登革2型病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用登革2型病毒参考株免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1000作用下进行融合,获得了10株分泌抗登革2型病毒单克隆抗体的杂交瘤。经间接免疫荧光鉴定,有4株杂交瘤产生的单克隆抗体对登革2型病毒是型特异的;2株对登革1型有交叉反应;1株对登革3型有交叉反应;1株对登革4型有交叉反应;另2株为黄病毒属特异的。经补体结合和血凝抑制试验鉴定,有2个单克隆抗体是黄病毒属血凝抑制特异的。这10个单克隆抗体对登革热的诊断是很有用的。     

用单克隆抗体快速鉴定登革病毒

用登革病毒参考株免疫的BALB/C鼠的脾细胞与SP2/O鼠骨髓瘤细胞融合,成功地建立了分泌抗登革1～4型病毒单克隆抗体的杂交瘤31株。经免疫荧光交叉鉴定,其中17株杂交瘤的抗体是属登革型特异的。用4个型特异的单克隆抗体对国内分离的12令登革地方毒株进行了免疫荧光的快速鉴定,获得了高度敏感高度特异的结果。证明获得的单克隆抗体可以作为免疫荧光诊断制剂,提供登革热病原的快速鉴定应用。     

登革4型病毒的单克隆抗体

用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与用登革4型病毒免疫的鼠脾细胞,在PEG—1000的作用下进行融合,获得了8株产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中5株杂交瘤产生的抗体,对登革4型病毒具有荧光型特异性,1株对登革1型病毒有交叉反应;另2株对登革2型病毒有交叉反应。对上述8株杂交瘤分泌的抗体又进行了补体结合、空斑抑制中和及血凝抑制试验的鉴定,结果有2株是补体结合型特异,另4株有低度的中和活性。然后用3个荧光型特异的单克隆抗体对5个地方毒株进行试用的结果,进一步验证了它们的特异性。上述杂交瘤稳定传代7个月后,冻存于液氮中。     

森林脑炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

用森林脑炎病毒森张株免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在融合剂PEG-1000的作用下进行融合,用间接免疫荧光法筛选,获得了6株分泌抗森林脑炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过免疫荧光交叉鉴定,6份单克隆抗体均与黄病毒属的登革4型病毒、流行性乙型脑炎病毒无属间交叉.与森林脑炎病毒COφ株、国内的森候株、森董株有交叉反应,属森林脑炎病毒种特异.6份单克隆抗体均无血凝抑制活性和补体结合活性.3株杂交瘤细胞培养上清浓缩物经抗鼠Ig免疫血清双扩鉴定为IgM.染色体数的检查为89～110条.6株杂交瘤细胞连续传代3～6个月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的单克隆抗体.     

登革病毒单克隆抗体鉴定及其血清学性质观察

利用补体结合试验(CF)和血凝抑制试验(HI)对83份免疫荧光阳性的登革病毒单克隆抗体进行了鉴定,11份CF阳性,8份HI阳性。登革1型和4型病毒的单克隆抗体仅有CF活性,其中4F_7和4F_9滴度达到1:20480～1:40960,并且为CF型特异。而登革2型和3型病毒的单克隆抗体,则仅有HI活性,除3D_4为HI型特异外,其余均为HI属特异,与其他黄病毒属抗原有明显交叉。     

利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系

目的:利用DNA免疫建立分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系,为研究E蛋白的结构和功能及其抗原表位提供新手段.方法:以构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,免疫BALB/c小鼠后将其脾细胞和SP2/0瘤细胞融合,通过IFA、间接ELISA和空斑减少中和试验对杂交瘤细胞系进行筛选和鉴定.结果:获得了4株分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系(2B4,6B4,4C10和2D5),它们结合的抗原表位均位于E蛋白Ⅲ区,其中4C10对登革2型病毒具有中和活性.这些单抗与登革1、3和4型病毒有强的交叉反应,但与黄病毒其他成员反应较弱.结论:DNA免疫法可用于分泌登革2型病毒E蛋白特异单抗的杂交瘤细胞系的建立,该结果有利于登革病毒E蛋白特异抗原表位的研究及新的登革病毒诊断试剂的研制.     

