MAPK信号通路在铝致SH-SY5Y细胞死亡中的作用

目的研究铝致人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)死亡过程中MAPK信号通路的作用,探索铝致神经细胞死亡的机制。方法用4 mmol/L的Al Cl3·6H2O染毒SH-SY5Y细胞模拟铝致神经细胞死亡模型,用凋亡的特异性阻断剂z VAD-fmk(20μmol/L)抑制凋亡发生,用程序性坏死的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1,60μmol/L)抑制程序性坏死发生,用CCK-8检测不同组间细胞活力的变化,用流式细胞术检测凋亡率及坏死率的差异,用蛋白印迹法检测MAPK信号通路蛋白磷酸化水平的改变。结果与空白对照组、溶剂对照组、z VAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的细胞活力下降(P0.05);与染铝组相比,程序性坏死抑制组和凋亡抑制组的细胞活力上升(P0.05)。与空白对照组、溶剂对照组、z VAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率上升(P0.05);与染铝组相比,凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率下降(P0.05)。与空白对照组、溶剂对照组、z VAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组p38磷酸化水平升高,ERK磷酸化水平下降(P0.05);与染铝组相比,程序性坏死抑制组的p38磷酸化水平下降,ERK磷酸化水平上升(P0.05)。结论 MAPK信号通路中的p38和ERK信号通路参与了铝致SH-SY5Y细胞程序性坏死,ERK信号通路参与了铝致SH-SY5Y细胞凋亡,而JNK信号通路未参与铝致SH-SYSY细胞死亡。     

ERK和JNK/AP-1通路参与石英诱导的细胞周期改变

目的 探讨在石英刺激的人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblasts,HELF)中转录因子活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的活性改变,以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK),AP-1通路在石英诱导的细胞周期改变中的作用.方法 用200 μg/ml石英处理HELF细胞;用免疫荧光法检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regdated protein kinase,ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)蛋白磷酸化水平及细胞分布;运用AP-1荧光素酶报告基因技术检测AP-1荧光素酶活力;用MAPK显性失活突变体(dominant negative mutant,DN)(DN-ERK2、DN-JNKl和DN-p38)证明通路的上下游关系;用流式细胞术检测细胞周期变化.结果 用200μg/ml石英分别处理转染AP-1报告基因的细胞(HELF-AP-1)6、12、24h,结果显示,AP-1活性随着时间变化而发生变化,6 h活性增强,12 h活性达峰值,24 h活性略有降低;用200 μg/ml石英分别处理细胞1和2 h,结果显示,ERK和JNK在石英刺激1 h后,磷酸化水平升高,主要集中于胞浆,2 h后磷酸化水平进一步升高,并主要集中于胞核;200 μg/ml石英处理细胞24 h,G1期细胞所占比例从(63.80±9.57)%下降到(32.23±7.22)%,S期细胞所占比例从(35.17±10.33)%升高到(66.00±8.07)%;AP-1化学抑制剂姜黄素(20μmol/L)可明显减弱石英引起的G1期细胞比例减少和S期细胞比例增加;DN-ERK和DN-JNK的过表达均可明显降低石英诱导的AP-1活性增强,DN-p38的过表达对石英诱导的AP-1活性增强无明显影响.结论 200 μg/ml石英可诱导AP-1活性增强,并通过ERK、JNK/AP-1通路诱导细胞周期改变.     

丝裂原活化蛋白激酶通路正性调节苯并(a)芘所致细胞周期改变

目的 研究苯并（a）芘（BaP）对人胚肺成纤维细胞（HELF）的细胞周期分布及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号分子（ERK1／2、JNK1／2和p38）磷酸化水平的影响,并探讨MAPK磷酸化水平改变与细胞周期效应之间的关系。方法 用0．1、0．5、2．5和12．5μmol／L的BaP处理HELF细胞24h,用蛋白印迹方法检测ERK1／2、JNK1／2和p38蛋白激酶的磷酸化水平和蛋白总量的改变,利用流式细胞技术检测2．5μmol／LBaP处理24h后对HELF细胞周期的影响。结果 不同剂量BaP可明显提高ERK1／2、JNK1／2和p38蛋白激酶磷酸化水平;2．5μmol／LBaP处理24h,细胞周期分布与二甲基亚砜对照组相比,G0与G1期细胞数下降了11．9％（F=41．38,P〈0．01）,S期细胞数增加了17．2％（F=68．13,P〈0．01）;三种MAPK化学抑制剂（AG126、SP600125及SB203580）可明显抑制BaP处理引起的细胞周期的改变。结论 ERK1／2、JNK1／2和p38均参与了BaP所致细胞周期改变过程．并发挥币性调节作用。     

