20S蛋白酶体β5亚单位基因沉默对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

目的:应用基因沉默技术,观察下调20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖能力的影响及其潜在机制,寻求调节干细胞活力的关键靶点。方法:构建PSMB5-shRNA慢病毒载体感染早期hBMSCs,根据感染条件不同将细胞分为绿色荧光蛋白(GFP)对照组和shRNA组。倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和免疫印迹检测PSMB5沉默效率,荧光分光光度法检测蛋白酶体活性;BrdU掺入实验观察PSMB5基因沉默对早期hBMSCs增殖潜能的影响,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫印迹检测细胞周期相关蛋白1(cyclin D1)及其激酶CDK4的表达变化。结果:慢病毒感染早期hBMSCs 72 h可见约95%以上细胞表达绿色荧光蛋白。shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平较GFP对照组分别降低93.31%±0.59%和56.83%±13.31%,且蛋白酶体活性较对照组降低37.47%±0.41%。此外,shRNA组BrdU阳性率26.14%±8.13%较对照组49.53%±11.18%显著降低,G1期细胞较GFP对照组增多,而S期和G2/M期细胞却较对照组减少,Cyclin D1和CDK4的表达水平分别下降54.55%±7.76%和63.26%±15.76%。结论:PSMB5基因沉默能够下调Cyclin D1和CDK4的表达,导致细胞G1/S转换停滞,影响hBMSCs增殖潜能。     

靶向PSMB5基因的shRNA慢病毒载体对神经干细胞增殖和分化潜能的影响

目的:优化20S蛋白酶体β5亚单位(proteasome subunit beta type-5,PSMB5)-shRNA慢病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方案,观察PSMB5表达下调对NSCs增殖和分化能力的影响,探讨调控NSCs潜能的分子机制。方法:构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体,并设错义序列对照,感染新生小鼠(postnatal day 0,P0)NSCs。倒置荧光显微镜观察GFP阳性率,计算感染率,RT-PCR、免疫印迹和荧光分光光度法检测PSMB5沉默效率和蛋白酶体活性。比较对照组和shRNA组神经球的数量和直径,利用CCK-8实验观察PSMB5基因沉默对NSCs增殖潜能的影响。Tuj1染色观察PSMB5基因沉默对NSCs分化能力的影响。结果:PSMB5-shRNA慢病毒感染NSCs 24 h后可见GFP荧光表达,48 h达峰值,传代后可见GFP稳定表达。其感染复数MOI为40,polybrene 3μg/ml时,感染48 h GFP阳性率可达92.5%±2.3%;PSMB5-shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平分别较对照组降低66.49%±4.81%(P0.001)和33.1%±2.54%(P0.001)。PSMB5-shRNA组蛋白酶体活性较对照组下降43.4%±1.48%(P0.01)。shRNA组NSCs的增殖能力降低,神经球数量为126.5±8.4显著低于对照组163.5±9.5(P0.01),神经球的平均直径为29.9μm±2.6μm显著低于对照组42.9μm±2.3μm(P0.01)。CCK-8结果表明PSMB5-shRNA组细胞吸光度值0.36±0.04,显著低于对照组0.59±0.03(P0.001),PSMB5-shRNA组Tuj1+阳性率为39.13%±8.14%,较对照组显著降低(P0.01)。结论:PSMB5基因沉默可降低NSCs蛋白酶体活性抑制P0期小鼠NSCs增殖分化能力。     

胰岛素对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素对大鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法培养大鼠大脑皮层NSCs,用胰岛素作用于培养的NSCs,3H-TdR掺入检测NSCs的增殖,免疫细胞化学和流式细胞仪检测NSCs的分化。结果胰岛素能明显促进NSCs对3H-TdR的摄入,明显促进细胞的增殖,并且胰岛素促细胞增殖作用具有一定的量效关系;免疫细胞化学和流式细胞仪结果显示,胰岛素对NSCs向神经元的分化有明显促进作用,并且NSCs分化后多巴胺能神经元数目明显增加。结论胰岛素可能具有促进NSCs增殖和向神经元包括多巴胺能神经元分化的作用。     

