影响PCR-RFLP的相关因素

限制性片段长度多态性-聚合酶链式反应(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, PCR-RFLP)是一种模拟体内DNA复制过程的体外酶促合成特异性核苷酸片段技术,又称无细胞分子克隆技术.它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶反应,在体外进行特异DNA序列扩增.扩增后,将PCR产物直接酶切、电泳、显色,即可对目的基因进行分类分型.现将我做PCR-RFLP的体会简要陈述如下.     

低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定

目的：从乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）低拷贝的血清样本中提取病毒DNA并通过PCR扩增得到全长DNA片段。将全长片段经过环化处理后转染HuH7细胞,体外评价病毒的复制水平。方法：设计含有BspQⅠ酶切位点的HBV全长扩增引物和分段扩增引物,选择HBV低拷贝的临床病人血清样本,经抽提纯化后的病毒DNA作为模板,用巢式PCR结合分段扩增的方法扩增得到HBV全长DNA,PCR产物经BspQⅠ酶切后自连环化,将环化的HBV DNA转染HuH 7细胞,经5 d细胞培养,提取细胞中的病毒复制中间体,通过Southern blot分析病毒复制水平。结果：通过PCR扩增得到5个HBV全长DNA,经过酶切连接全长基因后转染HuH7细胞,Southern blot检测均有复制表达。结论：本实验成功构建能够有复制表达的HBV环化全长,为研究血清中低拷贝HBV病毒的不同病人复制水平与DNA序列关系打下基础。     

聚合酶链反应在病理诊断中的应用

1聚合酶链反应基本原理聚合酶链反应（Polrmerasechainreactl””PCR）是80年代中期发展起来的分子生物学方法，其基本原理是用两段人工合成的寡核着酸片段为引物，以双链或单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下经过反复多个循环的变性、复性、延伸等对特定的核酸片段进行扩增。这一方法稳定，能在很短的时间内扩增得到大量所需要的特异DNA片段。理论上，扩增的片段以2”的方式倍增（n为循环次数）［‘j，因此，这一方法是快速扩增DNA的最有效的方法之一。所用的模板DNA可以是提取自新鲜组织，也可以从甲醛固定、石蜡包埋的组织中提…     

DNA印迹试验

DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术,又称Southem杂交。利用一种或多种限制内切酶酶切消化的基因组DNA,或经PCR获得扩增片段,经琼脂糖凝胶电泳,所得的DNA片段按分子大小分离,DNA片段经琼脂糖凝胶、变性,并将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上(多为硝酸纤维素膜,NC或尼龙膜),     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

适用于天麻AFLP分析用的DNA提取及纯化方法

扩增片段多态性(amplified fragment length polymorphisms,AFLP)是上世纪90年代发展起来的一种检测DNA多态性的新方法,其基本原理是选择性扩增基因组DNA的酶切片段,由于不同材料的DNA酶切片段存在差异,因而便产生了扩增产物的多态性.     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

仅采用 PCR 进行分子克隆的方法探索

目的：针对目前各种费时且易失败的克隆方法和价格昂贵的试剂盒等问题,对一种仅采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）分子克隆方法进行了探索。方法利用高保真的 DNA 聚合酶具有3＇-核酸外切酶活性的特点,采用 PCR 把载体和插入片段扩增出来,二者的扩增产物先加限制性内切酶 DpnI 后再按一定比例混合来消化甲基化的 DNA 模板,最后把DpnI 消化产物直接转化到感受态细胞来得到克隆基因。结果是一种简单、高效、可靠、且仅采用 PCR 的分子克隆方法,并利用此方法成功地把构建在载体 pET 上的α-突触核蛋白全长基因和构建在 pCDNA3.1上的乙酰胆碱受体亚基的全长基因分别重新构建在载体 pGEX-4T-1和 pGEMHE 上。结论在 PCR 扩增时能够通过引物设计来确定克隆位点,所以该方法可以把任何 DNA片段插入到质粒载体内的任何位置,而不需要考虑载体多克隆位点限制的问题。此外,该方法省去了传统的酶切消化、纯化回收和连接过程。     

高质量植物基因组DNA的分离

为了从富含多酚和多糖的药用植物组织中分离出高质量基因组DNA ,本文通过改良几种已经存在的分离方法 ,获得了一种以CTAB法为基础的分离高质量完整DNA的简便、快速方法。使用该方法从人参、西洋参及三七的新鲜或干燥根组织分离DNA时 ,A2 60 /A2 80 为 1.8左右 ,分子量大小约为 2 1.2kb ,由此所得的DNA可直接用于AFLP分析 ,即用EcoRⅠ /MseⅠ消化DNA后 ,用DNA的限制酶切片段经T4DNA连接酶连接 ,再用巢式PCR扩增 ,构建出可重复的、多态性丰富的人参、西洋参、三七基因组DNAAFLP指纹图谱。结果表明 ,该技术可有效地从富含多酚和多糖的药用植物组织中分离出高质量和高分子量DNA ,此法亦有望用于其它植物DNA的分离。     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

