结核分支杆菌链霉素耐药的快速检测

【目的】探讨用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)方法快速诊断结核分支杆菌链霉素 (Sm)耐药的临床意义。【方法】用PCR SSCP技术检测了 30株Sm敏感的结核分支杆菌临床分离株 ,30株Sm耐药的临床分离株 ,以结核分支杆菌H37RV标准株作对照。先用PCR方法扩增rpsL基因 ,随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变。【结果】所有临床分离株均观察到rpsL基因PCR扩增产物。 30株Sm敏感的临床分离株与H37RV标准株呈现一样SSCP泳动条带 ,30株Sm耐药株中 19株有rpsL基因泳动异常 ,提示约有 6 3 %Sm耐药菌株有rpsL基因突变。【结论】本研究提示用SSCP方法容易鉴定出rpsL基因的点突变 ,PCR SSCP技术可作为快速鉴定结核分支杆菌Sm敏感性的有用工具 ,对结核分支杆菌Sm耐药的快速诊断有较大价值。     

应用PCR—SSCP检测结核分支杆菌链霉素耐药基因的研究

结核病耐药问题十分严重，传统的药敏实验需1～2月。Sm是一线抗结核药物，结核分支杆菌耐Sm最常见的分子机制是由于核糖体S12蛋白编码基因（rpsL）突变。该文应用PCR－SSCP分析了62个结核分支杆菌临床分离株的rpsL基因，以H37Rv标准菌株为对照，13个药物敏感菌株中12个rpsL基因未见SSCP异常；37个耐Sm株中，31个（83．8％）有rpsL基因泳动异常；12个耐其它抗结核药物林中，仅1个单链DNA泳动异常。因此，PCR－SSCP有希望成为简便、快速地检测结核分支杆菌耐药突变株的方法，弥补常规药敏试验的不足，指导临床治疗。     

结核分枝杆菌耐砒嗪酰胺pncA基因突变的检测

目的 了解青岛市结核分枝杆菌(MTB)耐砒嗪酰胺(PZA)分离株pncA基因的突变情况,探讨其与耐PZA之间的关系.方法 应用BacT/ALERT 3D培养系统对25例MTB临床分离株进行常规培养和药敏检测,通过PCR扩增pncA全长基因,DNA序列分析检测pncA基因的突变情况.结果 25株MTB临床分离株有22株扩增出含pncA全基因的序列,进行DNA序列分析表明有6例发生了pncA基因的突变,突变发生在pncA基因29、349、428、533、539、541位的核苷酸,并导致PZA酶氨基酸序列的改变.结论 pncA基因突变是青岛市MTB临床分离株耐PZA的分子机制之一.     

结核杆菌embB基因突变与临床治疗的关系

目的：了解结核菌耐乙胺丁醇药敏实验和embB基因突变情况，研究其临床应用价值。方法：通过聚合酶链反应(PCR)．单链构象多态性(SSCP)技术初步鉴定96株分支杆菌临床分离株的菌种，并进一步分析其embB基因。结果：分析56株分支杆菌临床分离株的16S rDNA SSCP电泳图谱均与结核分支杆菌标准株相同。21株药物敏感株的embB基因SSCP均泳动正常；35株耐乙胺丁醇分离株中，17侏(48．6％)embB基因SSCP泳动异常。结论：部分结核分支杆菌耐乙胺丁醇是由于其embB基因突变所致。且embB基因突变均发生在药敏实验高浓度区。     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的为了解新疆地区结核分支杆菌耐异烟肼（INH）分离株KatG基因突变情况，探讨其在INH耐药性中的可能作用。方法采用PCR和PCR—SSCP方法对60株结核分支杆菌临床分离株KatG基因突变进行检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，28株药物敏感株的KatG基因PCR扩增产物273bp片段28例SSCP图谱正常。32例耐INH分离株中KatG基因扩增均阳性，其中11株SSCP图谱异常，其敏感性为34．37％。结论新疆地区结核分支杆菌INH耐药株存在KatG基因突变，其突变对INH耐药性的影响有待于进一步研究。     

结核分支杆菌异烟肼耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：探讨快速检测结核分支杆菌异烟肼耐药的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测了20株异烟肼(INH)敏感的结核杆菌临床分离株，20株INH耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分支杆菌H37RV作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，20株INH耐药株中19株观察到katG基因扩增产物。以H37RV标准株为对照，20株敏感株SSCP带谱与对照相同；19株INH耐药株中8株与对照相同，11株有不同程度的差异，INH耐药katG基因突变或缺失的阳性率为60％。结论：多数结核分支杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致，用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

