝鲜族DN患者及139名朝鲜族正常对照组者NADPH氧化酶p22phox亚基242位点进行基因型分析,并将住院治疗的186例朝鲜族DN患者分为男性和女性两组,分析两者基因型频率、等位基因频率的差异。结果:①NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性在朝鲜族正常对照组和朝鲜族DN患者中的分布差异无统计学意义(χ2=1.854,P>0.05);②在男性和女性DN的患者中,NADPH氧化酶p22phox亚基242位点纯合子CC基因频率与杂合子CT及纯合子TT基因频率相比,差异有统计学意义(χ2=5.278,P<0.05);结论:①NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与延边朝鲜族DN患者的发病无关;②CC纯合子基因可能是男性朝鲜族DN患者的易感基因。     

ROS-related enzyme expressions in endothelial cells regulated by tea polyphenols

Objective Elevation of reactive oxygen species (ROS), especially the level of superoxide is a key event in many forms of cardiovascular diseases. To study the mechanism of tea polyphenols against cardiovascular diseases, we observed the expressions of ROS-related enzymes in endothelial cells. Methods Tea polyphenols were co-incubated with bovine carotid artery endothelial cells (BCAECs) in vitro and intracellular NADPH oxidase subunits p22phox and p67phox, SOD-1, and catalase protein were detected using Western blot method. Results Tea polyphenols of 0.4 ug/mL and 4.0 ug/mL (from either green tea or black tea) down-regulated NADPH oxidase p22phox and p67phox expressions in a dose-negative manner (P<0.05), and up-regulated the expressions of catalase (P<0.05). Conclusions Tea polyphenols regulate the enzymes involved in ROS production and elimination in endothelial cells, and may be beneficial to the prevention of endothelial cell dysfunction and the development of cardiovascular diseases.     

氧化应激在D5多巴胺受体基因敲除小鼠血压升高中的作用研究

目的探讨还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶在D5受体基因敲除（D5-/-）小鼠血压升高发生机理中的作用.方法利用第六代D5-/-小鼠和其对照（D5＋/＋）小鼠,检测其肾脏NADPH氧化酶的活性和表达;利用D5受体基因转染的HEK-293细胞作为研究对象,刺激D5受体,研究D5受体对超氧阴离子（O2^-）和过氧化氢（H2O2）的影响.结果 D5-/-小鼠的血压、肾脏NADPH氧化酶的活性和p47^phox蛋白的表达均明显高于D5＋/＋小鼠.多巴胺D5受体激动剂Fenoldopam可降低D5转染HEK-293细胞的O2^-和H2O2的产量.结论氧化应激和NADPH氧化酶活性增强参与了D5-/-小鼠血压升高的发生过程,多巴胺D5受体具有抗氧化应激的功能.     

P22^phox基因多态性与冠心病的关系研究进展

活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）在心血管病发病中的作用已为许多研究证实，目前认为烟酰胺脱氢酶／烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ）氧化酶是血管系统超氧化物的主要来源。而细胞色素ｂ　　　　２４５（Ｐ２２ｐｈｏｘ）作为ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ氧化酶的一个亚单位，在传递电子及产生超氧阴离子方面起重要作用。因此，Ｐ２２ｐｈｏｘ基因多态性与冠心病（ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＨＤ）危险之间的关系越来越受到重视。弄清他们之间的关系有利于阐明冠心病的遗传机制，发现新的遗传标记，为冠心病的预防和治疗提供理论基础。     

P22phox基因多态性与冠心病的关系研究进展

活性氧(reactive oxygen species,ROS)在心血管病发病中的作用已为许多研究证实,目前认为烟酰胺脱氢酶/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADH/NADPH)氧化酶是血管系统超氧化物的主要来源.而细胞色素b245(P22phox)作为NADH/NADPH氧化酶的一个亚单位,在传递电子及产生超氧阴离子方面起重要作用.因此,P22phox基因多态性与冠心病(coronary heart disease,CHD)危险之间的关系越来越受到重视.弄清他们之间的关系有利于阐明冠心病的遗传机制,发现新的遗传标记,为冠心病的预防和治疗提供理论基础.     

Met-RANTES 在 rd 小鼠遗传性视网膜变性中的作用

目的：研究CC趋化因子拮抗剂Met-RANTES对rd小鼠视网膜外核层形态的影响,探讨其在rd小鼠遗传性视网膜变性中的潜在治疗作用。方法以出生后7drd小鼠作为研究对象,随机分为5组,分别给予腹腔注射Met-RANTES、PBS和玻璃体腔注射不同浓度Met-RANTES、PBS,直到rd小鼠出生后14d,过量麻醉法处死后摘取眼球制作冰冻切片,HE染色后观察测量视网膜后极部外核层厚度。结果腹腔注射met-RANTES、玻璃体腔注射0．7μlMet-RANTESrd小鼠与对照小鼠视网膜外核层细胞层数无明显变化（P＞0．05）。玻璃体腔注射1．0μlMet-RANTES和1．5μlMet-RANTES眼球视网膜外核层比对照眼球视网膜外核层厚,有统计学差异（P＜0．05）。结论CC趋化因子拮抗剂Met-RANTES对rd小鼠遗传性视网膜变性可能存有潜在治疗作用。     

筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经NADPH 氧化酶p22-phox亚基表达的影响

目的观察中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经NADPH氧化酶p22-phox亚基表达的影响。方法将STZ诱导的糖尿病大鼠随机分为模型组,维生素C组,筋脉通小、中、大剂量组,并设立正常对照组,连续灌胃16周。检测各组治疗前及治疗后4、8、12、16周的体重、血糖;测定第16周时大鼠机械痛阈值;采用免疫组化法测定大鼠坐骨神经NADPH氧化酶p22-phox亚基的表达,并进行半定量分析。结果与正常组相比,各组糖尿病大鼠体重均显著下降（P〈0．01）,血糖均明显升高（P〈0．01）;与模型组比较,各治疗组大鼠体重及血糖在各时间点均无显著差异（P〉0．05）。与正常组相比,模型组、Vc组、筋脉通小、大剂量组机械痛阈值显著降低（P〈0．01）;各治疗组机械痛阈值较模型组均明最升高（P〈0．01）;与VC组比较,筋脉通中剂量组机械痛阈值显著升高（P〈0．01）。与正常组相比,模型组及各治疗组p22亚基的IOD值明显升高（P〈0．05,P〈0．01）;各治疗组p22哑基的IOD值较模型组均显著降低（P〈0．01）;与VC组比较,筋脉通中、大剂量组p22亚基IOD值显著降低（P〈0．01,P〈0．05）。结论筋脉通能显著降低大鼠坐骨神经NADPH氧化酶p22-phox亚基的表达。