产生抗登革4型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

用登革4型H241株病毒免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得了5个产生抗登革4型病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞的上清液及小鼠腹水抗体均用间接免疫荧光法检测。其中两个杂交瘤细胞系产生的抗体对登革4型病毒具有型特异性,它们的荧光抗体滴度分别为1:10,240～1:20,480和1:2,560。另两个细胞系产生的抗体对登革2型病毒有交叉;另1个对登革1型病毒有交叉。     

登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～ 4型病毒复制的特异抑制作用     

登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定

目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础.方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pWSK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒.进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定.结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性.     

登革2型病毒株抗原分析

本文试用标记分析法研究我国海南地区3年来(1985～1987)流行的登革2(DEN-2)型病毒株抗原的变化.用3种单克隆抗体(黄病毒属特异、亚属特异及DEN-2型型特异)分析了8个DEN-2型流行株并与标准新几内亚B株进行了比较.发现5株与标准株类似,3株显示出明显差异.标记分析法为病毒抗原分析提供了一个简便快速的方法,并且可用来监测一个地区病毒株群的变化及新株的引入.     

脾内注射法免疫小鼠制备抗—HBc单克隆抗体的研究

用基因工程菌产乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对 Balb/c 小鼠脾内多点注射法免疫,将该鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞在 PEG 作用下融合,用固相放射免疫分析法(SPRIA)筛选,成功地获得了2株抗-HBc 阳性的杂交瘤细胞株。通过中和试验和交叉鉴定,2株抗-HBc 单克隆抗体只能与 HBcAg 起反应,而不能与 HBsAg 和 HBeAg 反应。经多次亚克隆后,所得腹水中的抗-HBc 滴度达1:64000～1:28000。这2株单克隆抗体做包被抗体检测 HBcAg 和(125)~Ⅰ标记查患者血清标本时,所测得的结果与人抗-HBc 多克隆抗体做包被或(125)~Ⅰ标记所测得的结果相一致。2株杂交瘤细胞连续传代3个多月,冻存复苏后仍能稳定地分泌特异的抗-HBc 单克隆抗体。     

1999年福建省暴发不明热病毒病原的分离与鉴定

目的：对１９９９年８月福建省福州市暴发的不明热的病毒病原进行分离与鉴定。方法：首先采用传代蚊细胞的微量培养方法进行病毒分离,并通过脑内接种途径观察对乳小鼠的致病性。然后经间接免疫荧光法和ＲＴ－ＰＣＲ技术对毒株进行型别鉴定。结果：患者恢复期血清标本中存在登革２型病毒特异抗体。从急性期血清标本中分离出１１株病毒,在传代蚊细胞中可产生稳定的细胞病变并驿乳小鼠致病。其基因组为登 革２型病毒特异的ＲＮＡ分子     

抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本文采用浓缩提纯的莱氏无胆甾原体做为抗原,多途径免疫 BALB/C 小鼠,取脾细胞与 SP_2/O-Ag~(14)小鼠骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗莱氏无胆甾原体单克隆抗体杂交瘤细胞。分析了杂交瘤细胞的染色体,平均数为103条;制备了腹水抗体,经 APAAP 法(碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶桥联酶标显色技术)和 IFA 法检测,抗体效价在80～320之间;对免疫球蛋白亚类进行了鉴定,其抗体均为 IgM。上述细胞经3～4个月稳定传代后,冻存于液氮中。该单克隆抗体的制备对细胞培养中支原体污染的检出可能有重要意义。     