携带信号肽NT4-GFP-穿膜肽Ant融合基因的重组腺相关病毒载体的构建及意义

目的：构建携带具有穿膜功能的融合报告基因NT4-GFP-Ant基因的重组腺相关病毒载体。方法：应用PCR技术和T载体克隆法克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因;用T4 DNA连接酶将测序正确的GFP与已构建成功的Ant基因片段及PBV220/NT4线性质粒载体定向连接,构建PBV220/NT4-GFP-Ant融合载体,酶切获取融合基因,并将其连入腺相关病毒载体PSSHG中,构建PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关载体并进行酶切鉴定。结果: T-easy/GFP经EcoRⅠ酶切后,可得到730 bp左右的片段,GFP基因经DNA测序证实与GenBank序列一致;pBV220/NT4-GFP-Ant经BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到约为 1 000 bp的基因片段; PSSHG /NT4-GFP-Ant经 BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到大小约为1 000 bp长度的基因片段。结论：成功克隆GFP基因,成功构建NT4信号肽-GFP-Ant穿膜肽融合基因和PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体。     

弓形虫RH株表面抗原P30基因重组质粒的构建及鉴定

目的：构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒,为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法：自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子,用酚／氯仿法提取基因组DNA,用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化),定向插入到PQE-30表达质粒中,转化入TG1宿主菌,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果：阳性重组质粒PQE30-P30经Sal HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp,通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论：成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。     

一种经济、快速的凝胶DNA回收方法

目的：用明胶海绵吸收法回收DNA片段,并验证该方法能否有效、快速的从电泳后琼脂糖凝胶中回收DNA片段。方法：将明胶海绵剪成楔形,在紫外灯照射下插入含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶中,待海绵完全膨胀后取出,离心收集DNA溶液;并用该法回收的DNA片段进行PCR扩增,检验其回收的DNA质量。结果：明胶海绵吸收法回收DNA样品的得率介于63%～98%,所回收的DNA进行PCR扩增能够获得相应的目的条带。结论：明胶海绵吸收法是一种快速、有效的DNA回收方法。     

基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定

目的：分析鹿茸线粒体细胞色素b （Cytb）和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因特异性,建立双重PCR技术鉴别鹿茸真伪的分子指纹特征。方法：利用碱变性法提取梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸和新西兰鹿茸的基因组DNA,应用引物设计软件Premier 5.0针对Cytb和COⅠ分别设计特异性引物（分别为Cytb1、2和COⅠ1、2、3）,采用单一及双重引物分别进行PCR扩增,筛选特异性强的引物,确定最佳PCR反应条件。结果：采用碱变性法提取的鹿茸基因组DNA片段长度为23 000bp,DNA纯度即A （260）/A （280）为1.80±0.02;应用单一引物进行PCR扩增无法鉴定鹿茸的真伪,而引物Cytb 1和COⅠ1组合后,解链温度为58℃时,梅花鹿茸（吉林、安徽）、马鹿茸均能扩增出395和525bp大小的2个片段,而驯鹿茸和新西兰鹿茸均未能扩增出相应片段;采用该提取方法及最优化的PCR反应条件,对市售样品进行检测,检测结果与实际情况完全一致。结论：双重PCR技术可从分子水平鉴别鹿茸的真伪,该方法特异性高、实用性强,且简便快捷,在鹿茸真伪鉴别方面具有较高的应用价值。     

介绍一种滤纸片快速回收DNA片段的方法

采用置于Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中的滤纸片，快速离心的方法回收ＤＮＡ片段。实验表明，该方法是一种简便、快速、可靠的回收ＤＮＡ片段的方法，回收率高。回收的ＤＮＡ片段可进一步用于基因工程中克隆连接、酶切和探针标记。     

弓形虫DNA疫苗在免疫鼠体内的分布情况研究

目的观察弓形虫疫苗pcDNA3.1-P30-P22免疫小鼠后在小鼠体内的分布情况。方法雌性BALB/c系小鼠,随机分成3组,每组12只,第1组为pcDNA3.1-P30-P22免疫组,第2组为空质粒pcDNA3.1对照组,第3组为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组;免疫组经肌内注射免疫,于免疫后4周和8周,分别取小鼠的注射部位肌肉、血液、肝脏及脾脏抽提组织DNA,并以此为模板进行多聚酶链反应(PCR)扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。结果免疫后4周,免疫组小鼠的上述器官均扩增出P30-P22基因片断,对照组均未扩增出相应片断,与预期结果相符;免疫后8周,仅免疫鼠血液扩增出上述特异性片断。结论弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-P30-P22免疫小鼠后,重组质粒能被多个组织摄取,但在不同组织中存留的时间不同。     

高质量植物基因组DNA的分离

为了从富含多酚和我糖的药用植物组织中分离出高质量基因组DNA,本文通过改良几种已经存在的分离方法,获得了一种以CTAB法为基础的分离高质量完整DNA的简便、快速方法。使用该方法从人参、西洋参及三七的新鲜或干燥根组织分离DNA时,A260/A280为1.8左右,分子量大小约为21.2kb,由此所得的DNA可直接用于AFLP分析,即用EcoR I/Mse I消化DNA后,用DNA的限制酶切片段经T4 DNA连接酶连接,再用巢式PCR扩增,构建出可重复的、多态性丰富的人参、西洋参、三七基因组DNA AFLP指纹图谱。结果表明,该技术可有效地从富含多酚和多糖的药用植物组织中分离出高质量和高分子量DNA,此法亦有望用于其它植物DNA的分离。     

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。