蛋白酶体活性对小鼠神经干细胞活性氧水平的影响

目的:探讨蛋白酶体活性对小鼠神经干细胞(NSCs)活性氧(ROS)水平和增殖能力的影响,寻求维持NSCs活力的有效方法。方法:分离培养新生(P0)和成年(P90)小鼠室管膜下区(SVZ)神经干细胞。比较P0和P90 NSCs成球数量和增殖能力,荧光酶标仪检测蛋白酶体活性,DCFH-DA法测定ROS水平。应用蛋白酶体抑制剂MG132和激活剂18α-GA分别作用于P0和P90 NSCs,CCK-8法、DCFH-DA法和JC-1染色检测蛋白酶体活性改变对NSCs增殖能力、ROS水平和线粒体膜电位的影响。结果:P90 NSCs神经球直径和数量较P0明显减少,增殖活性较P0 NSCs明显下降(P0.001)。此外,P90 NSCs蛋白酶体活性较P0 NSCs降低0.55±0.03(P0.05),但ROS水平却较P0 NSCs升高13.25±0.12倍(P0.001)。MG132作用后P0 NSCs ROS水平呈浓度依赖性升高,其中10μmol/L组较对照组显著升高131%±8.4%(P0.001),增殖活性却降低54.4%±7.8%(P0.001);MG132组NSCs线粒体膜电位较对照组下降。相反,18α-GA作用后P90 NSCs ROS水平呈浓度依赖性降低,其中6和8μg/ml组分别下降2.77±0.20和2.78±0.32(P0.01),增殖活性却是对照组的3.76和5倍(P0.001);18α-GA组NSCs线粒体膜电位较对照组升高。结论:蛋白酶体活性与NSCs ROS水平密切相关,激活蛋白酶体活性可减少ROS对成年NSCs线粒体功能的影响,提高NSCs增殖活力。     

GM-1对离体大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的 研究不同剂量GM-1（神经节苷脂）对离体大鼠神经干细胞增殖和分化的影响。方法 自大鼠脑组织分离神经干细胞，培养于含有bFGF和／或B27的DMEM／F12培养液中，实验组培养液中分别加入33．5μg/L、3．35μg/L及0．335μg/L GM-1，用MTT比色分析法测定细胞增殖能力。用含体积分数3％血清的DMEM／F12培养液诱导细胞分化，每间隔6h于倒置显微镜下观察细胞分化情况。结果 4d、8dMTT比色显示，GM-1（33．5μg/L）组与阳性对照组比较，P均〉0．05，与阴性对照组比较，P均〈0．05；GM-1（3．35μg/L）组、GM-1（0．335μg/L）组与阴性对照组比较，P均〉005。分化研究发现．接种6h后，3个实验组与阴性对照组的细胞突起短且细小，而血清组神经求周边可见明显粗大的细胞突起，呈放射状向周边伸出；随着分化时间的延长，各组细胞突起均逐渐伸长，3个实验组分化能力低于对照组，与阴性对照组之间无显著差异。结论 GM-1能够维持大鼠神经干细胞的原始状态，促进神经干细胞增殖，而对神经干细胞的分化作用不明显。     

低氧对大鼠大脑皮层神经干细胞增殖和分化的影响

目的:观察和分析不同低氧浓度对大鼠大脑皮层神经干细胞(neural stem cells,NSC S)增殖和分化的影响。方法:在1%O2、4%O2和常氧环境(20%O2)下培养新生SD大鼠神经干细胞,对神经球计数并测量其直径,分析不同低氧对神经干细胞增殖效率和增殖速度的影响;分化48 h后行β微管蛋白Ⅲ(β-tubulin III)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞荧光染色,对神经元和星形胶质细胞进行计数并分别计算各占的比例。结果:(1)低氧对神经干细胞增殖效率和增殖速度的影响:1%低氧组神经球数量明显低于常氧对照组,具有显著性差异(P<0.05);4%低氧组神经球数量高于对照组,具有显著性差异(P<0.05)。在24 h、36 h和48 h,1%低氧组神经球的直径都小于对照组,在24 h和36 h时具有显著性差异(P<0.05),在48 h具有非常显著性差异(P<0.01);在24 h、36 h和48 h,4%低氧组神经球的直径都大于对照组,在36 h时具有显著性差异(P<0.05),在48 h具有非常显著性差异(P<0.01)。(2)1%低氧组神经元的比例(0.614±0.056)显著高于其对照组(0.471±0.067)(P<0.01);而1%低氧组星形胶质细胞的比例(0.241±0.051)低于其对照组(0.322±0.067)(P<0.05)。4%低氧组神经元的比例(0.625±0.072)显著高于其对照组(0.513±0.032)(P<0.05);而4%低氧组星形胶质细胞的比例(0.237±0.053)显著低于其对照组(0.285±0.042)(P<0.05)。结论:和常氧对照组相比,4%O2促进大鼠大脑皮层神经干细胞的增殖,而1%O2抑制了神经干细胞的增殖;1%O2和4%O2都促进神经干细胞向神经元方向分化,同时抑制向星形胶质细胞分化,1%O2的这种作用更为显著。     