ERK和JNK/活化蛋白-1通路在苯并(a)芘诱导人胚肺成纤维细胞周期改变中的作用

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/转录因子活化蛋白-1(AP-1)信号通路在调控苯并(a)芘[B(a)P]致人胚肺成纤维细胞(HELF)周期改变中的作用。方法用AP-1荧光素酶报告基因技术检测AP-1荧光素酶活力,流式细胞术测定细胞周期时相分布,免疫印迹法检测MAPK[包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶]总量及磷酸化水平,用MAPK显性失活突变体(DN)(DN-ERK2、DN-JNK1和DN-p38)证明通路的上下游关系。结果2μmol/L B(a)P分别处理细胞0、6、122、4 h,AP-1活力在12 h达峰值,是对照组的2.22倍,差异有统计学意义(P<0.05);ERK1/2、JNK1/2和p38蛋白激酶的磷酸化水平明显提高,分别是对照组的2.5、14.0和2.1倍;B(a)P处理组S期细胞比例(50.2%±4.6%)与对照组(16.7%±8.1%)相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);ERK2和JNK1显性失活突变体的过表达均可明显降低B(a)P诱导的AP-1活力增强,并且明显降低B(a)P处理组S期细胞比例(分别为33.3%±1.7%,30.8%±3.9%),差异均有统计学意义(P<0.05);p38显性失活突变体的过表达对B(a)P引起的AP-1活力增强及S期细胞比例增加无影响。AP-1化学抑制剂姜黄素(20μmol/L)可明显降低B(a)P引起的S期细胞比例增加(13.6%±2.9%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ERK和JNK通过活化AP-1介导B(a)P诱导的细胞周期改变;而B(a)P诱导的AP-1活力增强及细胞周期改变与p38无关。     

石英致MAPK/cyclinD1-CDK4信号转导通路的活化

目的探讨石英诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)/细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin D1-CDK4)信号转导通路的活化。方法两种处理方式:(1)石英刺激细胞2h后,收获细胞;(2)石英长时间(2个月)作用于细胞,使细胞具有部分转化细胞的特征(S-HELF),检测信号蛋白因子和细胞周期的变化。分别采用Western blot、免疫细胞化学和流式细胞术方法检测细胞内信号蛋白和细胞周期的改变。选用特异化学抑制剂或分子抑制剂抑制上游激酶,检测下游激酶的变化。结果HELF暴露于石英粉尘2 h后,可以导致MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK1/2 3个亚家族的磷酸化水平升高。在S-HELF中,只有细胞外调节蛋白激酶(ERK)和C-Jun氨基末端激酶[JNK1(p46)]较未处理的HELF磷酸化水平增高,而JNK2(p54)的磷酸化水平没有变化,p38的磷酸化水平反而下降。cyclin D1和CDK4蛋白在S-HELF中较HELF中表达增多。抑制ERK和JNK活化或者抑制核转录因子活化蛋白1(AP- 1)的活化后,S-HELF中cyclin D1和CDK4蛋白过表达得到控制。而抑制p38的活性不能改变cyclin D1和CDK4蛋白过表达。结论石英刺激HELF2h后可诱导ERK、JNK和p38的活化,而S-HELF中ERK、JNK活化,p38没有被活化。S-HELF中,cyclin D1和CDK4蛋白质过表达与ERK、JNK和AP-1活化有关。     

