低压缺氧延迟预适应对小鼠海马神经元的保护作用研究

目的：了解低压缺氧预处理是否能够诱导小鼠海马神经元产生延迟预适应，增强神经元耐缺氧能力。 方法： 将近交系Babl/c小鼠放入减压舱，模拟海拔7 000 m高度减压2.5 h/d，连续3 d。第3次减压毕36 h后，观察严重低压缺氧(12 000 m 4 h)、严重缺血(双侧颈总动脉阻塞18 min)、缺血合并低压缺氧 (结扎右侧颈总动脉后，低压缺氧8 000 m 4 h)对低压缺氧预处理及正常对照小鼠海马神经元的损伤情况。 结果： 7 000 m 2.5 h低压缺氧预处理对小鼠海马神经元无显著损伤，能够诱导其产生延迟预适应，显著增强海马神经元耐受严重低压缺氧、严重缺血、缺血合并低压缺氧损伤的能力。 结论: 本研究所采用的低压缺氧预处理方法能够诱导海马神经元产生延迟预适应，增强其抗缺血缺氧能力。     

小鼠海马神经元细胞系HT22微环境诱导BMSCs神经分化

目的探讨小鼠海马神经元细胞系HT22的微环境对骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的定向诱导作用。方法分别培养HT22细胞和GFP转基因荧光小鼠的BMSCs;直接接触法和间接接触法共培养,荧光显微比较GFP标记的干细胞形态变化;收集间接接触共培养的BMSCs行Western blot检测神经相关的蛋白(GFAP,NSE)的表达和变化;利用免疫荧光法检查GFAP和NSE抗原在细胞内的表达。结果培养的骨髓贴壁细胞为CD11b、CD45阴性,CD90阳性。与HT22细胞直接接触共培养及间接接触共培养的BMSCs细胞长轴增长,轴突样突起明显;经HT22细胞培养液诱导的BMSCs内GFAP、NSE表达水平随时间增加而增强;与HT22细胞直接接触共培养诱导的BMSCs表达GFAP和NSE。结论小鼠海马神经元细胞系HT22的微环境可诱导BMSCs向神经元样细胞分化。     

铁抑素-1抑制血红素诱导的小鼠海马神经元铁死亡

目的:研究铁抑素-1(Fer-1)对血红素诱导的小鼠海马神经元铁死亡的影响。方法:小鼠海马神经元细胞系HT22细胞分为对照组(control)、血红素处理组(hemin)以及血红素和铁抑素-1联合处理组(hemin+Fer-1)。利用CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性,利用活性氧荧光探针(DCFH-DA)法检测各组细胞中反应性活性氧(ROS)的含量,利用商品化试剂盒检测谷胱甘肽(GSH)的含量,利用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(MMP)变化,利用Western Blot和real time RT-PCR检测细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达。结果:血红素处理可降低HT22细胞活性,诱发氧化应激,破坏线粒体膜电位(MMP),并下调GPX4表达而诱导铁死亡。相反,Fer-1可以使细胞活性恢复,降低氧化应激反应,从而抑制HT22细胞铁死亡。结论:血红素中诱发了HT22细胞内脂质过氧化反应,引起线粒体损伤及铁死亡;铁死亡抑制剂Fer-1可以阻断血红素这种细胞毒性。     

缺氧微环境对胶质瘤细胞U251迁移性的影响

目的：探讨二氯化钴模拟化学缺氧的细胞微环境对人胶质瘤U251细胞增殖与迁移性的影响及其机制。方法胶质瘤U251细胞的培养基中加入二氯化钴模拟细胞缺氧,通过MTS检测细胞增殖,通过划痕实验检测细胞迁移,通过实时荧光定量PCR检测U251细胞表达血管内皮生长因子水平,采用免疫印迹检测细胞内缺氧诱导因子HIF-1α、动力蛋白RhoA与Cdc42、粘附分子E-cadherin与β-catenin表达,以及该过程中信号转导因子STAT3的磷酸化水平。结果二氯化钴不会促进U251细胞增殖,能显著促进细胞迁移;缺氧条件下U251细胞内VEGF水平升高, E-cadherin、β-catenin表达降低, HIF-1α表达和STAT3磷酸化水平随时间上调。结论二氯化钴模拟缺氧微环境可通过抑制U251细胞间粘附分子E-cadherin、β-catenin表达和提高VEGF-a水平,促进胶质瘤细胞迁移及周围血管生成,增强胶质瘤迁移与转移能力,细胞内信号转导分子HIF-1α和STAT3的激活在该过程中起重要作用。     

缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞损伤的动态观察

目的 探讨缺氧缺糖/复氧复糖不同时间点小鼠海马神经元细胞系HT22细胞损伤情况。 方法 取对数生长期的HT22细胞,随机分为6组：正常对照组、缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）0 h组（OGD/R 0 h）、缺氧缺糖/复氧复糖12 h组（OGD/R 12 h）、缺氧缺糖/复氧复糖24 h组（OGD/R 24 h）、缺氧缺糖/复氧复糖48 h组（OGD/R 48 h）、缺氧缺糖/复氧复糖72 h组（OGD/R 72 h）。除正常对照组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后进行复氧复糖。倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞损伤情况,Bax、Bcl-2免疫荧光染色检测细胞凋亡情况。 结果 正常组HT22细胞呈两极或多极,突起明显,突起之间相互交织成网状,细胞膜光滑且完整,胞体折光性强,OGD/R各组细胞胞体轴突减少,细胞皱缩,胞质凝聚。与正常组比较,OGD/R各组细胞存活率均显著降低（P<0.05）,OGD/R 12 h至OGD/R 24 h达到最低（P<0.05）;OGD/R 12 h及OGD/R 24 h 组LDH显著升高（P<0.05）,OGD/R 0 h、48 h、72 h组均有升高趋势。除OGD/R 0 h组和OGD/R 72 h组外,OGD/R 各组Bax/Bcl-2比值均较正常组显著升高（P<0.05）,峰值出现于OGD/R 24 h。 结论 缺氧缺糖/复氧复糖细胞损伤是一个复杂的动态过程,随着复氧复糖时间的延长,细胞损伤不断加重,24 h达到顶峰,随后细胞损伤情况逐渐缓解。     