我国两株登革2型病毒分离株结构蛋白C，PrM（M），E和非结构蛋白NS1基因变化的研究

对我国两株登革２型病毒分离株的结构蛋白Ｃ，ＰｒＭ（Ｍ），Ｅ和非结构公白ＮＳ１基目的核苷酸及相应的氯基酸序列进行分析，并与国外登革２型毒株的核苷酸序列同源性、碱基组成、糖基化位点、半胱氨酸残基、蛋白裂解位点和疏水剖面图等进行了比较分析。结果发现Ｄ２－４３和Ｄ２－０４株Ｃ—ＮＳ１基因的读码柜架基本相同，均由３３８１个核苷酸组成，编码氧基酸总为为１１２７，糖基化位点和保守的半胱氯酸残基的数目和位置均相同，但也发现两株之间存在一定的差异，它们的核苷酸序列同源性只有９３名％，氨基酸列的类似性为９１．３％。进一步对两个毒株各个蛋白的基囚分别进行比较，发现Ｃ和Ｅ基因同源性为９５％—９７％，ＮＳ１基因同源性为９２．２％，唯有ＰｒＭ（Ｍ）基目差异较大，同源性只有８６．７％。两株之间的主要差别在于ＰｒＭ（Ｍ）基目的变化。当与国外其他登革２型毒株比较时，发现存在两个可变序列，其中１５１—２９４位恰好是ＰｒＭ（Ｍ）区，与两株之间比较的结果一致。     

8－氮鸟嘌呤诱变3D_5杂交瘤细胞的初步研究

小鼠杂交瘤３Ｄ５为一株分泌抗人红细胞非凝集性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用８－氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）诱变处理可以使之成为具有模拟骨髓瘤性质的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺失的杂交瘤细胞系，并且保留杂交瘤细胞系分泌抗体的能力，在利用自身血细胞凝集试验对各种病原体的快速诊断中应用广泛。实验表明，用不同剂量的８－ＡＧ进行诱变，在不同剂量水平上３Ｄ５杂交瘤细胞主要呈现细胞生长抑制、部分细胞衰老死亡、存活细胞分裂生长成为多细胞克隆及细胞适应８－ＡＧ诱变后恢复正常生长能力等一系列的变化过程。利用间接免疫荧光方法检测３Ｄ５分泌抗体结果表明，诱变后３Ｄ５杂交瘤细胞株仍然保持有分泌抗人红细胞非凝集性单克隆抗体的能力，此细胞系的建立不仅为研制自身血细胞凝集试验的双功能抗体奠定了基础，同时也具有一定理论意义     

抗工程菌产HBcAg单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

本文用纯化的工程菌产HBcAg免疫Balb/C小鼠,将该鼠的脾淋巴细胞与鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下融合,获得2株抗-HBc阳性、与工程菌茵体蛋白无交叉反应的杂交瘤细胞系.2个亚株经体外培养两月余,传代20次,液氮反复冻存、复苏3次,仍能稳定分泌抗-HBc.该细胞接种经石蜡油致敏的Balb/C小鼠腹腔,产生抗-HBc腹水.其中1株经鉴定,其抗体亚类为IgG2a.     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

我国登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的特征

对我国1987年流行的登革2型病毒43株包膜E蛋白基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明登革2型病毒43株包膜E蛋白基因核苷酸序列含1485个核苷酸，编码495个氨基酸，并就其核苷酸序列及其相应的氨基酸序列与其它的登革2型病毒株进行了比较，发现核苷酸序列与我国1985年分离的登革2型病毒04株，新几内亚C株（NGC），牙买加株1409（JAM）和马来西亚当地流行株M1（登革出血热）、血2（登革休克综合征）、M3（登革热）同源性分别是95.8%、94.6%、97.5%、925%、92.7%和939%，氨基酸序列的同源性分别是94.3%、94.3%、96.0%、93.7%、93.7%和91.5%，推断出的氨基酸序列显示出12个保守的半胱氨酸残基和两个潜在的糖基化位点，分别位于Asn-67和Asn-153位。     

白细胞介素2与狂犬疫苗联合免疫小鼠的抗体动态观察

组织培养制备的狂犬病毒灭活疫苗与重组白细胞介素２同时免疫ＢＡＬＢ／ｃ鼠和Ｓｗｉｓｓ鼠，检测不同时间的鼠血清中抗狂犬病毒ＩｇＧ抗体和中和抗体效价。结果显示，在白细胞介素２的作用下，抗体产生的时间提前，抗体效价提高（Ｐ＜０．０１），ＢＡＬＢ／ｃ鼠和Ｓｗｉｓｓ鼠比较，前者的抗体效价更高（Ｐ＜０．０１）。说明白细胞介素２可以提高小鼠的体液免疫反应。