三氧化二砷诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对EWS-FLi1融合蛋白的影响

目的:探讨三氧化二砷(Arsenictrioxide,As₂O₃)诱导尤文肉瘤细胞凋亡及对融合蛋白EWS-FLi1表达的影响。方法:应用噻唑蓝(MTT)法、形态学观察、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞术(FCM)观察As₂O₃对体外生长的尤文肉瘤RD-ES细胞系生物行为的影响;应用半定量RT-PCR测定应用As₂O₃前后c-myc基因mRNA水平的变化;应用免疫细胞化学及固定化蛋白印迹法(Westernblot)观察用药前后EWS-FLi1融合蛋白表达水平的变化。结果:As₂O₃对体外生长的RD-ES细胞系具有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡。c-myc基因mRNA表达水平和EWS-FLi1融合蛋白表达量随As₂O₃作用时间延长逐渐降低。结论:常规治疗浓度的As₂O₃对体外生长的尤文肉瘤细胞具有明显的杀伤作用,其作用机制与改变线粒体膜通透性和抑制EWS-Fli1融合蛋白、降低c-myc基因表达有关。     

细胞周期蛋白激酶抑制剂诱导尤文肉瘤细胞凋亡作用的机制

目的探讨小分子细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol（FP）尤文肉瘤细胞株RD-ES凋亡诱导作用及其调控机制。方法FP作用RD-ES细胞后，光学显微镜观察其形态变化，MTT法测定FP对细胞增殖的抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot检测bcl-2，bax，mcl-l和caspase-8的蛋白表达变化。结果MTT实验显示FP对尤文肉瘤RD-ES细胞增殖有抑制作用，其抑制效应具有时间及浓度依赖的特点，流式细胞计数分析表明FP可诱导细胞凋亡，免疫印迹检测显示FP对bcl-2及bax的表达无影响，但细胞凋亡抑制基因mcl-1活性型caspase-8的表达被上调。结论FP可诱导尤文肉瘤细胞株凋亡，其作用不依赖于bcl-2基因的变化，mcl-1基因表达的抑制及caspase-8路径的激活可能为其机制之一。     

Flavopiridol诱导耐阿霉素尤文肉瘤细胞株VH-64/ADR 凋亡及作用机制的研究

目的:探讨细胞周期蛋白酶抑制剂flavopiridol(FP)对耐阿霉素尤文肉瘤细胞增殖抑制及凋亡诱导的作用机制.方法:采用MTT法测定阿霉素(ADM)及falvopiridol对VH-64/ADR细胞的半数抑制浓度(IC50),计算耐药倍数;流式细胞计数仪(FCM)检测falvopiridol给药后VH-64/ADR细胞周期的变化;Western-blotting方法检测细胞中Bcl-2、pro-caspase-3、活化型多聚ADP核糖多聚酶(PARP-85)蛋白的表达.结果:flavopiridol可抑制尤文肉瘤耐阿霉素细胞株VH/ADR的细胞增殖,其效果呈时间及浓度相关性(P<0.05).flavopiridol给药后,耐药细胞株VH-64/ADR的细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);bcl-2、pro-casepase-3表达下调,而活性型PARP表达上调. 结论:FP可有效诱导VH-64/ADR细胞发生凋亡,其机制可能与线粒体信号传导途径有关.     

Flavopiridol诱导耐阿霉素尤文肉瘤细胞株VH-64／ADR凋亡及作用机制的研究

目的：探讨细胞周期蛋白酶抑制剂flavopiridol（FP）对耐阿霉素尤文肉瘤细胞增殖抑制及凋亡诱导的作用机制。方法：采用MTT法测定阿霉素（ADM）及falvopifidol对VH-54／ADR细胞的半数抑制浓度（IC50）,计算耐药倍数;流式细胞计数仪（FCM）检测falvopiridol给药后VH-64／ADR细胞周期的变化;Western—blotting方法检测细胞中Bcl-2、pro—caspase-3、活化型多聚ADP核糖多聚酶（PARP-85）蛋白的表达。结果：flavopiridol可抑制尤文肉瘤耐阿霉素细胞株VH／ADR的细胞增殖,其效果呈时间及浓度相关性（P〈0．05）。flavopiridol给药后,耐药细胞株VH-54／ADR的细胞凋亡率明显高于对照组（P〈0．05）;bcl-2、pro—casepase-3表达下调,而活性型PARP表达上调。结论：FP可有效诱导VH-64／ADR细胞发生凋亡,其机制可能与线粒体信号传导途径有关。     