氯化钴诱导缺氧对血管周细胞血管生成素-1表达影响的研究

目的检测缺氧环境下缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素-1(Ang-1)表达变化,探讨氯化钴诱导缺氧对血管周细胞Ang-1表达的影响。 方法体外培养人脑血管周细胞,予不同浓度氯化钴诱导缺氧环境,分为对照组和试验组。对照组使用不含氯化钴的血管周细胞培养基培养;试验组使用血管周细胞培养基溶解六水合氯化钴稀释至终浓度分别为50 μmol/L(50 μmol/L氯化钴组)、100 μmol/L(100 μmol/L氯化钴组)、200 μmol/L(200 μmol/L氯化钴组)、300 μmol/L(300 μmol/L氯化钴组)、400 μmol/L(400 μmol/L氯化钴组)。通过蛋白质印迹法检测HIF-1α蛋白表达、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HIF-1α、Ang-1 mRNA合成以及酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测VEGF、Ang-1蛋白分泌。对数据行单因素方差分析、Dunnett-t检验及t检验。 结果对照组和各试验组(50、100、200、300、400 μmol/L氯化钴组)HIF-1α蛋白表达组间差异有统计学意义(F＝215.7,P<0.05);HIF-1α蛋白表达随氯化钴浓度先升高后降低,在200 μmol/L处相对灰度达到峰值8.6140±0.3445,200 μmol/L氯化钴组相对灰度值与对照组,50、100、300、400 μmol/L氯化钴组比较,差异均有统计学意义(t＝38.28、22.18、10.16、5.60、25.47,P值均小于0.05)。对照组与试验组HIF-1α mRNA表达组间比较,差异有统计学意义(F＝195.5,P<0.05);HIF-1α mRNA表达呈氯化钴浓度依赖性降低,400 μmol/L氯化钴组HIF-1α mRNA表达达到最低值5.107×10^－3±8.138×10^－5,与对照组,50、100、200 μmol/L氯化钴组比较,差异均有统计学意义(t＝21.40、17.75、14.96、5.36,P值均小于0.05)。对照组与试验组VEGF蛋白表达组间比较,差异有统计学意义(F＝93.34,P<0.05);VEGF蛋白表达随氯化钴浓度先升高后降低,在200 μmol/L处VEGF蛋白表达达到峰值(901.000±6.798) pg/mL,200 μmol/L氯化钴组与对照组,50、100、300、400 μmol/L氯化钴组比较,差异均有统计学意义(t＝27.70、10.56、4.65、10.49、17.97,P值均小于0.05)。对照组与试验组Ang-1蛋白表达组间比较,差异有统计学意义(F＝279.3,P<0.05);Ang-1蛋白分泌随氯化钴浓度升高先增加,在100 μmol/L处达到峰值(4 364.0±117.3) ng/mL,随后蛋白分泌随氯化钴浓度升高逐渐减少,100 μmol/L氯化钴组与对照组,50、200、300、400 μmol/L氯化钴组组间比较,差异均有统计学意义(t＝8.57、4.33、17.03、19.48、23.30,P值均小于0.05)。对照组与试验组Ang-1 mRNA表达组间比较,差异有统计学意义(F＝172.0,P<0.05);Ang-1 mRNA表达随氯化钴浓度升高先增加,在100 μmol/L处达到峰值6.732×10^－4±7.140×10^－6,随后mRNA表达随氯化钴浓度升高逐渐减少,100 μmol/L氯化钴组与对照组,200、300、400 μmol/L氯化钴组组间比较,差异均有统计学意义(t＝10.05、20.21、110.20、34.25,P值均小于0.05)。 结论轻度缺氧环境下,血管周细胞Ang-1表达随缺氧程度加剧而受到促进;重度缺氧环境下,血管周细胞Ang-1表达随缺氧程度加剧而受到抑制。     

氯化钴预处理减轻缺氧复氧后大鼠海马神经元的凋亡

目的　研究氯化钴 (CoCl2 )预处理对大鼠海马神经元缺氧 复氧后凋亡的影响及其机制。　方法　用CoCl2 处理原代培养大鼠海马神经元 ,并使其暴露于无氧环境。用TUNEL染色法和激光共聚焦显微镜分别检测缺氧后细胞凋亡率以及细胞线粒体膜电位和胞内游离钙。　结果　CoCl2 预处理明显减少海马神经元在缺氧 复氧后的凋亡数 ,并对急性缺氧期间海马神经元的细胞内Ca2 +浓度和线粒体膜电位具有稳定作用。　结论　CoCl2 预处理对急性缺氧引起的海马神经元凋亡可能具有保护作用 ,其机制可能与其稳定缺氧时细胞内Ca2 +浓度和线粒体膜电位有关。     

不同浓度缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液对PC12细胞缺氧耐受性的影响

目的： 探讨缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液(HP extract)对PC12细胞缺氧耐受性的影响。方法: 复制小鼠急性重复缺氧模型，制备HP extract。在培养PC12细胞中加入HP extract使其终浓度分别为0.2、0.8、3.2、6.4、12.8 g/L(HP组)。以同浓度正常小鼠脑匀浆提取液(N extract)作为对照组(N组)。缺氧(2%O2) 培养24、48、72 h后, 采用四唑盐（MTT）比色法检测各组细胞活力 (A570值)并检测缺氧24、48、72 h乳酸脱氢酶（LDH）透出率、缺氧24 h早期凋亡率(Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测)、缺氧72 h晚期凋亡率(Hoechst33258染色荧光显微镜检测)。结果: HP extract浓度低于6.4 g/L(包括6.4 g/L), 缺氧培养24 h时, HP组A570值显著高于同浓度N组, 其 LDH透出率显著低于同浓度N组。随缺氧时间延长, 高浓度HP extract逐渐失去细胞保护作用。至72 h时浓度高于6.4 g/L(包括6.4 g/L)HP extract有促细胞凋亡作用, 此时HP组A570值显著低于同浓度N组, 其LDH透出率和晚期凋亡率均显著高于同浓度N组。结论: 缺氧预适应小鼠脑匀浆提取液对PC12细胞缺氧耐受性的影响呈浓度依赖性和时间依赖性。     