丝裂原活化蛋白激酶信号途径在苯并[a]芘影响内皮细胞热休克蛋白70基因表达中的作用

目的研究丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号途径在苯并[a]芘(BaP)影响内皮细胞热休克蛋白70(HSP70)基因表达中的作用.方法猪主动脉内皮细胞以不同浓度BaP(0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L)染毒24 h,或以PD98059(10μmol/L)或SB203580(20μmol/L)预处理1 h后再加一定剂量的BaP共同孵育24 h.分别以Western-blot法检测各组细胞磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal regulated protein kinase,ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)、磷酸化p38和HSP70表达水平的改变.结果随BaP浓度的升高,MAPK途径的3种磷酸化激酶表达水平出现不同程度的改变,其中磷酸化ERK1表达改变最明显,呈剂量反应性增加.BaP抑制内皮细胞HSP70表达,在中、高剂量(≥1.0μmol/L)暴露时,HSP70表达明显低于对照组,差异有显著性(P＜0.05);尽管ERK途径抑制剂PD98059可部分减弱BaP对HSP70表达的抑制效应,但经PD98059预处理后内皮细胞HSP70表达水平仍明显低于正常状态下的表达水平,差异亦有显著性(P＜0.05).结论BaP可能通过ERK1途径而影响内皮细胞HSP70基因表达,同时可能还有其他信号途径在BaP影响HSP70基因表达过程中起作用.     

MAPK信号转导通路与神经损伤研究进展

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一种胞浆内广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在真核细胞中,由4条平行的信号转导通路组成。细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK 1/2)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和(或)应激活化蛋白激酶(SAPK)通路、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路和细胞外信号调节蛋白激酶5(ERK5)/大丝裂原活化蛋白激酶1(BM K 1)通路。近年来的研究发现M APK信号通路与神经损伤相关。ERK 1/2和p38在神经损伤的区域迅速磷酸化激活,减少神经损伤对机体带来的影响;磷酸化JNK在神经损伤部位聚集,促进神经细胞的凋亡,加重神经损伤的发生;ERK 5是细胞增殖与分化、器官发生与胚胎发育中不可缺少的信号蛋白,磷酸化ERK 5通过促进胰岛素在神经元中的表达促进神经细胞存活。除此之外MAPK各分子在不同刺激和不同疾病中的作用不同。     

尼古丁对PDLFs细胞MAPKs信号通路影响

目的探讨尼古丁诱导人牙周膜成纤维细胞(PDLFs)凋亡过程中丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的作用及作用机制。方法采用不同浓度的尼古丁(1、10和100μg/mL)作用于PDLFs细胞24 h后,使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定JAK 1、JAK 2、MAPKK、MAPK、JNK、p 38和ERK的基因表达水平;Western blot检测caspase-3蛋白的表达水平。结果浓度分别为1、10和100μg/mL的尼古丁作用于PDLFs细胞24 h后,JAK 1转录水平表达量分别为(65.17±8.45)、(106.17±22.22)和(115.50±8.12),JAK 2转录水平表达量分别为(103.00±13.13)、(118.17±13.17)、(159.00±13.74),MAPK转录水平表达量分别为(126.69±18.20)、(143.02±13.97)、(172.64±26.43),MAPKK转录水平表达量分别为(79.17±4.49)、(115.67±7.66)、(122.33±8.41),p 38转录水平表达量分别为(110.64±11.14)、(128.54±11.72)、(132.90±11.99),JNK转录水平表达量分别为(106.16±26.89)、(123.17±13.09)、(132.68±11.97),Caspase 3转录水平表达量分别为(131.52±19.85)、(144.76±13.87)、(153.59±13.85),Caspase 3蛋白翻译水平表达量分别为(128.33±13.50)、(144.00±12.53)、(153.00±12.77),与正常对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);随着尼古丁剂量的增加,这些基因表达均呈逐渐增高趋势;而ERK的表达水平则无明显变化。结论尼古丁通过介导p 38-MAPK和JNK-MAPK通路诱导人PDLFs细胞凋亡,并导致凋亡执行蛋白Caspase 3的表达增加。     

氯化镉对大鼠肾细胞内MAPK基因mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度氯化镉(CdCl2)对大鼠肾(NRK)细胞MAPK基因mRNA表达的影响.方法 应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度CdCl2(0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol/L)染毒24 h后对NRK细胞存活率的影响;应用带有SYBR Green Ⅰ的实时荧光定量PCR技术观察不同浓度CdCl2(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)对NRK细胞内MAPK基因(ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2)mRNA表达的影响.结果 以阴性对照组(CdCl2 0μmol/L)NRK细胞存活率为100%,各染毒组(CdCl25.0、10.0、20.0和40.0μmol/L)NRK细胞存活率分别为72.28%、39.95%、15.66%、10.39%,且与对照组之间差异有统计学意义(P<0.01),并存在剂量-效应关系,经CdCl2染毒后,各实验组(CdCl2 2.5、5.0和10.0μmol/L)NRK细胞的ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2基因的mRNA的相对表达量均低于阴性对照组(P<0.05或P<0.01).结论 CdCl2可能引起NRK细胞内MAPK基因mRNA的表达水平发生改变.     