曲古抑菌素A通过p53转录激活途径诱导尤文肉瘤细胞凋亡

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）诱导尤文肉瘤细胞株WE-68和VH-64凋亡及作用机制.方法：四甲基偶氮唑蓝法（MTT法）测定细胞增殖抑制率.流式细胞计数法测量TSA给药后细胞周期中sub-G1含量的变化.免疫印迹法（Western-blot）检测细胞中活化型多聚ADP核糖多聚酶（cleaved-PARP）,p53-lys382残基乙酰化和p53蛋白总量的表达.实时定量PCR和siRNA转染技术测定p53多个下游基因的mRNA水平改变和p53表达下调对TSA诱导凋亡的影响.结果：TSA抑制了尤文肉瘤细胞的增殖,诱导细胞周期中sub-G1含量和凋亡终产物cleaved-PARP蛋白表达的增加.TSA给药后,p53-lys382残基乙酰化表达量呈浓度依存性增加,同时上调p53下游因子p21,mdm2,Bax和PUMA的mRNA水平.另一方面,p53蛋白表达的下调明显削弱了TSA介导的p21表达的上调和cleaved-PARP的产生.结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA能够通过激活p53高乙酰化表达来恢复p53转录功能,从而诱导尤文肉瘤细胞株产生凋亡.     

活性氧在2-甲氧雌二醇诱导骨尤文肉瘤细胞凋亡中的作用

目的研究在2-甲氧雌二醇（2-ME）诱导SK—N—MC尤文肉瘤细胞凋亡的过程中，调控细胞活性氧水平（ROS）的环节及ROS引发的下游事件。方法利用流式细胞仪、clark氧电极等手段及撤药实验、线粒体通透性转换（PT）孔干预等方法检测2-ME作用下凋亡的可逆性及呼吸链活性、线粒体跨膜电势（△ψm）、细胞ROS水平等参数的变化，并考察它们之间的关系。结果2-ME诱导SK—N—MC细胞发生依赖于ROS的细胞凋亡。2-ME作用3h内撤药，至24h无明显凋亡发生；3h后撤药，至24h有明显凋亡。2-ME作用下，线粒体呼吸链活性被抑制，ROS生成加速；△ψm经历“升高-降低”变化，3h时开始降低，PT孔稳定剂可维持△ψm不降低；ROS水平持续升高，3h时有跳跃性增高，胛孔稳定剂对ROS升高趋势无明显影响。结论2-ME作用引起sK—N—MC细胞呼吸链的抑制，引发△ψm的升高，由此造成ROS生成加速及ROS水平升高，当ROS水平突破-定阈值，引发了胛孔的不可逆开放及△ψm的消解乃至崩溃，并最终使细胞走向凋亡。ROS是2-ME诱导凋亡信号传导中的-个环节。     

紫杉醇对尤文肉瘤细胞系诱导凋亡及生长抑制的研究

目的 研究抗微管药紫杉醇在体外实验条件下对尤氏肉瘤细胞系RD—ES的诱导凋亡及生长抑制作用。方法 不同浓度的紫杉醇作用于体外培养的RD—ES细胞，通过形态学观察，台盼兰染色，Giemsa染色，流式细胞仪分析技术，原位末端标记分析凋亡细胞DNA降解产物等方法，观察紫杉醇诱导RD—ES凋亡的作用。结果 通过与其他化疗药物比较，及随时间剂量改变的情况，可见紫杉醇对RD—ES细胞的诱导凋亡作用呈时间，剂量依赖关系，细胞分裂受阻，凋亡峰明显，多核瘤细胞增多，胞浆中空泡明显。原位末端标记可见DNA降解后的阳性反应。结论 体外诱导实验证实紫杉醇对RD—Es细胞系的有丝分裂有明显的抑制作用及诱导凋亡作用且随时间，剂量增加而增大。     