APP5肽对体外培养的大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的 研究APP5肽对体外培养的大鼠胚胎海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响. 方法 1. 原代培养SD大鼠胚胎脑海马NSCs;2. 利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标记物微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GalC)对培养的NSCs进行鉴定;3. 将培养的NSCs分为对照组、血清组、APP5肽反序列组和APP5肽组, 观察各组细胞形态的变化;4. 将培养的NSCs分为对照组、APP5肽反序列组和APP5肽组,利用细胞计数、干细胞克隆形成率、干细胞克隆形成大小以及四甲基偶氮唑盐(MTT)代谢率测定的方法 ,分析APP5肽对海马NSCs增殖的影响. 结果 1.海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性;加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈MAP2、GFAP或GalC阳性;2. 海马NSCs加入APP5肽及其反序列后细胞形态与对照组相比没有明显改变;3.与对照组相比,加APP5肽后海马NSCs数量明显增加,克隆形成率和克隆形成的直径均有明显的增加, 并有统计学差异;4.与对照组相比,加入5肽后海马NSCs的MTT代谢率明显增加,有统计学差异,反序列组没有明显改变. 结论 APP5肽能促进海马NSCs增殖,但并不促进其分化.     

Ndrg2对培养大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的:检测Ndrg2在培养大鼠神经干细胞(NSCs)中的表达情况,探索改变Ndrg2表达对NSCs增殖和分化的影响。方法:用免疫细胞化学染色和Western Blot法检测Ndrg2在培养NSCs中的表达;利用AAV-Ndrg2过表达病毒及LV-Ndrg2-RNAi干扰病毒感染大鼠NSCs后,通过BrdU掺入实验观察干预Ndrg2表达后NSCs增殖的变化,利用神经元标记物Tuj1和星型胶质细胞标记物GFAP的免疫细胞化学染色分析NSCs的分化情况。结果:Ndrg2高表达于大鼠NSCs中;与对照组(感染病毒空载体)相比,上调Ndrg2表达可显著增加BrdU~+和Tuj1~+细胞数(P0.05),但GFAP~+细胞数目无明显变化(P0.05);相反,下调Ndrg2表达可减少BrdU~+细胞数(P0.05),但不影响Tuj1~+和GFAP~+细胞数(P0.05)。结论:Ndrg2表达于大鼠NSCs,它可正性调控NSCs的增殖并促进NSCs向神经元分化。     

脑源性神经营养因子对神经干细胞增殖和分化的影响

目的:通过不同浓度脑源性神经营养因子(BDNF)对神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响,探讨合适的诱导时间和诱导浓度.方法:按照BDNF的浓度分为对照组,实验组2、20和200ng/ml BDNF.MTT法检测不同浓度BDNF在诱导后不同的时间点(1、3、5、7d)对细胞增殖的影响,免疫细胞化学法检测神经元的标记物-神经元特异性烯醇化酶(NSE),并计算各组在不同时间点的神经元分化率.结果:不同浓度的BDNF实验组在诱导后不同时间(1、3、5、7d)MTT法所测OD值与对照组相比差异均无统计学意义.随着BDNF浓度的增加,神经干细胞分化为神经元的比率呈增高的趋势,差异有统计学意义.在分化的时间上,各组均在第3天时达到最高,其中实验组最高接近80%,而对照组仅为35%.结论:BDNF对NSCs的增殖无明显作用,BDNF能促进NSCs向神经元方向分化,其分化的比率在一定范围内呈剂量依赖性.     