PM_(2.5)对人脐静脉血管内皮细胞的损伤及黄芩苷的干预作用

目的探讨PM_(2.5)对人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)的影响及黄芩苷的保护作用及机制。方法于2015年3月采集广州城区雾霾天气时的大气PM_(2.5),以不同质量浓度(0、50、200、400μg/ml)染毒EA.hy926细胞24 h,检测细胞存活率、凋亡率、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及乳酸脱氢酶(LDH)活力、细胞内p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2蛋白表达。另外分别以黄芩苷(15、30、60μg/ml)和p38 MAPK通路特异性阻滞剂SB203580 20μmol/L预处理细胞,再加入200μg/ml PM_(2.5)染毒24 h,检测上述指标,探讨黄芩苷的干预作用及机制。结果与对照组比较,PM_(2.5)染毒后可降低EA.hy926细胞存活率和SOD活力,增加MDA含量及LDH活力,上调p-p38 MAPK蛋白表达及Bax/Bcl-2蛋白,差异均有统计学意义(P0.05);黄芩苷干预可增加EA.hy926细胞存活率和SOD活力,降低MDA含量及LDH活力,下调p-p38 MAPK蛋白表达及Bax/Bcl-2蛋白,差异均有统计学意义(P0.05)。结论黄芩苷可通过抑制p38 MAPK通路,减轻PM_(2.5)对EA.hy926细胞的损伤。     

二十二碳六烯酸联合5-氟尿嘧啶对人肝癌细胞HepG2耐药相关蛋白表达的影响

目的研究二十二碳六烯酸(DHA)联合5氟尿嘧啶(5-FU)对人肝癌细胞HepG2耐药相关蛋白ERK、JNK及p38的表达。方法 Western blot检测5-FU5μg/mL,或5-FU5μg/mL联合DHA30μg/mL作用HepG2细胞48h后ERK、JNK及p38蛋白表达。结果与单用5-FU组比较,5-FU联合DHA组对耐药相关蛋白的影响,p-ERK明显受到抑制,而p-JNK表达显著增加,p-p38表达无差别。结论 DHA对肝癌细胞耐药相关蛋白的调控可能通过抑制ERK、激活JNK信号通路来增强5-FU的细胞毒活动,发挥增敏化疗药物的作用。     

纳米氧化锌对小胶质瘤BV2细胞炎症因子及p38MAPK蛋白磷酸化的影响

[目的]探讨纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticle,nano-Zn O)对小胶质瘤BV2细胞炎症因子及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化的影响。[方法]不同质量浓度nano-Zn O(0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、50.0、75.0 mg/L)染毒小胶质瘤BV2细胞24 h,用MTT法测定细胞存活率后确定染毒剂量。以nano-Zn O(0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/L)染毒BV2细胞24 h,采用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞培养液上清液中LDH活性,ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌水平,Western blot法检测磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白水平并用Image J软件对蛋白条带灰度值进行分析。应用Spearman相关分析炎症因子分泌与p38MAPK蛋白磷酸化水平的相关性。[结果]随nano-Zn O染毒剂量的增加,BV2细胞存活率降低(r=-0.994,P0.001),细胞培养液上清液中LDH活性增加(r=0.749,P0.001)。与对照组相比,10.0、15.0、20.0 mg/L nano-Zn O染毒组TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平增加(均Ps0.05)。Western blot检测结果发现各染毒组p-p38MAPK蛋白表达水平增高,且与炎症因子分泌水平的变化趋势一致(r TNF-α=0.836,P0.001;r IL-6=0.539,P0.001;r IL-1β=0.659,P=0.008);20.0 mg/L nano-Zn O染毒组p-p38MAPK与p38MAPK灰度值的比值较对照组高,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]nano-Zn O可诱导BV2细胞炎症因子分泌水平和p38MAPK蛋白磷酸化水平增高。     