RNA干扰细胞周期蛋白依赖激酶6基因对尤文肉瘤细胞生物学行为的影响

背景与目的：细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,有实验报道其在尤文肉瘤细胞中呈高表达,但在尤文肉瘤细胞中的生物学功能及相关机理仍不十分清楚。本研究旨在通过研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默CDK6基因表达,探讨其对尤文肉瘤A673、SK-ES-1细胞生物学行为的影响。方法：将化学合成的CDK6-siRNA转染至A673及SK-ES-1细胞中,实时荧光定量PCR法检测转染前后细胞中CDK6 mRNA的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前后细胞CDK6以及CDK6下游因子视网膜母细胞瘤基因(Rb)、磷酸化Rb(P-Rb)的蛋白表达;分别采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移以及侵袭能力的变化。结果：实时荧光定量PCR结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6的表达(P<0.01)。抑制CDK6表达后细胞的增殖速度明显减缓,细胞周期分布发生改变,G0/G1期细胞的比例上升,而S期细胞的比例下降,细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01)。各组细胞的迁移能力：untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(516.00±58.59)个、(534.00±124.77)个、(192.33±68.92)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(371.33±29.67)个、(363.33±60.28)个、(200.00±20.00)个,差异有统计学意义(P<0.01);各组细胞的侵袭能力：untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(251.00±42.93)个、(238.67±78.62)个、(94.67±23.03)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(310.00±35.36)个、(302.33±41.31)个、(105.00±54.08)个,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6以及下游因子P-Rb的表达(P<0.01),但细胞总Rb表达量无明显变化。结论：针对CDK6基因的特异性小RNA干扰片段能够下调CDK6基因及蛋白的表达,并抑制尤文肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移,诱导其凋亡。     

细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol对尤文肉瘤耐药细胞增殖抑制的实验研究

目的:探讨细胞周期蛋白激酶抑制剂(flavopiridol)在体内外抑制尤文肉瘤阿霉素耐药细胞株WE-68/ADR增殖的作用及其机制。方法:四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)测定细胞增殖抑制率。流式细胞计数法测量flavopiridol给药后WE-68/ADR细胞周期的变化及凋亡率。免疫印迹法(Western-blot)检测细胞中Bax、Bcl-2、p53及活化型多聚ADP核糖多聚酶(PARP-85)蛋白的表达。皮下注射WE-68/ADR细胞建立荷瘤裸鼠模型,17flavopiridol腹腔内给药,测量肿瘤体积及裸鼠体重变化,计算肿瘤抑制率。结果:Flavopiridol可抑制尤文肉瘤阿霉素耐药细胞株WE-68/ADR的细胞增殖,其效果呈时间及浓度相关性(P<0.05)。Flavopiridol给药后,耐药细胞株WE-68/ADR的细胞凋亡比明显高于对照组(P<0.05)。同时,耐药细胞株中的Bax、p53及PARP-85的表达增加,而Bcl-2的表达被下调。Flavopiridol可有效抑制荷瘤小鼠体内耐药细胞株的生长。结论:细胞周期蛋白激酶抑制剂flavopiridol可在体内外有效抑制尤文肉瘤阿霉素耐药细胞株的增殖,其机制可能与p53介导的线粒体凋亡信号传导途径有关。     

三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡及对相关基因表达的影响

目的 研究三氧化二砷（As2O3)诱导胃癌细胞的凋亡作用及对凋亡相关基因p53、c-myc、bcl-2、bcl-xl和bcl-xs表达的影响,探讨其诱导胃 癌凋亡的作用机制。方法 研究As2O3对胃癌细胞SGC－07901和MKN－45的诱导凋亡作用和对凋亡相关基因表达的影响。结果 As2O3作用于细胞可见典型的细胞凋亡。出现典型的亚二倍体“凋亡峰”。10μmol／LAs2O3的诱导胃癌细胞SGC－7901和MKN－45的凋亡率为13．8％和22．5％。细胞凋亡指数在1．42％－9．5％之间。As2O3作用后能明显下调SGC－7901细胞的bcl-2蛋白和mRNA的表达;对SGC－7901细胞的p53、c-myc、bcl-xl和bcl-xs蛋白的表达无影响。As2O3能促进MKN－45细胞的p53蛋白和mRNA的表达,对MKN－45细胞的bcl-2、c-myc、bcl-xl和bcl-xs基因表达无影响。结论 As2O3可通过不同途径诱导胃癌细胞凋亡,通过下调SGC－7901细胞的bcl-2的蛋白表达诱导其凋亡,通过上调p53表达诱导胃癌MKN－45细胞凋亡。     

