人WWOX基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆人WWOX基因并构建其真核表达载体。方法:从人正常卵巢组织中提取总RNA,经逆转录聚合酶链反应扩增人WWOX基因,并构建其真核表达载体,经测序鉴定后转染人卵巢癌细胞系A2780。结果:成功克隆了人WWOX基因,与Genbank提供的序列(NM-016373)对比显示完全一致。真核表达载体pCMV-WWOX转染人卵巢癌细胞系A2780后,癌细胞的WWOXmRNA的表达水平显著增高(P<0.01)。结论:从人正常卵巢组织中成功克隆了人WWOX基因,为进一步研究WWOX在卵巢癌发生和进展中的作用及其靶向基因治疗奠定了实验基础。     

叶酸对缺氧大鼠神经干细胞Notch信号通路相关基因mRNA表达的影响

目的研究叶酸对缺氧大鼠神经干细胞(NSCs)增殖及Notch信号通路相关基因mRNA表达的影响。方法无血清培养基原代培养新生大鼠NSCs,细胞分为对照组(Control),缺氧组(Hypoxia),叶酸组(Folate)和叶酸缺乏组(Folate-D)。除Control组外,其余3组缺氧6h。增殖第7日收集细胞,MTT法检测细胞活力,实时荧光定量PCR检测Notch1、Hes1/5、Mash1和Ngn1/2基因mRNA表达。结果 Folate组细胞活力高于Hypoxia组,Folate-D组细胞活力低于其他3组(P<0.05);Folate组Notch1、Hes1/5mRNA表达高于Hypoxia组,Folate-D组该3个基因mRNA表达低于其他3组(P<0.05);Folate组Ngn1/2mRNA表达低于Hypoxia组(P<0.05);Mash1mRNA表达在各组间差别无统计学意义(P>0.05)。结论叶酸能促进缺氧损伤NSCs增殖,上调Notch信号通路中Notch1和Hes1/5基因表达。     

甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白HA1真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型流感病毒SwH1N1血凝素蛋白(HA1)的真核表达载体,并表达其编码蛋白HA1。方法利用RT-PCR技术扩增HA1基因,克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T-HA1质粒。双酶切pMD18-T-HA1与PXJ40后回收并连接回收片段,构建PXJ40-HA1真核表达载体,鉴定后转染293T细胞,用免疫印迹法(western-bolt)鉴定重组HA1蛋白的表达。结果实验成功构建HA1基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达出分子量为40kD的重组蛋白。结论成功构建的甲型流感病毒SwH1N1HA1基因的真核表达载体,可为后期的流感快速检测及基因工程疫苗的制备奠定良好的基础。     

人GSTM1TV2基因的克隆及温控表达

目的 克隆人GSTMlTV2基因并在大肠杆菌的温控高效表达。方法 用RT-PCR技术从人肺组织总RNA中分离扩增人GSTMlTV2基因的cDNA序列，将其插入到原核温控表达载体pBV220多克隆位点中，构建重组表达质粒，并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定，并进行了温控表达。结果 人GSTMlTV2克隆到原核表达载体pBV220中，测序结果同Genbank序列比较，完全一致。通过温控诱导，在26kDa的表达量约达到33％。结论 pBV220-GSTMlTV2原核温控表达载体的构建，为毒理学、遗传药理学的研究提供应用基础。     

H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达与免疫原性初步研究

目的利用真核表达载体构建H7N9禽流感病毒血凝素刺突茎部(HA2)的真核表达质粒,在293F细胞中表达HA2蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法根据pMD18-T-HA中的序列设计H7N9禽流感病毒HA2扩增引物,在下游引物中引入胰酶酶切位点;目的基因经特异性酶切位点克隆入自身带有Fc标签的pFUSE-IgG1-Fc1载体,构建重组质粒HA2-Fc;将重组质粒转染293F细胞,通过间接免疫荧荧光(IFA)和免疫印迹法(WB)鉴定HA2蛋白的表达和免疫原性。结果成功构建H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达质粒HA2-Fc,并在293F细胞中表达出分子量大约为50kDa的重组蛋白。IFA和WB显示该蛋白与抗H7N9病毒鼠多抗具有良好的免疫反应。结论成功构建表达HA2亚单位的真核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫原性,为筛选H7N9广谱疫苗候选分子、广谱中和抗体,及深入研究其致病机理和免疫机制奠定基础。     