腺苷对小鼠急性重复缺氧耐受性的影响

以昆明小白鼠为实验对象，腹腔注射腺苷及类似物５－环己腺苷以及腺苷受体拮抗剂氨茶碱，观察动物在急性重复缺氧过程中缺氧耐受性及其在低压氧仓中存活时间的变化。结果发现，５－环己腺苷和氨苯碱分别显著延长和缩短了小鼠各次缺氧耐受时间及低氧下的存活时间。     

活化的小胶质细胞在大鼠海马神经元缺氧损伤中的作用

目的 探讨缺氧诱导活化的小胶质细胞在SD大鼠海马神经元缺氧损害中的作用机制.方法 建立共培养体系,应用原位缺口末端标记(TUNEL)法、化学发光法探讨不同组别神经元生长状况以及Caspase-3活性;采用免疫荧光法、格里斯试剂法(Griess Reagent)、还原WST-1法、酶联免疫吸咐测定(ELISA)等方法检测各组培养液中NO、O-2以及TNF-α的表达水平.结果 缺氧12h, N9细胞培养液可抑制常规培养的神经元生长增殖活力,同时可加重由缺氧抑制的共培养体系中神经元活力;既可诱导常规培养的神经元凋亡,又可促进共缺氧培养的神经元凋亡;较之于单纯神经元培养系和常规共培养系,共缺氧培养系的培养液中NO、O-2、TNF-α 3类应激性神经毒性因子产量最高.结论 小胶质细胞活化在缺氧诱发的神经元损害中发挥了重要的作用,其活化后产生的神经毒性分子是效应分子.     

氯化钴和跑台运动对大鼠海马神经发生及低氧诱导因子-1水平的影响

目的:比较氯化钴(CoCl2)所致机体低氧和跑台运动对大鼠海马齿状回新生细胞数量和低氧诱导因子-1(HIF-1)水平的影响.方法:腹腔注射CoCl2和BrdU于动物,运动方式为跑台运动,大鼠海马齿状回新生细胞和HIF-1采用免疫荧光显色显示.结果:小强度跑台运动组大鼠海马齿状回内BrdU免疫阳性(BrdU+)细胞数量显...     

缺氧对滋养细胞Notch信号通路的影响

目的探讨缺氧条件下Notch信号通路在滋养细胞中的表达改变。方法利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测二氯化钴(CoCl2)化学缺氧条件下人早孕绒毛滋养细胞株(the human first-trimester extravillous tropho-blast cell line,TEV-1)中Notch1及Jagged1 mRNA的表达情况。结果 (1)与正常对照组相比,缺氧条件下滋养细胞Notch1 mRNA表达量无明显变化(P>0.05)。(2)随着缺氧时间的延长,滋养细胞Jagged1 mRNA表达量逐渐降低,与正常对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧条件下滋养细胞Notch1及Jagged1表达平衡失调,可能参与滋养细胞功能调控。     

星形胶质细胞条件培养液对缺氧损伤神经元的保护作用

为了探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对缺氧损伤神经元的保护作用,本实验将新生的KM小鼠的皮层星形胶质细胞分离、纯化并传代培养第三代第5d后,将星形胶质细胞(Ast)条件培养液,加入到缺氧损伤的神经元细胞培养液中,观测其对缺氧神经元的存活及其合成和释放一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)和胞膜ATP酶(ATPase)的影响。结果显示:10%和20%ACM对神经元存活有明显促进作用;与对照组相比,20%ACM还有效地减少了缺氧神经元NO、LDH的生成和分泌,保护和提高了ATPase的活性。以上结果提示ACM促进缺氧神经元的存活,其机制可能与减少NO、LDH合成释放及保护细胞膜上ATPase的活性有关。     

