吗啡预处理诱导小鼠离体海马脑片氧糖剥夺耐受中PKCδ的作用

 目的 探讨吗啡预处理诱导小鼠离体海马脑片氧糖剥夺耐受形成的机制。 方法 离体小鼠海马脑片氧糖剥夺(OGD)模拟脑缺血再灌注损伤模型,以孵育液乳酸脱氢酶(LDH)漏出率及脑片细胞存活率为指标,探讨吗啡3?mol/L预处理对不同程度OGD损伤小鼠海马脑片神经元的保护作用,用Western blot检测PKCδ表达。结果 吗啡预处理明显提高OGD5,10及20min脑片细胞存活率,使孵育液LDH漏出减少(P<0.05)。OGD后即刻和再灌注2h后,缺糖缺氧组PKC?膜相关成分蛋白表达明显增高,同时胞质部分蛋白表达明显减少(P<0.05),吗啡预处理对PKC?膜转位变化无明显影响。结论 吗啡预处理减轻小鼠离体海马脑片20min以内氧糖剥夺损伤,其机制可能与PKC?的膜转位激活无关。     

紫草素通过PI3K/Akt通路抑制氧糖剥夺诱导的大鼠原代皮层神经元凋亡

目的:探讨紫草素对氧糖剥夺(OGD)损伤模型中大鼠原代皮层神经元的作用及机制。方法:用不同浓度(0. 02、0. 2、2和20μmol/L)紫草素对大鼠原代皮层神经元经进行预处理,再经OGD损伤处理,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法和荧光素二乙酸酯/碘化丙啶(FDA/PI)双染法分别检测神经元活性和凋亡情况,选择最适紫草素浓度。然后,在加入紫草素之前提前加入LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂,1μmol/L),用Wesern blot法检测神经元p-Akt(Ser473)水平变化,用LDH法和FDA/PI双染法检测神经元活性和凋亡率变化。结果:0. 2、2及20μmol/L的紫草素可显著提高神经元存活率(P 0. 05),同时还可使神经元内p-Akt(Ser473)水平显著升高(P 0. 05); LY294002可显著阻断紫草素对神经元p-Akt(Ser473)水平和凋亡率的影响(P 0. 05)。结论:紫草素可通过激活PI3K/Akt通路来减少OGD诱导的大鼠原代皮层神经元凋亡。     

Npas4在小鼠原代神经元体外氧糖剥夺/复氧损伤中的保护作用及其可能机制

目的:探讨神经元PAS结构域蛋白4(Npas4)在小鼠原代神经元体外氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤中的作用及其可能机制。方法:建立小鼠原代培养的皮层神经元OGD/R损伤模型,检测OGD/R损伤后Npas4及突触后膜骨架蛋白Homer1a的mRNA和蛋白表达水平;实验分为对照组、OGD/R组、无关序列(scramble)+OGD/R组和Npas4短发夹RNA(Npas4-shRNA)+OGD/R组,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞的损伤程度,采用Western blot法检测各组细胞Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3及Homer1a的蛋白表达水平。结果:与对照组比较,OGD/R损伤早期Npas4及Homer1a的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P0.05);转染Npas4-shRNA可显著逆转OGD/R引起的Npas4蛋白水平上调;与scramble+OGD/R组相比,下调Npas4进一步加重OGD/R所致神经元活力降低、LDH释放及细胞凋亡(P0.05),且神经保护分子Homer1a的蛋白表达水平也显著降低(P0.05)。结论:Npas4可减轻小鼠原代培养的皮层神经元OGD/R损伤,且可能是通过上调神经保护分子Homer1a的表达发挥部分保护作用。     

细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤

目的 在离体细胞水平,探讨氧-糖剥夺(OGD)致原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤过程中,细胞自噬的变化情况和可能作用.方法 出生24h内C57BL/6J乳鼠脑皮质神经元原代培养7d后,分为常氧(Nor.)、15、30、60、90和120 min OGD后24h复糖复氧等6组,每组n=6;免疫印迹(Western blot)法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值;借助MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,检测神经元的损伤;用细胞自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(BafA1 100 nmol/L)抑制自噬后,观察神经元的损伤.结果 与对照组相比,随OGD时间的延长,自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,30 min达到峰值,之后略有回降(P＜0.05);在OGD处理30和60 min致使神经元显著损伤的基础上,细胞自噬抑制剂BafA1可明显加重60 min OGD处理神经元的损伤和提高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P＜0.05).结论 OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生,且细胞自噬可缓解OGD处理皮质神经元的缺血损伤.     