靶向Nrf2基因microRNA表达载体构建及初筛

目的 利用真核表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP miR载体构建针对人Nrf2基因的微小RNA( microRNA)真核表达载体,为研究Nrf2基因在化学物毒作用提供参考依据.方法 设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列,构建重组载体并命名为pcDNA-Nrf2-A、pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcDNA-Nrf2-D,转染人乳腺癌MCF-7细胞;通过荧光显微镜观察绿色荧光监测转染效率,转染48 h后用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测瞬时转染细胞Nrf2基因mRNA和蛋白的表达变化观察沉默作用来初筛有效的重组载体.结果 成功构建miRNA真核表达载体pcDNA-Nrf2;转染效率约为20% ～40%;瞬时转染重组质粒48 h后,与空白对照和阴性对照质粒比较,pcDNA-Nrf2-A Nrf2 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05);pcDNA-Nrf2-B、pcDNA-Nrf2-C、pcDNA-Nrf2-D mRNA表达降低,差异有统计学意义(P ＜0.001),pcDNA-Nrf2-C抑制Nrf2基因mRNA表达强于pcDNA-Nrf2-D(P ＜0.05).结论 成功构建了Nrf2的microRNA表达载体pcDNA-Nrf2-C,可作为进一步研究Nrf2基因功能的工具.     

猪链球菌2型gdh基因的克隆与表达

目的 克隆表达猪链球菌2型诊断性抗原谷氨酸脱氢酶GDH. 方法 根据基因库中的gdh基因序列设计PCR引物,自病人分离株2007SF0165基因组扩增GDH的编码基因gdh,克隆至pMD19-T载体后进行测序分析,并且构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测. 结果 PCR法自猪链球菌2型菌株2007SF0165基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族Ⅰ的典型保守序列;构建筛选的原核重组表达质粒pGEX4T-2-gdh经诱导表达,获得蛋白相对分子质量为45 kDa目的蛋白. 结论 克隆并表达出猪链球菌2型诊断性抗原GDH,可为进一步研究奠定坚实的基础.     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及原核表达

目的 构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的重组质粒，进行原核表达。方法 以Hela细胞的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-B-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1，以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组蛋白进行分析。结果经核苷酸序列测序和sDS—PAGE法鉴定，成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌，并表达和纯化了sTNFR-MBP融合蛋白。结论成功地构建了人sTNFR1重组质粒克隆，表达并纯化了sTNFR1-MBP融合蛋白。     

H5N1型流感病毒M2蛋白全长编码基因的克隆与原核表达

目的:构建H5N1流感病毒基质蛋白M2基因的原核表达系统,为研究其在体液免疫中的作用奠定物质基础。方法:应用PCR方法从流感病毒H5N1cDNA中扩增出M2的全基因序列,插入至表达质粒载体pGEX6P-3上,构建重组原核表达质粒pGEX-6p-3/M2。重组质粒经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达M2蛋白后,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western Bloting分析。结果:PCR扩增的M2基因长度为297bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GeneBank公布的序列相似性达100%;SDS-PAGE和Westem Bloting分析显示,经IPTG诱导出分子质量为37.2 KD的目的蛋白。结论:成功构建了H5N1流感病毒基质蛋白M2原核表达载体pGEX-6p-3/M2,并在大肠杆菌中获得表达。     

硒对人脐静脉内皮细胞P38信号通路和环氧化酶-2表达的影响

环氧化酶 2 (COX 2 )在动脉粥样硬化发生中起重要作用。P38信号通路 (P38MAPK)是细胞信号传导的交汇点。硒作为一种抗氧化剂可延缓或消除动脉粥样硬化的形成 ,但机制尚不清楚。我们在体外模拟糖尿病状态 ,探讨糖尿病时存在的各种应激如高葡萄糖 (HG)、糖基化终末产物 (AGE)、高     