褪黑素促进体外缺氧的神经干细胞增殖及定向分化

目的:观察褪黑素对体外缺氧诱导的小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响。方法:取孕12.5 d胚胎小鼠大脑皮质分离培养NSCs,建立缺氧模型。利用免疫荧光染色,检测分析褪黑素对缺氧诱导后不同时间点的NSCs增殖和分化的影响。结果:缺氧后NSCs的增殖能力明显下降,而褪黑素可显著改善这一现象,促进缺氧后NSCs的增殖。缺氧后NSCs向神经元的分化明显受阻,褪黑素处理组的神经元的分化率明显高于对照组,其中作用高峰期是分化的第七天。结论:体外缺氧的NSCs增殖和分化均明显受到抑制,而褪黑素的干预可明显改善干细胞的增殖,促进NSCs向神经元的分化,但对星形胶质细胞的分化没有显著影响。     

叔丁基对苯二酚激活蛋白酶体活性促进成年小鼠神经干细胞增殖与分化

目的:探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对成年小鼠神经干细胞(aNSCs)增殖分化能力的影响,寻找维持aNSCs活力的有效手段。方法:成年BALB/c小鼠腹腔注射tBHQ(每日16.7 mg/kg)7 d,收集室管膜下区(SVZ)的脑组织,应用荧光酶标仪定量检测其蛋白酶体的活性;同时小鼠腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),Brd U免疫荧光染色检测SVZ内a NSCs的增殖能力。分离培养SVZ aNSCs,tBHQ(20μmol/L)作用7 d,分析比较tBHQ组与DMSO组a NSCs的蛋白酶体活性、BrdU阳性率以及形成神经球的数量和直径。应用1%的胎牛血清诱导a NSCs分化,早期神经元标记物β-Ⅲ微管蛋白(Tuj1)免疫荧光染色并比较tBHQ组与DMSO组a NSCs向神经元分化的能力。结果:小鼠腹腔注射tBHQ,其SVZ蛋白酶体活性较DMSO对照组上调12.9%±4.6%(P0.05),并且BrdU标记实验显示tBHQ组阳性细胞数为31.3±6.3,与DMSO对照组(15.4±1.3)比较,aNSCs增殖能力显著提高(P0.05)。体外实验结果也显示tBHQ组aNSCs蛋白酶体活性较DMSO对照组上升10.1%±0.8%(P0.01)。tBHQ组Brd U阳性率(31.3%±3.2%)是DMSO对照组(20%±1.5%)的1.6倍(P0.05)。tBHQ组神经球的数量和直径分别是DMSO对照组的1.7倍(P0.05)和1.4倍(P0.05),提示tBHQ促进aNSCs的自我更新。此外,tBHQ组Tuj1阳性率为26.5%±1.6%,较DMSO对照组18.6%±2.1%显著提高(P0.05),提示tBHQ能够促进a NSCs向神经元方向分化。结论:tBHQ能够上调蛋白酶体活性,促进aNSCs的增殖与分化。     

血小板微粒对神经干细胞增殖和分化的影响

背景：血小板微粒是血小板在活化过程中释放的小的亚细胞碎片,在血管新生和缺血组织新生中发挥作用。 目的：观察血小板微粒对神经干细胞增殖、存活和分化的影响。 方法：取胎龄13.5 d的小鼠获取鼠胚胎神经干细胞,分别应用10 μg/L成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子或者0.1,1,10 μg的血小板微粒进行处理观察神经球的大小及细胞转归。 结果与结论：与单独应用成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子干预的神经干细胞相比,经血小板微粒处理的神经干细胞神经球直径明显增大,存活率明显增高。且血小板微粒可促进神经干细胞向胶质细胞和神经元分化。说明血小板微粒同其他生长因子一样均能促进神经干细胞的增殖、存活和分化,且效果优于生长因子单独应用。     

神经干细胞增殖分化的影响因素、调控机制与应用

神经干细胞可持续增殖并具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,为治疗中枢神经系统退行性疾病和损伤打下基础,综述了NSC增殖分化的影响因素、调控机制及其临床应用前景。     

海人酸对神经干细胞增殖及分化的影响

背景：神经干细胞对脑组织的修复作用非常有限,约80%新增殖的内源性神经干细胞在6周内死亡,仅0.2%的细胞继续增殖、分化,参与修复。 目的：分析不同剂量海人酸在对神经干细胞增殖及分化的影响。 方法：体外分离并培养新生Wistar大鼠神经干细胞,将神经干细胞分为空白对照组和加入不同浓度梯度的海人酸组,通过免疫组化法和免疫荧光法进行鉴定,MTT比色法测定海人酸对神经干细胞分化的影响,计算分化后神经元和星形胶质细胞比例。 结果与结论：海人酸组贴壁的神经球分化速度较空白对照组快,在同一时间点进行观察,神经细胞的迁移距离较未处理组远。分化5 d后,海人酸组所分化的细胞中,星状细胞较空白对照组多,而神经元样细胞相对较少,培养的细胞具有自我更新和向神经元﹑少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能。兴奋性氨基酸海人酸可使部分神经干细胞死亡,但可促进幸存的神经干细胞增殖及分化,并诱导其向星形胶质细胞分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