结核病临床标本中结核分支杆菌利福平耐药基因型的快速测定

目的：建立快速测定结核临床标本中结核分支杆菌RFP耐药性的方法，探讨其应用价值。方法：应用PCR－SSCP银染色法和EB染色法对58株结核分支杆菌临床分离株和17例临床标本的rpoB基因进行分析。结果：PCR－SSCP分析结核分支杆菌rpoB基因的敏感性为1～10PgDNA；通过SSCP图谱分析可特异检测结核分支杆菌的rpoB基因突变。32株RFP耐药株中30株（93．8％）发生rpoB基因突变，呈现四种类型的异常SSCP图谱；26株RFP敏感株中1株（3，8％）有rpoB突变。2例涂片阳性培养阳性结核性疾标本有rpoB基因突变，与常规药敏试验相符；5例涂片阳性培养阴性和10例涂阴培阴的结核性标本均未发现rpoB基因突变。结论：大部分结核分支杆菌RFP耐药性产生是由于其rpoB基因突变所致，采用PCR－SSCP方法可快速测定结核病临床标本中结核分支杆菌RFP耐药基因型。     

应用巢氏PCR-RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉素耐药基因型

目的：了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。方法：通过ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和巢氏ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析４０株结核分支杆菌临床分离株和１５例临床标本的ｒｐｓＬ基因突变的部位和性质。结果：１０株药物敏感株的ｒｐｓＬ双链泳动正常、并可被ＭｂｏⅡ消化;３０株耐ＳＭ分离株中,２５株双链泳动异常,２４株不被消化;１５例临床标本中,常规ＰＣＲ扩增７例ｒｐｓＬ阳性,巢氏ＰＣＲ１５例均阳性,４例ｒｐｓＬ双链泳动异常、并不被ＭｂｏⅡ消化。结论：通过常规ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＲＦＬＰ可快速检测结核分支杆菌耐ＳＭ分离株４３位密码子点突变,而通过巢氏ＰＣＲ－ＲＦＬＰ可直接检测大多数临床标本中结核分支杆菌ＳＭ耐药基因型。     

用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB, KatG, rpsL基因突变

目的：用PCR－SSCP技术检测肺结核患者痰及分离株结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，了解耐药分子机制及探索痰标本结核分支杆菌耐RFP，INH，SM直接检测的可行性，方法：对32例耐INH，RFP，SM肺结核患者临床痰标本及30株耐INH，RFP，SM结核分支杆菌临床分离株行PCR－SSCP方法检测rpoB,KatC,rpsL基因突变，结果：32份耐多药临床痰标本中rpoB,KatG,rpsL基因扩增产物SSCP其电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比，基因突变阳性分别为28／32，19／32，23／32，30例结核分支杆菌临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变阳性为28／30，18／30，22／30，结论：PCR－SSCP方法敏感，特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，适合于临床肺结构患者痰标本耐药性的快速检测。     

耐多药结核分支杆菌突变基因检测

目的：研究耐多药结核分支杆菌耐药分子机制,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法,方法：通过16S rRNA聚合酶链反应单链的构象多态性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)方法对30株耐多药分离株和20株药物敏感株进行初步分子菌种鉴定。通过PCR－SSCP分析30株耐多药结核病临床分离株的rpoB,katG,rpsL基因。结果：经16S rRNA PCR-SSCP菌种鉴定,所分析菌株均为结核分支杆菌;30株耐多药分离株经SSCP分析,56．7％存在rpoB基因突变,43．3％有katG基因突变,91．3％有rpsL基因突变,结论：rpoB,rpsL,katG基因突变分别是结核分支杆菌耐利福平,链霉素,异烟肼的分子机制,耐多药结核病是药物靶基因突变所致。通过PCR－SSCP可简便,快速地检测大部分耐多药结核病的耐药基因。     

耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

结核分支杆菌耐利福平耐药基因检测研究

目的评价应用DNA序列分析方法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用DNA序列分析法和PCR-SSCP法对80株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株32株,耐RFP或含耐RFP耐多药株48株)rpoB基因核心区域的突变情况进行检测.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,所有32株药物敏感株的rPOB基因均无突变.用DNA序列分析方法检测48株耐药株中44株发生突变,敏感性为91.7%(44/48),其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸.PCR-SSCP检测48株耐RFP分离株中,45株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为93.1%(45/48).结论DNA序列分析可指导临床用药,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性.     