人分泌型内皮抑素基因的克隆及表达

目的获得人分泌型内皮抑素(endostatin)基因并在大肠杆菌中进行表达,为其应用于肿瘤的治疗奠定基础。方法合成含信号肽的上游引物,用聚合酶链反应技术克隆人分泌型内皮抑素基因,10 g.L-1琼脂糖凝胶电泳后回收将其重组入T载体,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列。定向克隆重组人pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α,42℃热诱导表达。结果经Gen-bank分析证实,所获得的645 bp基因片段序列正确。经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,与人内皮抑素蛋白大小相符合,表达量为14.5%。结论获得了人内皮抑素非融合重组蛋白。     

安徽省2株人感染H9N2流感病毒基因特征

目的 分析2015年安徽省2株人感染H9N2禽流感病毒分离株全基因组特征。方法 对安徽省2015年4月和9月流感监测网络实验室先后发现并确诊的2例H9N2禽流感病毒感染病例及其病毒分离株全基因组序列进行分析,使用Mega 6.0等软件解析2株H9N2毒株全基因组特征。结果 安徽省首次报道人感染H9N2禽流感病毒病例,对病毒分离株分析显示,其HA和NA基因与中国2013年禽间流行的H9N2病毒高度同源,属于A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)支系;而PB2和MP基因属于A/quail/Hong Kong/G1/97支系,与H7N9、H10N8和H6N2具有较高的相似度。氨基酸序列比对发现该2株病毒出现多个人易感倾向位点分子特征:HA蛋白发生Q226L、H183N和E190T突变,且HA裂解位点为PSRSSR\GL排列,NA蛋白茎部发生63~65位氨基酸缺失,M2蛋白S31N突变,以及PA-100A、PA-356R和PA-409N。结论 安徽省首次报道的人感染禽源H9N2流感病毒为H9N2系间重配病毒,存在多个人易感位点。     

周期型马来丝虫GAPDH部分编码基因原核及真核表达载体的构建

[目的]构建我国流行的周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)部分编码基因原核和真核表达质粒以及基因序列分析,为进一步的研究奠定基础。[方法]根据GeneBank中马来丝虫GAPDH基因的已知序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmGAPDH,经测序验证,并进行同源性比较。亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。[结果]RT-PCR扩增出一条约877 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%。转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的一致。[结论]成功构建了周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶部分编码基因原核及真核表达载体,为进一步功能研究提供了条件。     

HSV 2多功能蛋白ICP27真核表达载体构建及其在Vero细胞中的表达

目的构建单纯疱疹病毒2型（HSV 2） 多功能蛋白感染细胞多肽27（ICP27）真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并检测其在非洲绿猴肾细胞（Vero）中的表达。方法提取病毒株HSV 2333 DNA,用高保真DNA聚合酶对多功能蛋白ICP27基因进行高保真扩增,用双酶切连接至真核表达载体pCDNA3.0中。pCDNA3.0 ICP27经双酶切、测序验证,并通过脂质体介导质粒瞬时转染Vero 细胞,经RT PCR和Western blot检测ICP27蛋白的表达。结果pCDNA3.0 ICP27经双酶切可切出目的片段,测序结果经比对,与基因库中的序列完全一致。转染后经RT PCR 和Western blot检测,证实转染重组质粒组有ICP27蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到ICP27的表达。结论成功构建了HSV 2 多功能蛋白ICP27真核表达载体pCDNA3.0 ICP27,并能在Vero 细胞中表达。     