铜蓝蛋白在石英诱导的JNK/ERK/AP-1信号通路改变中的作用

目的探讨铜蓝蛋白(Cp)在石英诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中JNK/ERK/AP-1信号通路改变中的作用。方法分别在100μg/ml石英作用前1 h、同时和作用后1h加入30μg/ml Cp,同时设立单独用石英和单独用Cp处理以及不做任何处理的细胞组,刺激细胞24 h后,用噻唑蓝(MTT)比色法观察Cp对石英诱导的HELF细胞增殖的影响。用100μg/ml石英分别作用于HELF细胞、转染JNK显性失活突变体质粒的HELF细胞(DN-JNK)和转染ERK显性失活突变体质粒的HELF细胞(DN-ERK)24 h;用100μg/ml石英作用1 h后,加入30μg/ml Cp作用24 h;同时设立不做任何处理的对照组。用MTT法检测分别抑制JNK和ERK后对细胞增殖的影响;用蛋白免疫印迹(Western blotting)实验检测JNK、ERK、c-Jun、c-Fos及其磷酸化水平的改变。结果石英作用1 h后加入Cp,对石英诱导的细胞增殖有促进作用,后续的实验选择这种作用模式。Cp可以明显增加JNK、ERK蛋白及磷酸化ERK(pERK)、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和磷酸化c-Fos(p-c-Fos)蛋白水平。抑制JNK蛋白活性后,Cp诱导的p-JNK、p-c-Jun和p-c-Fos蛋白水平的增加被抑制,Cp、石英以及Cp和石英共同诱导的细胞增殖加快被抑制;抑制ERK蛋白后,Cp诱导的p-ERK和p-c-Fos的增加被抑制,Cp、石英以及Cp和石英共同诱导的细胞增殖加快被抑制。结论 Cp通过JNK/c-Jun和c-Fos及ERK/c-Fos通路进一步增强石英诱导的促细胞增殖作用。     

电磁辐射诱导PC12细胞凋亡中丝裂原活化蛋白激酶的差别激活

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导系统的差别激活与电磁辐射诱导PC12细胞凋亡的关系。方法以65mWcm2电磁波辐照离体培养PC12细胞20min,分为辐照后即刻及3、12、24h共4个观察时相点,采用流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率,采用蛋白质免疫印迹法检测ERK12、JNK、P38MAPK蛋白质磷酸化水平。结果电磁波辐照后即刻PC12细胞凋亡开始增加;3h后凋亡细胞进一步明显增多,凋亡率约为23.5%;12h后细胞凋亡率与3h相比,差异无统计学意义(P>0.05);24h后细胞凋亡再次明显增加,并达到高峰。电磁辐射后PC12细胞ERK12和JNK蛋白质磷酸化都明显增加,但ERK12的增加持续到3h,JNK蛋白磷酸化水平增高一直持续到12h,24h后两者都较对照组明显降低。P38MAPK蛋白质磷酸化水平在辐照后一直处于较高水平,其变化趋势呈双峰状,即在3h和24h出现2次磷酸化高峰。结论电磁辐射可以激活MAPK信号转导系统,但ERK12、JNK、P38MAPK表现为差别激活。MAPK信号转导系统可能参与了电磁辐射诱导的PC12细胞凋亡,正是MAPK这种差别激活才导致PC12细胞出现特有的凋亡变化形式。     