Inhibitors of EYA3 Protein in Ewing Sarcoma

Objective: Among sarcomas, Ewing sarcoma (EWS) is characterized as a highly malignant type of bone tumor caused by the fusion of EWS RNA Binding Protein-1 (EWSR1)/ Friend leukemia integration 1 (FLI1) genes. The product of fusion gene gives rise to EWSR1/FLI1 which activates the activity of Eyes absent homolog 3 (EYA3) which causes tumor growth and angiogenesis. EYA3 is now considered as a therapeutic drug target for EWS . The study was designed to gather potential inhibitors for the EYA3 target using medicinal compounds. Methods: In this study, we have obtained a list of medicinal compounds from the NuBBE database and downloaded their structural information. Then insilico screening analysis of >2,000 medicinal compounds was performed with PyRX virtual drug screening software to discover potential inhibitors for the treatment of EWS. Results: Our investigation revealed that Sorbifolin and 1,7-Dihydroxy-3-methylanthracene-9.10-dione show interactive affinity for EYA3 active residues. Moreover, these compounds have adequate toxicity, can induce cytotoxicity in EWS cells, and are capable of regulating the expression of genes activated by EWSR1/FLI1. Conclusion: Our study concluded that Sorbifolin and 1,7-Dihydroxy-3-methylanthracene-9.10-dione are promising drug candidates for the treatment of EWS and should be further subjected to invitro testing.     

Effects of Arsenic Trioxide Alone and in Combination with Bortezomib in Multiple Myeloma RPMI 8266 Cells

The aim of this study was to detect the efficiency of arsenic trioxide (ATO) alone or together with bortezomibto inhibit proliferation and induce apoptosis in a multiple myeloma (MM) RPMI 8266 cells. Mechanisms of actionwere also investigated. RPMI 8266 cells were treated with ATO alone and in combination with bortezomib for24 hours, and cell viability was assessed by modified MTT. Annexin V-F1TC and PI staining was used to detectthe apoptosis rate and cell cycling was investigated by flow cytometry, along with expression of cell surfacedeath receptor-4(DR4) and death receptor-5 (DR5). Western blotting was applied to detect the expression ofbcl-2, caspase-3, caspase-8, and caspase-9. As a result, the ATO combined with bortezomib group showed moreinhibition of RPMI 8266 cell viability than theATO group. Expression of DR4 and DR5 on the cell surfaces,and the apoptosis rate were increased after treatment by ATO alone or combined with bortezomib. The cellsappeared to arrest in G2/M phase after treatment. Expression of bcl-2 was more significantly decreased in thecombination group, and that of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 was significantly increased as well. Therefore,bortezomib can enhance ATO actions to induce apoptosis in RPMI 8266 cells, with decrease in expression ofbcl-2 and increase of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 proteins.     

三氧化二砷对食管癌细胞株Eca109的放射增敏作用及机制

目的探讨三氧化二砷（Arsenic trioxide, As2O3）及As2O3与放射线联合对食管癌Eca109细胞的增殖抑制作用;分析二者联合对Eca109细胞周期和凋亡的影响,为As2O3的临床应用提供理论依据。方法MTT法观察放射线及As2O3单独及二者联合对食管癌Eca109细胞的增殖抑制作用,利用直线相关及直线回归拟合出照射组、As2O3组及联合组的直线,计算增敏比（sensitizing enhancement ratio, SER）;流式细胞术检测As2O3联合放射线对Eca109细胞周期和凋亡的影响;Western blot印记技术观察As2O3联合放射线对锰超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase, MnSOD）和细胞色素C（cytochrome C, cyt-C）蛋白表达的影响。结果As2O3能抑制食管癌Eca109细胞的增殖,具有明显的量效和时效关系;As2O3对食管癌Eca109细胞有明显的放射增敏作用;As2O3与放射线联合作用于Eca109细胞后,G2/M期细胞比例及凋亡率明显增加,MnSOD蛋白表达下降,而cyt-C蛋白表达未见明显变化。结论As2O3可能通过G2/M期阻滞,降低MnSOD蛋白的表达,从而诱导细胞凋亡来增强放射线对细胞的杀伤作用。     

三氧化二砷对裸鼠宫颈癌移植瘤的作用及机制

摘要：目的研究三氧化二砷 (arsenic trioxide,ATO,As2O3)对宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的作用及机制。方法建立裸鼠移植瘤模型,分为低浓度As2O3组［2mg/（kg·d）］,高浓度As2O3组［5mg/（kg·d）］,顺铂（DDP）组［3mg/（kg·d）］及阴性对照组（0.9%氯化钠0.2ml/d）,连续给药10d,观察抑瘤率及药物对裸鼠的影响。透射电子显微镜观察肿瘤的超微结构,免疫组织化学检测p-P38和Caspase-3的表达。结果低浓度As2O3,高浓度As2O3 及DDP的抑瘤率分别为22.95%、54.86%和54.48%,后两者的抑瘤率与阴性对照组的差异有统计学意义（P<0.05),但DDP的不良反应大。p-P38和Caspase-3在As2O3组的表达明显高于阴性对照组（P<0.05)。结论As2O3可通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制宫颈癌移植瘤的生长。     