缺血性脑卒中小鼠脑和血清中IL-17A的变化及其对缺血神经元的影响

目的观察白介素-17A(IL-17A)在小鼠缺血性脑卒中血清和脑脊液的变化。在离体氧糖剥夺(OGD)模型和基因敲除小鼠中,进一步探讨IL-17A在神经元缺血损伤中可能的作用及其损伤途径。方法建立小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)和脑皮层原代神经元氧糖剥夺(OGD)模型,用酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测6及12 h和1、3及7 d的血清(n=7)、脑脊液和12 h梗死区周围皮层(n=5)IL-17A的含量,经5、10、100和500 ng/m L重组IL-17A(r IL-17A)处理后的野生小鼠(n=8)与未经r IL-17A处理的基因敲除小鼠原代神经元进行OGD(n=5),用MTS比色法和蛋白印迹方法检测其对缺血神经元的影响。结果 MCAO 1 h再灌12 h,梗死区周围脑皮层匀浆IL-17A升高(P0.001),脑脊液中IL-17A在12 h达到高峰(P0.05);MCAO 1 h再灌1 d,血清IL-17A开始升高,再灌3 d达到高峰(P0.001);r IL-17A对常氧下神经元的存活率无明显影响,但其可呈剂量依赖性明显加重OGD损伤后神经元的存活率(P0.05);OGD处理野生型(IL-17A+/+)小鼠脑皮层原代神经元,Beclin 1蛋白表达水平和Cl/pro-caspase 3的比值明显升高,缺乏IL-17A可以逆转OGD的作用(P0.05)。结论缺血性脑卒中小鼠的血清和脑脊液中IL-17A呈现不同的变化规律,IL-17A可能通过神经元的自噬和凋亡途径加重神经元缺血损伤。     

siRNA抑制PirB表达对氧糖剥夺神经元的保护作用研究

目的:探讨配对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B,Pir B)在神经元氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)后加重神经元损伤及其可能的分子机制。方法:培养SD原代大鼠皮层神经元,利用pirb RNAi慢病毒载体干扰Pir B RNA表达,进行OGD 1 h,OGD后24 h进行Western Blot分别检测Bcl2和Bax蛋白的表达情况,并检测线粒体和胞浆Cyt c的含量;应用透射电镜观察神经元的超微结构改变。结果:OGD后神经元内Bcl2的表达明显下调,Bax表达却显著上调(P 0. 05)。但是OGD+pirb RNAi组Bcl2的表达明显增加,而Bax的表达显著减少(P 0. 05)。OGD后24 h,Cyt c从线粒体漏出显著增加,而OGD+pirb RNAi组Cyt c漏出显著减少(P 0. 05)。透射电镜结果显示:OGD后神经元呈现不同程度的细胞核固缩现象,线粒体明显肿大、嵴断裂、基粒减少。而OGD+pirb RNAi组神经元的这些超微结构改变显著减轻。结论:Pir B可能通过调节Bcl2和Bax的表达,影响线粒体Cyt c的释放,加重神经元损伤,siRNA能显著抑制Pir B表达,对OGD后神经元的损伤具有保护作用。     

催产素减轻新生大鼠海马神经元缺氧缺血性损伤

目的:探讨催产素(oxytocin)对新生大鼠缺氧缺血性损伤后海马CA1区神经元的作用及机制。方法:采用氧糖剥夺(OGD)制备体外缺氧缺血模型,取8只7~10日龄新生大鼠的急性分离脑片(6~8片/只)随机分为4组,即对照组、OGD 20 min组、OGD 40 min组和OGD+oxytocin组,进行TO-PRO-3染色实验观察催产素对神经元的作用。另取20只新生大鼠脑片随机分为4组,分别是OGD组、OGD+oxytocin组、OGD+d VOT(催产素受体阻断剂)+oxytocin组和OGD+bicuculline(GABAA受体阻断剂)+oxytocin组,用全细胞膜片钳记录不同药物作用下海马神经元缺氧去极化的出现时间。结果:TO-PRO-3染色结果显示海马CA1区神经元死亡数量随着氧糖剥夺时间延长而增加,催产素能显著减少OGD所致的死亡神经元数目(P0.05)。全细胞膜片钳记录结果显示,催产素可使缺氧去极化时间显著延长;d VOT及bicuculline可以消除这种效应。结论:催产素能减轻新生大鼠海马CA1区神经元缺氧缺血性损伤,其机制可能是通过结合催产素受体,增强抑制性神经传递,从而产生神经保护作用。     