本研究旨在探索可促进成年大鼠神经干细胞增殖并形成较多的克隆球以及其分化出较多神经元的因素。取成鼠前脑室下区的组织进行原代培养 ,将之分为三组分别加入 EGF、b FGF以及 EGF+ b FGF,观察克隆球的形成状况。一周后收集三组原代细胞克隆球 ,加入完全培养液 (仅含 10 %胎牛血清 )进行分化实验。分化 14 d后 ,分别用 MAP-2和 GFAP的单克隆抗体进行免疫荧光标记 ,计算阳性细胞数量。无血清培养结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组原代培养液中形成的原代克隆球数量和直径的差别不明显 ,但都明显地大于 EGF组。免疫荧光结果显示 ,b FGF组和 EGF+ b FGF组中的克隆球分化出 MAP-2阳性神经元的数量明显多于 EGF组 ,而 EGF组则能产生较多的胶质细胞。提示 ,b F GF能促进成年大鼠神经干细胞增殖 ,所形成的细胞克隆球能分化为较多的神经元。     

神经干细胞增殖分化的调控机制

神经干细胞具有强大的增殖能力和多分化潜能,其增殖与分化与生长因子、细胞因子、环境信号等因素密切相关。Notch信号途径可影响NSC的分化方向,核受体Nurrl等也参与了NSC的定向分化机制。     

Nrf2靶向siRNA对小鼠神经干细胞增殖和分化能力的影响

目的:探讨核因子E2相关因子2(Nrf2)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化能力的影响。方法:分离新生小鼠海马组织,培养NSCs,采用电穿孔法将Nrf2 siRNA序列转染至NSCs,分别用real time RT-PCR和Western Blot检测敲减效率;运用BrdU掺入实验、Tuj1免疫荧光染色和CCK-8法检测Nrf2靶向siRNA对NSCs的增殖、分化能力和细胞活力的影响。通过脑立体定位技术,在成年小鼠海马部位注射Nrf2抑制剂Brusatol,应用Western Blot检测Nrf2的蛋白表达水平;通过Ki67、DCX免疫荧光染色检测下调Nrf2对海马神经发生的影响。利用活性氧簇(ROS)水平测定法和real time RT-PCR分别检测活性氧水平和氧化应激相关通路超氧化物歧化酶(SOD1和SOD2)的表达。结果:Nrf2的siRNA序列转染至NSCs, real time RT-PCR结果显示siRNA的敲减效率为(54.56±7.05)%(P<0.01),Western Blot结果显示siRNA的敲减效率为(39.50±7.90)%(P<0.01)...     

蛋白酶体抑制剂MG132对脑室室管膜下区神经干细胞增殖潜能的影响

目的: 观察侧脑室注射蛋白酶体抑制剂MG132对脑室室管膜下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)增殖能力的影响,了解蛋白酶体对NSCs增殖潜能的调控作用,从而进一步探讨蛋白酶体在帕金森病(PD)等老年性疾病神经元损伤中的可能作用机制。方法: 选90日龄健康BALB/c小鼠,左侧侧脑室注射10 μg MG132,于注射后3 d、7 d、14 d提取SVZ总蛋白,荧光酶标仪检测蛋白酶体活性。同时腹腔注射5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),BrdU免疫荧光染色标记NSCs,动态观察蛋白酶体活性改变对NSCs增殖能力的影响。另设溶剂对照组左侧侧脑室注射等剂量DMSO,进行上述实验。结果: 侧脑室注射MG132 3 d、7 d后,SVZ蛋白酶体活性较DMSO对照组显著降低(P<0.05),同时SVZ BrdU⁺ NSCs也显著减少至21±4和22±3,与DMSO对照组相比差异显著(P<0.05)。随着MG132注射时间延长,14 d后SVZ蛋白酶体活性恢复至正常水平(P＞0.05),BrdU⁺ NSCs数量MG132组(82±4)与DMSO组(67±6)相比无显著差别(P＞0.05)。结论: 应用蛋白酶体可逆性抑制剂MG132短时期内能显著抑制SVZ蛋白酶体活性,并且能够降低NSCs增殖能力,提示蛋白酶体活性与NSCs增殖潜能密切相关。