Germline PTPRD Mutations in Ewing Sarcoma: Biologic and Clinical Implications

Ewing sarcoma occurs in children, adolescents and young adults. High STAT3 levels have been reported in approximately 50% of patients with Ewing sarcoma, and may be important in tumorigenesis. Protein tyrosine phosphatase delta (PTPRD) is a tumor suppressor that inhibits STAT3 activation. To date, while somatic mutations in PTPRD have been reported in diverse tumors, germline mutations of PTPRD have not been investigated in Ewing sarcoma or other cancers. We identified a novel germline mutation in the PTPRD gene in three of eight patients (37.5%) with metastatic Ewing sarcoma. Although the functional impact in two of the patients is unclear, in one of them the aberration was annotated as a W775stop germline mutation, and would be expected to lead to gene truncation and, hence, loss of the STAT3 dephosphorylation function of PTPRD. Since STAT3 is phosphorylated after being recruited to the insulin growth factor receptor (IGF-1R), suppression of IGF-1R could attenuate the enhanced STAT3 activation expected in the presence of PTPRD mutations. Of interest, two of three patients with germline PTPRD mutations achieved durable complete responses following treatment with IGF-1R monoclonal antibody-based therapies. Our pilot data suggest that PTPRD germline mutations may play a role in the development of Ewing sarcoma, a disease of young people, and their presence may have implications for therapy.     

活性氧水平与食管癌细胞对As2O3促凋亡作用敏感性关系研究

目的 :探索食管癌细胞株 EC/ CU HK1、EC/ CU HK1(As- )对三氧化二砷 (As2 O3 )促凋亡作用敏感性与细胞活性氧 (reactive oxygen species,ROS)水平的关系。方法 :以二甲萘醌(DMNQ)孵育 EC/ CU HK1、EC/ CU HK1(As- )细胞 ,双氢 -乙酰乙酸二氯荧光黄 (2 ,7- dichlorodihy-drofluorescein diacetate,DCFH- DA)及双氢罗丹明 12 3(dihydrorhodamine12 3,DHR)捕获 ROS,流式细胞仪检测两种细胞 ROS水平的差异。 As2 O3 单独或联用 DMNQ孵育 EC/ CU HK1、EC/ CUHK1(As- )细胞 ,流式细胞仪 Tunel法分析两种细胞凋亡敏感性的差异及其在用药前后的变化。结果 :EC/CUHK1的 ROS水平明显高于 EC/ CUHK1(As- ) ,DMNQ可提高 EC/ CU HK1、EC/ CU HK1(As- )的ROS水平 ,诱发 EC/ CUHK1(As- )对 As2 O3 的敏感性 ,增强 As2 O3 促 EC/ CU HK1(As- )细胞凋亡的效应。过氧化氢酶 (catalase)可逆转 DMNQ的效应。结论 :食管癌细胞株 EC/ CUHK1、EC/ CUHK1(As- )对 As2 O3 促凋亡的敏感性决定于细胞固有的 ROS水平     

三氧化二砷抑制人鼻咽癌细胞侵袭的体外实验研究

 目的 观察三氧化二砷(As₂O₃)对人鼻咽癌细胞株HNEl-LMPl侵袭、转移的影响。方法 鼻咽癌细胞在含3μmol／L的As₂O₃培养基中培养48小时。然后在无含砷的培养基中继续培养48小时后，收集此时间点贴壁的细胞作为研究对象；用细胞-基质黏附实验、细胞运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测As₂O₃对HNEl-LMPl细胞黏附、运动及侵袭能力的影响；用激光共聚焦的方法检测EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMPl)的表达情况。结果 肿瘤细胞-基质黏附实验结果显示，经As₂O₃处理的HNEl-LMPl细胞，其黏附能力(平均吸光度为0．524±0．09)低于对照组细胞(平均吸光度为0．665±0．14)，两者相比有差异(P<0．05)。运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭结果均显示，经As₂O₃处理后，穿过游离的聚乙烯吡咯烷酮膜(PVP-F)的肿瘤细胞数明显减少(P<0.01)，同时As₂O₃能够下调LMPl的表达。结论As₂O₃具有抗人鼻咽癌细胞株转移的潜力，其机制可能与抑制LMPl的表达相关。