结核分支杆菌耐药分子机制的检测技术的研究

目的：探讨结核分支杆菌对异烟肼、利福平耐药的分子机制，建立快速检测耐药分支杆菌基因型的分子生物学方法。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)同时检测结核分支杆菌敏感株和耐异烟肼、利福平耐药株的KayG基因、rpoB基因突变。结果：78株结核分支杆菌临床分离株均未发现KatG、rpoB基因缺失。以结核分支杆菌H37RV为对照，36株药物敏感株的KarG、rpoB基因SSCP图谱均正常。42株同时耐异烟肼和利福平的多耐药株中，KatG和rpoB基因突变率分别为66．7％(28／42)，90．5％(38／42)。结论：结核分支杆菌耐异烟肼、利福平耐药性的产生是由于KatG基因和rpoB基因突变所致。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

PCR-SSCP分支杆菌菌种初步鉴定方法的建立及其应用

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法：通过聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ,ＰＣＲ）－单链构象多态性（Ｓｕｉｎｇｌｅ－ｓｔｒｎｄｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｌｏｙｍｏｒｐｈｉｓｍ,ＳＳＣＰ）方法分析分枝杆菌１６ＳｒＲＮＡ,根据其电泳图谱与标准株的相似性进行菌种初步鉴定。结果：２９种分支杆菌标准株中,除结接分支杆菌、牛结核分支杆菌和卡     

结核分支杆菌rpoB基因突变和耐利福平的相关性研究

研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ分析结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因。结果显示ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因为属特异性。８１株结核分支杆菌的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ图谱与Ｈ３７Ｒｖ为对照,３５株敏感菌仅有一株位置有区别;４６株耐药菌有４２株有明显区别;检测阳性率为９１．３％;特异性９７．１％。证明ｒｐｏＢ基因突变是结核分支杆菌耐利福平的主要机理,ＰＣＲ—ＳＳＣＰ可简便快速地检出ｒｐｏＢ基因的突变,有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究。     

结核分枝杆菌异烟肝耐药基因突变的研究

目的：了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）分离株katG基因突变情况,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。方法：用PCR单链构象多态性（PCR－SSCP）和PCR直接测序法（PCR－DS）检测30株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因。结果：以结核分枝杆菌H37Rv标准株对照观察所有INH敏感株的PCR－SSCP和PCR－DS图谱,均未发现异常;而在12株INH耐药株中,有4株无PCR－SSCP和PCR－DS图谱异常,占INH耐药株的33．4％;有5株在94位发生核苷酸错义突变,占INH耐药株41．7％,有3株在96位发生核苷酸同义突变,占INH耐药株的25％。结论：多数结核分枝杆菌对INH是由于其katC基因突变所致,可先用PCR－SSCP筛选突变株,再用PCR－DS方法测定其突变位点,达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的研究

目的 :了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼 (INH)分离株katG基因突变情况 ,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。方法 :用PCR单链构象多态性 (PCR SSCP)和PCR直接测序法 (PCR DS)检测 30株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因。结果 :以结核分枝杆菌H3 7RV 标准株对照观察所有INH敏感株的PCR SSCP和PCR DS图谱 ,均未发现异常 ;而在 12株INH耐药株中 ,有 4株无PCR SSCP和PCR DS图谱异常 ,占INH耐药株的33 4% ;有 5株在 94位发生核苷酸错义突变 ,占INH耐药株 41 7% ,有 3株在 96位发生核苷酸同义突变 ,占INH耐药株的 2 5 %。结论 :多数结核分枝杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致 ,可先用PCR SSCP筛选突变株 ,再用PCR DS方法测定其突变位点 ,达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的     

四川地区结核分枝杆菌喹诺酮耐药基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机制,探索四川地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床分离株的耐药基因突变特征。方法 采用绝对浓度法检测结核分枝杆菌临床分离株的最小抑菌浓度(MIC),再通过聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和直接测序检测结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物临床分离株gyrA耐药决定区(QRDR)突变,并和标准株H37Rv比较。结果 68株临床分离株中,14株喹诺酮药物敏感株和8株低耐药株未发现gyrA耐药决定区基因突变,25株高耐药株、11株低耐药株和10株药物敏感株检测到gyrA基因突变,高耐药株突变率为100％,低耐药株突变率为58％,敏感株突变率为42％,总的突变率为68％。根据SSCP条带,gyrA突变可分成4种类型,测序发现分别为Ser95Thr、Asp94Gly、Ala90Val、Ala83Val突变。结论 结核分枝杆菌耐喹诺酮与gyrA基因突变密切相关,gyrA基因突变是耐喹诺酮结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。