马桑内酯对大鼠海马神经元细胞内游离钙离子浓度的影响

以荧光探针Fluo-3/AM为胞浆内游离钙特异性指示剂,通过激光扫描共聚焦显微镜动态监测急性分离SD大鼠(出生后7～14 d)海马神经元细胞内游离钙离子浓度([Ca2 ]i)的变化情况,以了解钙离子及钙通道在癫痫发病中的作用,探讨马桑内酯(coriaria lactone, CL)调节神经细胞内钙稳态的机理.实验发现,CL能使急性分离大鼠海马神经元[Ca2 ]i增加;nifedipine和低浓度NiCl2虽可延迟,但不能完全阻断这种作用.除促使电压依赖的T-、L-型钙离子通道开放外,CL尚可通过其他途径增加海马神经元内[Ca2 ]i,改变细胞兴奋性而致痫.     

左旋丁基苯酞抑制氧糖剥夺／复氧所致原代培养小鼠脑胶质细胞内NF—KB和IKB-α蛋白表达

目的观察左旋丁基苯酞（1-NBP）对原代培养小鼠脑胶质细胞氧糖剥夺／复氧（OGD／R）后NF-KB、IKB-d蛋白表达的影响。方法体外培养小鼠脑胶质细胞，建立细胞OGD／R损伤模型。将胶质细胞分为5组：正常对照（NC）组、OGD24h／R24h组、1-NBP20、100及500μmol／L组。Western-blot检测各组细胞核蛋白中NF-KB蛋白表达和胞质蛋白中IKB-α蛋白降解情况。结果OGD24h／R24h组NF-KB蛋白表达较NC组明显增加（P〈0．01）；1-NBP100和500μmol／L组NF-KB蛋白表达较OGD24h／R24h组明显下降（P〈0．01）。OGD24h／R24h组IKB-α蛋白降解比NC组增多（P〈0．01）；1-NBP500μmol／L组IKB-α蛋白降解较OGD24h／R24h组明显减少（P〈0．05）。结论1-NBP能抑制脑胶质细胞OGD／R后炎症反应，表现为减少IKB-α蛋白降解，抑制NF-KB活化。     

经典型蛋白激酶Cγ对突触蛋白-Ⅰ磷酸化调节及其在脑缺血损伤中的作用

目的探讨经典型蛋白激酶Cγ(c PKCγ)对突触蛋白-Ⅰ磷酸化水平的影响及其在小鼠原代脑皮层神经元氧-糖剥夺(OGD)缺血损伤中作用。方法借助c PKCγ基因敲除(c PKCγ~(-/-))小鼠,利用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)在体缺血模型和原代脑皮层神经元OGD离体细胞缺血模型,采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹和免疫荧光等生物化学技术,验证c PKCγ与突触蛋白-Ⅰ的相互作用,探讨c PKCγ对突触蛋白-Ⅰ磷酸化水平的调节及小鼠原代脑皮层神经元OGD损伤后对神经元形态的影响。结果免疫共沉淀结果证明,正常及缺血小鼠脑皮层组织中c PKCγ与突触蛋白-Ⅰ均存在相互作用;对突触蛋白-Ⅰ5个可能的丝氨酸磷酸化位点进行筛选发现,只有Ser549和Ser553位点的磷酸化水平在OGD和c PKCγ敲除前后有明显变化;进一步统计分析得出,野生型(c PKCγ~(+/+))小鼠原代脑皮层神经元中,OGD处理使突触蛋白-ⅠSer549和Ser553位点的磷酸化水平显著降低(每组n=5,与野生型常氧组相比P0.05),c PKCγ基因敲除可显著降低上述两个位点的磷酸化水平(每组n=5,与野生型常氧组相比P0.05),而OGD处理后降低趋势更明显(每组n=5,与野生型OGD组相比P0.05);除此之外,OGD处理可使c PKCγ~(+/+)和c PKCγ~(-/-)脑皮层神经元突起的长度和数目均显著降低(每组n=8,与野生型常氧组相比,P0.05),c PKCγ~(-/-)组降低现象更加显著(每组n=8,与野生型OGD组相比,P0.05)。结论缺血/低氧损伤情况下,c PKCγ可能通过调节突触蛋白-ⅠSer549和Ser553磷酸化水平影响神经元突起的形态,从而保护神经元免受缺血/低氧损伤。     