缺血、缺氧对小鼠海马DNA甲基化的影响

目的建立缺血、缺氧脑片模型,探讨缺血、缺氧对小鼠海马的损伤及其机制。方法利用C57BL/6J小鼠建立海马脑片缺血、缺氧性脑损伤(HIBD)模型,采用免疫组织化学染色法和Western blotting法分析正常对照组海马脑片与HIBD实验组海马脑片炎症损伤、DNA甲基化相关酶的表达情况。结果 HIBD实验组海马脑片氧化应激、炎症损伤细胞明显多于对照组(P0.01),诱发海马应激损伤;同时HIBD实验组海马脑片DNA甲基化水平高于对照组(P0.01)。结论脑片缺血、缺氧可促发炎症反应对海马组织造成损伤,DNA甲基化水平升高,提示DNA甲基化可能参与缺血、缺氧组织损伤过程;机制可能是HIBD影响DNA代谢活动,诱导DNA甲基化水平升高,DNA甲基化调控相关基因表达产生氧化应激,促发炎症反应,对海马造成损伤。     

缺氧预处理对培养的人血管平滑肌细胞缺氧复氧损伤的影响

缺氧预处理对培养的人血管平滑肌细胞缺氧复氧损伤的影响刘秀华，费宇行，石湘芸，庞永政，苏静怡，唐朝枢（北京医科大学心血管基础研究所，北京１０００８３）尽管临床上如何判定预处理心脏保护的指标尚有争议，但Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ在分离的人心室肌细胞缺氧复氧（ｈ...     

缺氧对大鼠海马神经元生物学功能的影响

为进一步探讨缺氧缺血如何诱导海马神经元损伤直至凋亡,明确缺氧对海马神经元生物学功能的影响及其相关机制,从而为缺血缺氧性脑病的防治提供实验依据,本研究以19d的SD胎鼠脑作为取材对象,经过条件培养基纯化建立海马神经元原代培养体系,通过MTT法、TUNEL法、免疫荧光、化学发光等方法检测海马神经元生长增殖活力、凋亡、Caspase-3活性等指标。结果显示缺氧可抑制SD大鼠海马神经元的生长增殖活力,并伴随着神经元凋亡和Caspase-3活性增高,且随着缺氧时间的增长程度加重。以上结果说明,缺氧通过诱导细胞凋亡导致SD大鼠海马神经元的损害,Caspase-3活性的激活可能是其重要的通路之一。     

缺氧对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞5—羟色胺转载体基因表达 …

目的：探讨无氧（０％Ｏ２＋９５％Ｎ２＋５％ＣＯ２）和低氧（２．５￣３％＋９％Ｎ２＋５％ＣＯ２）对新生小牛肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）和肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭ）５－羟色胺转载体基因表达的影响。方法：应用细胞培养，核到分子杂交技术。结果：无氧组和低氧组（１．５ｈ、３ｈ、６ｈ）ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体ｍＲＮＡ表达显著同于常氧组（Ｐ〈０．０５），而无氧和低氧１２ｈ至４８ｈ对ＰＡＥＣ５－羟色胺转载体ｍＲＮ     

转铁蛋白受体1对小鼠海马神经元生长与分化的影响

目的探讨转铁蛋白受体1(TfR1)对小鼠海马神经元生长与分化的影响。方法取胚胎18.5 d小鼠原代海马神经元培养,培养7 d后使用TfR1 shRNA p GFP-V-RS干扰质粒转染小鼠海马原代神经元使TfR1基因沉默,采用绿色荧光蛋白(GFP)分析及Western blotting技术检测TfR1 shRNA的转染效率;4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及TUNEL法检测干扰后海马神经细胞凋亡情况,免疫荧光技术检测凋亡后神经细胞骨架的变化及神经元突起生长的形态特征。结果 TfR1 shRNA质粒能有效使神经细胞内TfR1基因沉默;TfR1基因沉默后,原代海马神经细胞凋亡率增加,细胞骨架部分崩解,且神经元树突突起长度明显增长(P0.05)。结论转铁蛋白受体1可通过调控小鼠海马神经元树突的生长来影响海马神经元的分化。