壬基酚对大鼠垂体和N2a细胞雌激素受体β表达的影响

目的 探讨壬基酚（nonylphenol, NP）对大鼠垂体组织及神经瘤母细胞（neuro-2a cells, N2a）中雌激素受体β(estrogen receptor β, ERβ)表达水平的影响。方法 （1）24只SD雄性大鼠随机分成4组,每组6只,分别为空白对照组（C,玉米油）,NP低剂量组（L-NP, 0.4 mg/kg）、中剂量组（M-NP, 4 mg/kg）、高剂量组（H-NP, 40 mg/kg）,空腹灌胃90 d后进行悬尾实验;（2）取大鼠垂体组织,高效液相色谱测定NP含量、免疫荧光检测ER β的表达水平;（3）0～200μmol/L NP细胞染毒后,显微镜下观察细胞,确定细胞实验的NP剂量;CCK-8法检测剂量浓度NP影响下N2a细胞的吸光度,免疫荧光检测N2a细胞ER β表达。结果 壬基酚可致大鼠不动时间延长（F=11.28, P<0.01）且随着染毒剂量的增加而增加。与对照组相比,各NP染毒组垂体ER β荧光强度变暗（F=6.335, P<0.05）;垂体NP含量与不动时间呈正相关（r=0.642, P<0.01）、与垂体ER β荧光表达呈负相...     

长沙市首例人感染H9N2禽流感病毒的分离及基因特征分析

2015年9月从来源于国家级流感样病例监测哨点医院的标本中分离出一株H9N2亚型禽流感病毒。为了了解病毒的来源、重组、变异及耐药等分子特征,本研究对这株病毒的神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)和基质蛋白(Matrix protein,M)基因进行测序及序列特征分析。结果显示长沙市人感染H9N2毒株的NA基因与A/duck/jiangxi/20147/2013(H9N2)禽源关系最近,遗传进化分支属于欧亚系中A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)分支。M基因与A/duck/wenzhou/YHQL64/2014 (H9N2)禽源关系最近,属于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分支。该病毒分离株的NA和M基因与2014年长沙市活禽环境中的H9N2病毒高度同源。影响NA蛋白功能的关键氨基酸位点相对保守,未产生与抗神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变;M2蛋白的第31位氨基酸由S突变为N导致病毒对金刚烷胺类药物耐药。因此,长沙市的人感染H9N2禽流感病毒有可能是来源于长沙市活禽环境中的H9N2病毒,它们是通过家禽贸易传播并发生病毒重配而产生。     

H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶基因特性研究

目的 了解H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变异规律 方法 采用狗肾传代细胞法对流感病毒进行分离培养,提取病毒RNA,逆转录-聚合酶链式反应,扩增NA基因后进行核苷酸序列测定.测序结果与WHO全球流感疫苗株序列进行氨基酸序列同源比对,并采用MEGA 4.0构建系统进化树,计算遗传距离.结果 NA氨基酸序列的...     

人DR5胞外区域克隆及在大肠埃希菌中表达

目的 克隆人死亡受体5(DR5)cDNA的胞外区域(eDR5),构建原核重组表达载体pGEX-eDR5,使eDR5在大肠埃希菌中表达。方法 采用RT-PCR(反转录PCR)方法从人肝癌细胞HepG2中获得eDR5,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段。经双酶切将目的基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,测序正确后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达GST-eDR5融合蛋白,最后用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白的表达量。结果 重组克隆载体pMD-eDR5经测序鉴定序列正确。构建的融合表达载体pGEX-eDR5在大肠埃希菌中表达,可溶性目的蛋白占细菌总蛋白约19%。结论 成功克隆了人DR5 cDNA的胞外区域,并在大肠埃希菌中表达。为下一步分离纯化人DR5重组蛋白,制作多克隆抗体提供基础依据。     

家蝇幼虫抗菌肽diptericin2基因的克隆及原核表达-鉴定

目的扩增出全长diptericin2基因,并构建表达pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白。方法运用经典的5′末端扩增法(5′-Full RACE)法,通过双酶切、连接反应,将目的基因片段定向插入到表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠埃希菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析diptericin2重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹实验(Western-blotting)对其进行了鉴定。结果获得目的片段468bp的家蝇抗菌肽diptericin2基因(GENBANK登录号FJ795370),双酶切鉴定及DNA测序结果显示,目的基因diptericin2已成功连接到表达载体pGEX-4T-1上,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为27 kDa。结论扩增出了全长diptericin2基因并成功构建pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白原核表达系统,融合蛋白以包涵体形式在大肠埃希菌BL21中表达,为下一步研究其生物活性打下初步的基础。