氯化镉对大鼠肾上皮细胞丝裂原活化蛋白激酶表达及其磷酸化的影响

目的 探讨氯化镉染毒大鼠正常肾上皮(normal rat kidney epithelial,NRK)细胞对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达及其磷酸化水平的影响.方法 应用不同剂量(0、1、5、10、20、40 μmol/L)氯化镉染毒NRK细胞24 h和同一剂量氯化镉(10 μmol/L)于不同时间(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h)染毒NRK肾细胞.采用蛋白免疫印迹法检测氯化镉染毒后NRK细胞中MAPK表达水平,并用磷酸化抗体检测MAPK磷酸化水平.结果 不同氯化镉剂量和不同染毒时间染毒NRK细胞,发现MAPK表达无明显改变,但MAPK磷酸化蛋白表达量较对照组升高.氯化镉浓度在10 μmol/L时p-ERK1/2表达明显,表达量为1. 00±0.06;20 μmol/L和40 μmol/L剂量组表达量分别为2.58±0.11、2.76±0.23,比10 μmol/L组高1.58倍和1.76倍,差异有统计学意义(F=827.70,P＜0.01);氯化镉浓度为20 μmol/L(2.47±0.20)和40 μmol/L(3.73±0.25)时p-p38MAPK表达量比对照组(1.00±0.02)高1.47倍和2.73倍,差异有统计学意义(F=280.06,P＜0.01).p-ERK1/2和p-p38MAPK表达量与氯化镉浓度存在剂量-效应关系(p-ERK1/2相关系数为r=0.919,t=4.69,P=0.009;p-p38MAPK相关系数为r=0.945,t=5.79,P=0.004).MAPK磷酸化蛋白表达水平也与染毒时间相关,p-ERK1/2在染毒1 h(1.26±0.11)时表达明显,染毒4 h(1.51±0.07)和8 h(3.53±0.23)时表达量是对照组(1.00±0.02)的1.5倍和3.5倍,差异有统计学意义(F=427.82,P＜0.001);p-p38MAPK在染毒1 h(1.31±0.07)时表达也明显增加,染毒4 h(3.53±0.32)和8 h(4.41±0.38)时表达水平是对照组(1.00±0.03)的3.5倍和4.4倍,差异有统计学意义(F=280.06,P＜0.001).结论 氯化镉染毒NRK细胞可引起MAPK蛋白磷酸化水平明显升高,可能与MAPK的激活有关.     

p38丝裂原激活蛋白激酶信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC高表达研究

目的探讨p38丝裂原激活蛋白激酶(P38)信号通路参与高渗应激诱导黏蛋白5AC(MUC5AC)高表达的作用机制。方法利用545、695、855、1055和1280mOsm/L高渗氯化钠溶液培养人气道上皮NCl-H292细胞。同时以1280m Osm/L高渗氯化钠为刺激因素,以P38特异性抑制剂SB203580、c-jun氨基末端激酶(JNK)特异性抑制剂SP600125及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)特异性抑制剂U0126为干预因素,采用RT-PCR技术及ELISA观察培养细胞MUC5AC转录水平和MUC5AC蛋白水平改变。采用Western blotting法检测1280mOsm/L高渗氯化钠培养上清液中细胞匀浆磷酸化P38(p-P38)、磷酸化JNK(p-JNK)及磷酸化ERK(p-ERK)蛋白水平。结果分别以545、695、855、1055和1280mOsm/L高渗氯化钠刺激后,培养细胞中MUC5AC mRNA及蛋白含量显著高于对照组(P0.01),且呈现出与渗透浓度相关的趋势。SB203580显著下调1280mOsm/L高渗氯化钠所致的p-P38含量升高,同时显著下调MUC5AC mRNA及蛋白含量(P0.05);SP600125则明显下调p-JNK的含量,并下调MUC5AC mRNA转录及蛋白含量(P0.05),但作用弱于SB203580;1280m Osm/L高渗氯化钠对ERK的含量无影响(P0.05),U0126对MUC5AC mRNA转录及蛋白含量也无明显影响(P0.05)。结论高渗应激可呈浓度依赖性地从转录水平诱导气道上皮细胞呈现黏液高分泌状态,且P38信号通路起主要作用。     

MAPK信号通路在PM2.5致JurkatT细胞细胞因子改变中的调控作用

目的探讨MAPK信号通路对交通相关PM2.5引起JurkatT细胞细胞因子变化的调控作用。方法应用Western-blot方法测定了交通相关PM2.5刺激JurkatT细胞不同时间的磷酸化JNK、P38MAPK和激活蛋白-1(AP-1)蛋白表达,ELISA方法测定了细胞上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)含量。结果 320μg/ml PM2.5刺激Jurkat T细胞24 h后,p-JNK/β-actin灰度比值显著高于生理盐水组,差异有统计学意义,P0.05。80μg/ml、320μg/ml PM2.5组p-p38MAPK/β-actin灰度比值均高于生理盐水组,差异均有统计学意义,P0.05。PM2.5染毒组分别加p-JNK拮抗剂SP600125和p-p38MAPK拮抗剂SB203580后,p-JNK/β-actin和p-p38MAPK/β-actin灰度比值均比正常染毒明显降低,以320μg/ml PM2.5剂量组显著。80μg/mlPM2.5刺激细胞6 h和24 h后,AP-1/β-actin蛋白灰度比值、细胞上清IL-1β含量均比生理盐水组增高,差异有统计学意义(P0.05),80μg/ml PM2.5刺激细胞3 h、6 h和24 h后,细胞上清TNF-α逐渐增高,有明显的时间效应趋势,且与生理盐水组差异有统计学意义(P0.05)。结论交通相关PM2.5可引起Jurkat T细胞炎症细胞因子TNF-α、IL-1β分泌增高,P38MAPK和JNK可通过AP-1调控TNF-α、IL-1β的释放。     

氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响

目的探讨氟暴露对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法自C57BL/6小鼠(6 ～ 8周)股骨分离、培养得到BMSCs, 取第3代细胞采用流式细胞术分析干细胞表面标志物。用氟终浓度分别为0.0、0.1、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L的培养基培养BMSCs, 检测不同浓度氟对BMSCs细胞增殖(CCK8法)、凋亡(流式细胞术分析)、成骨分化能力[茜素红及碱性磷酸酶(ALP)染色]的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白[聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)]、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路成员蛋白[细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2), c-Jun氨基末端激酶(JNK), p38及磷酸化ERK、JNK、p38(p-ERK、p-JNK、p-p38)], 成骨分化相关蛋白[Runt相关转录因子2(Runx2)、ALP]与Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路成员蛋白[糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)、磷酸化GSK3...     

双酚A对大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的 研究双酚A (bisphenol A,BPA)对离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)及相关凋亡基因表达的影响.方法 将睾丸支持细胞分别暴露于0(溶剂对照)、30、50、70 μmol/L的BPA.采用MTT法检测离体培养细胞活力,采用RT-PCR的方法检测p38 MAPK、caspase-3、FasL、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α) mRNA的相对表达情况,采用western-blotting的方法检测细胞中P38 MAPK、磷酸化P38 MAPK和caspase-3酶原蛋白的表达情况.结果 与溶剂对照组相比,30 μmol/L BPA组支持细胞p38 MAPK mRNA的相对表达量升高,而50 μmol/L BPA组p38 MAPK的表达明显降低(P＜0.05);各浓度BPA染毒组caspase-3mRNA的相对表达量均较高(P＜0.05);仅50 μmol/L BPA组TNF-α mRNA的相对表达量增加(P＜0.05);50、70 μmol/LBPA组FasL mRNA的相对表达量增加(P＜0.05);各剂量BPA染毒组总P38MAPK蛋白的相对表达量无显著变化;50和70 μmol/LBPA组磷酸化P38 MAPK蛋白的相对表达量均明显升高(P＜0.05);仅70 μmol/L BPA组caspase-3酶原蛋白的相对表达量下降(P＜0.05).结论 BPA可激活离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞p38 MAPK,并诱发caspase-3活化,导致细胞凋亡,这可能是通过FasL凋亡途径介导的.     

雷公藤甲素对PM_(2.5)损伤足细胞的保护作用

目的探讨PM_(2.5)对小鼠永生化足细胞(HSMPs)的损伤作用及雷公藤甲素(TPL)的保护作用及机制。方法将PM_(2.5)(0、20、200、400 mg/L)作用于HSMPs 24 h,以流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活力,以western blot法检测足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin)、B淋巴细胞癌2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)及p-p38 MAPK蛋白表达;分别加入TPL(0.5、2、4 mg/L)和p38 MAPK通路阻滞剂(25μmol/L SB203580)后,检测TPL的干预作用及机制。结果与对照组比较,200、400 mg/L PM_(2.5)可明显诱导HSMPs凋亡,HSMPs上清液LDH活力升高,HSMPs内Nephrin及Bcl-2蛋白表达降低,Bax及p-p38 MAPK蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P0.01)。与200 mg/L PM_(2.5)组比较,2、4 mg/L TPL可明显减少由PM_(2.5)诱导的HSMPs凋亡,降低HSMPs上清液LDH活力,降低HSMPs中Bax及p-p38 MAPK蛋白表达,增加Bcl-2蛋白表达,差异有统计学意义(P0.05或P0.01);与4 mg/L TPL组比较,加入SB203580干预可进一步减少由PM_(2.5)诱导的HSMPs凋亡,降低HSMPs上清液LDH活力,降低HSMPs中Bax及p-p38 MAPK蛋白表达,并增加HSMPs中Nephrin及Bcl-2蛋白表达,差异有统计学意义(P0.01)。结论 TPL可减轻PM_(2.5)诱导的HSMPs损伤,其机制可能与抑制p38 MAPK通路有关。