无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中电压门控性钙通道Ca_v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达

目的利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测电压门控性钙通道Ca v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达变化。方法采用新生24h内Wistar大鼠,取海马进行神经元原代培养。体外培养至12d,无镁细胞外液处理一部分神经元3h后,应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况以及免疫印迹法检测电压门控性钙通道Ca v 1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的蛋白表达。无镁细胞外液处理另一部分细胞12h后检测Ca v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的蛋白表达。结果在无镁细胞外液处理3h后,神经元存在自发的"癫痫样"放电,而神经元Ca v1.2和磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ表达不变;无镁诱导12h后,神经元电压门控性钙通道Ca v1.2表达下调,而磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ表达上调。结论电压门控性钙通道Ca v1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达变化可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关。     

Upregulation of GluR2 decreases intracellular Ca2+ following ischemia in developing gerbils

Developing animals are known to be resistant to cerebral ischemia. To investigate the mechanisms by which developing animals exhibit ischemic resistance, we examined the changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) after oxygen-glucose deprivation (OGD) using hippocampal slices from gerbils. We found that increases of [Ca2+]i in hippocampal CA1 neurons is significantly less after OGD in developing gerbils than in adults. Western blot analysis of AMPA (alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid) receptors (AMPARs) showed that GluR2 expression, but not that of the other AMPARs is significantly higher in developing gerbils than in adults. Expression of the anti-apoptotic proteins such as HSP70, Bcl-XL, and plasma membrane Ca2+-ATPase type1 (PMCA1) are not higher in the developing gerbils than in adults. These results suggest that the higher expression of GluR2 is important for the smaller increases in [Ca2+]i and enhanced resistance to ischemia-induced neuronal damage in developing animals.     

Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响

目的:观察Bcl-2抑制剂对黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的影响。方法:取体外原代培养8 d的海马神经元,随机分为6组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、黄芪注射液组、黄芪注射液溶剂(无菌去离子水)对照组、Bcl-2抑制剂组和Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组。除正常对照组外均进行缺氧缺糖0.5 h再复氧复糖,各组均于复氧复糖后24 h进行指标检测:采用细胞免疫化学染色法观察细胞形态和caspase-3阳性细胞率,Western blotting法检测海马神经元Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表达,RTPCR法检测海马神经元caspase-3 mRNA的表达。结果:与正常对照组相比,模型组细胞caspase-3阳性率、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显增强(P0.05);与模型组相比,黄芪注射液组Bcl-2表达明显增加,细胞caspase-3阳性率、cleaved caspase-3蛋白及caspase-3 mRNA表达均明显降低(P0.05);而黄芪注射液溶剂对照组、Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组则无明显差异;黄芪注射液溶剂对照组Bcl-2表达较正常对照组无明显变化,而Bcl-2抑制剂组及Bcl-2抑制剂+黄芪注射液组显著下降(P0.05)。结论:Bcl-2抑制剂可对抗黄芪注射液降低缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元caspase-3表达的作用,黄芪注射液通过Bcl-2发挥对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡的抑制作用。     

Expression pattern of voltage-dependent calcium channel subunits in hippocampal inhibitory neurons in mice

Different subtypes of voltage-dependent calcium channels (VDCCs) generate various types of calcium currents that play important role in neurotransmitter release, membrane excitability, calcium transients and gene expression. Well-established differences in the physiological properties and variable sensitivity of hippocampal GABAergic inhibitory neurons to excitotoxic insults suggest that the calcium homeostasis, thus VDCC subunits expression pattern is likely different in subclasses of inhibitory cells. Using double-immunohistochemistry, here we report that in mice: 1) Cav2.1 and Cav3.1 subunits are expressed in almost all inhibitory neurons; 2) subunits responsible for the L-type calcium current (Cav1.2 and Cav1.3) are infrequently co-localized with calretinin inhibitory cell marker while Cav1.3 subunit, at least in part, tends to compensate for the low expression of Cav1.2 subunit in parvalbumin-, metabotropic glutamate receptor 1alpha- and somatostatin-immunopositive inhibitory neurons; 3) Cav2.2 subunit is expressed in the majority of inhibitory neurons except in calbindin-reactive inhibitory cells; 4) Cav2.3 subunit is expressed in the vast majority of the inhibitory cells except in parvalbumin- and calretinin-immunoreactive neurons where the proportion of expression of this subunit is considerably lower. These data indicate that VDCC subunits are differentially expressed in hippocampal GABAergic interneurons, which could explain the diversity in their electrophysiological properties, the existence of synaptic plasticity in certain inhibitory neurons and their vulnerability to stressful stimuli.     

腺苷对体外培养的海马缺糖缺氧神经元的保护作用

目的:观察缺糖缺氧对大鼠海马培养神经元的影响及腺苷的保护作用。方法:取培养12d的海马神经元, 分为对照组和腺苷组, 同时于缺糖缺氧环境中培养0.5-4h后取出, 立即更换原神经元培养液在常氧下继续培养24h。于不同时间取出, 收集培养液, 测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量, 用图像分析仪测定神经元胞体面积, 并用4%台盼蓝染色, 计算神经元存活百分率。同时用原位末端标记(TUNEL)法检测神经元凋亡。结果:缺糖缺氧后海马神经元胞体肿胀, 体积变大, LDH渗出含量增多, 神经元存活率减少。恢复糖和氧供应后24h, 海马神经元LDH渗出含量进一步增多, 细胞存活率进一步减少, 凋亡神经元百分率明显增多。经腺苷预处理的海马神经元缺糖缺氧后, 神经元LDH渗出明显少于对照组, 神经元胞体面积增大程度轻于对照组, 神经元存活率明显高于对照组。缺糖缺氧0.5-3h再恢复氧和糖供应后24h, 腺苷组凋亡神经元百分率亦明显低于对照组。结论:缺糖缺氧可引起海马神经元严重损伤, 神经元损伤程度与神经元存活率、LDH渗出含量的改变呈对应变化。腺苷能减少缺糖缺氧后神经元的损伤, 减少缺糖缺氧后神经元凋亡, 提示腺苷对缺糖缺氧海马神经元具有一定的保护作用。     

亚低温减轻氧糖剥夺所致的大鼠海马神经元损伤

 目的： 研究亚低温（31～32　℃）对氧糖剥夺（OGD）损伤的大鼠海马神经元的保护作用并探讨其保护机制。方法：本实验通过体外培养大鼠海马神经元并予以OGD处理,建立了模拟大脑缺血、缺氧的神经元OGD模型;将实验细胞随机分为正常对照组、单纯亚低温组、单纯OGD组以及亚低温+OGD组,通过形态学观察、神经元凋亡率检测以及胞浆内caspase-3活性检测,研究亚低温对神经元OGD的保护作用及其机制。结果：神经元OGD后出现明显的细胞损伤,凋亡率明显升高(P＜0.01);与单纯OGD组比较,亚低温+OGD组细胞损伤明显改善,细胞形态学改善,凋亡率下降(P＜0.05),同时caspase-3活性亦下降(P＜0.05);神经元OGD后caspase-3活性升高,与凋亡率呈正相关（r=0.823,P＜0.05）,神经元经过亚低温和OGD后caspase-3活性与凋亡率亦呈正相关（r=0.841,P＜0.05）。结论：OGD可使caspase-3的活性升高及神经元凋亡率增加。亚低温对神经元OGD的保护作用可能与其抑制caspase-3的活性有关。     

High level over-expression of different NCX isoforms in HEK293 cell lines and primary neuronal cultures is protective following oxygen glucose deprivation

In this study we have assessed sodium-calcium exchanger (NCX) protein over-expression on cell viability in primary rat cortical neuronal and HEK293 cell cultures when subjected to oxygen-glucose deprivation (OGD). In cortical neuronal cultures, NCX2 and NCX3 over-expression was achieved using adenoviral vectors, and following OGD increased neuronal survival from ≈20% for control vector treated cultures to ≈80% for both NCX isoforms. In addition, we demonstrated that NCX2 and NCX3 over-expression in cortical neuronal cultures enables neurons to maintain intracellular calcium at significantly lower levels than control vector treated cultures when exposed to high (9mM) extracellular calcium challenge. Further assessment of NCX activity during OGD was performed using HEK293 cell lines generated to over-express NCX1, NCX2 or NCX3 isoforms. While it was shown that NCX isoform expression differed considerably in the different HEK293 cell lines, high levels of NCX over-expression was associated with increased resistance to OGD. Taken together, our findings show that high levels of NCX over-expression increases neuronal and HEK293 cell survival following OGD, improves calcium management in neuronal cultures and provides additional support for NCX as a therapeutic target to reduce ischemic brain injury.     

孕酮对氧糖剥夺损伤的PC12细胞的保护作用

目的: 观察孕酮(PROG)对氧糖剥夺(OGD)PC12细胞活力及葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)表达的影响,在培养细胞证明孕酮抗缺氧缺血损伤的神经保护作用。方法: 神经生长因子诱导分化良好的PC12细胞,随机分为3组:(1)正常对照组:常规培养,不进行OGD处理;(2)OGD组:无糖培养基、低氧环境(95%N₂和5%CO₂持续通气)进行OGD 30 min处理,然后复氧复糖培养24 h;(3)PROG +OGD组:培养液含终浓度为10 nmol/L 孕酮,余同OGD组。WST-8法检测各组PC12细胞的活力;检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性,判断细胞损伤的程度;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PC12细胞GLUT1 mRNA和GLUT3 mRNA表达;Western blotting法检测PC12细胞GLUT3蛋白表达。结果: 孕酮可以减轻OGD引起的PC12细胞肿胀,降低LDH漏出,减轻细胞损伤,显著增加OGD组PC12细胞的活力(P<0.01)。RT-PCR显示PROG +OGD组GLUT3 mRNA的表达明显高于OGD组(P<0.05),Western blotting显示PROG +OGD组GLUT3蛋白的表达显著高于OGD组(P<0.01)。结论: 孕酮对体外培养OGD损伤的PC12细胞具有保护作用,其机制可能与上调GLUT3蛋白的表达有关。     

经典型蛋白激酶Cγ及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺缺血损伤中的作用

目的 探讨经典型蛋白激酶Cγ (cPKCγ)及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺(OGD)缺血损伤中的作用。方法 利用cPKCγ基因敲除(cPKCγ^-/-)小鼠和原代培养脑皮层神经元1h OGD/24h复糖复氧(R)模拟离体细胞缺血模型,给予14-3-3γ抑制剂R18干扰,采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹(Western blotting)和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,验证cPKCγ与14-3-3γ的相互作用及其对原代培养小鼠脑皮层神经元1h OGD/24h R缺血损伤的影响。结果 Co-IP结果证明,14-3-3γ与cPKCγ在小鼠脑皮层中确实存在相互作用;1h OGD/24h R处理使原代培养野生型(cPKCγ ^+/+)小鼠脑皮层神经元内cPKCγ蛋白水平明显降低,而14-3-3γ蛋白水平显著增加(P<0.05,每组n=6);对于原代培养cPKCγ^-/-小鼠脑皮层神经元,尽管14-3-3γ表达水平明显高于cPKCγ^+/+小鼠脑皮层神经元,但1h OGD/24h R处理却使14-3-3γ表达水平显著降低(P<0.05, 每组n=6),提示cPKCγ可影响神经元内14-3-3γ的表达水平。此外,MTT结果表明,14-3-3γ抑制剂R18 (100μmol/L)可显著加重1h OGD/24h R处理原代培养cPKCγ^-/-和cPKCγ^+/+小鼠脑皮层神经元的缺血损伤(P<0.05,每组n=6)。结论 cPKCγ与14-3-3γ在小鼠脑皮层神经元内存在相互作用并影响14-3-3γ的蛋白表达水平,cPKCγ和14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元缺血/低氧损伤中起保护作用。