TNNI3K基因过表达诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的研究肌钙蛋白Ⅰ相关激酶(TNNI3K)对小鼠胚胎干细胞(m ESC)向心肌细胞分化的影响。方法从形态和细胞免疫荧光、碱性磷酸酶试验以及HE染色鉴定m ESC的多能性。采用悬滴法培养m ESC形成拟胚体(EB),自分化为跳动的心肌细胞,通过细胞免疫荧光和透射电镜(TEM)方法鉴定。慢病毒分别携带h TNNI3K基因和siRNA感染m ESC,并分别自分化为心肌细胞,通过流式细胞术(FCM)、细胞免疫荧光、Western blot等分析心肌特异性蛋白表达水平的差异。结果 m ESC表面蛋白分子SSEA-1和Oct-4表达呈阳性(绿色),ALP试验呈蓝紫色,核质比1。正常自分化的细胞免疫荧光显示cTnⅠ、cTnT、MLC2以及α-actinin阳性(绿色),肌节清晰可见。TEM显示心肌细胞独有的肌纤维亚细胞结构。过表达组cTnT+阳性细胞率高于对照组,Western blot显示心肌特异性蛋白cTnT、cTnⅠ、MLC2、α-actinin等显著高于对照组,且细胞免疫荧光结果显示MHC6蛋白提前表达。干扰组不仅cTnT+阳性细胞率显著低于对照组,而且心肌特异蛋白也显著低于对照组,MHC6蛋白表达延后。结论TNNI3K基因能增强心肌细胞的生成,促进m ESC向心肌细胞的分化。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）是指从桑葚胚或附植前囊胚内细胞团分离的多潜能细胞,具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在过去的20余年中,随着对干细胞特征认识的加深,ES细胞已展示出很好的应用前景。Es细胞能够在体外不断自我更新并保持未分化的特性,在生长因子及某些药物的诱导下能够分化为心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞、肝细胞及内皮细胞等3个胚层来源的各种体细胞。因此,Es细胞成为研究组织特点及功能、药物筛选及毒性实验、细胞移植替代治疗的理想供体细胞。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化机理的研究现状

目前有多种细胞可用于心肌细胞移植,其中胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)具有其独特的优势,因为由ES细胞向心肌细胞分化,经历了从早期前体心肌细胞,向终末分化成熟心肌细胞过渡的整个过程,是研究心肌细胞分化机理的良好模型.由胚胎干细胞分化为成熟心肌细胞,是在时空水平上多个细胞相互作用的结果,涉及细胞内复杂的基因调控过程.以下就胚胎干细胞向心肌细胞分化的细胞内外调控机制的研究现状加以综述.     

胚胎干细胞向心肌细胞分化机理的研究现状

目前有多种细胞可用于心肌细胞移植，其中胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)具有其独特的优势，因为由ES细胞向心肌细胞分化，经历了从早期前体心肌细胞，向终末分化成熟心肌细胞过渡的整个过程，是研究心肌细胞分化机理的良好模型。由胚胎干细胞分化为成熟心肌细胞，是在时空水平上多个细胞相互作用的结果，涉及细胞内复杂的基因调控过程。以下就胚胎干细胞向心肌细胞分化的细胞内外调控机制的研究现状加以综述。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化中内皮细胞的作用

目的:研究胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,内皮细胞与心肌细胞之间的功能性联系. 方法:通过检测CGR8-GFP小鼠胚胎干细胞系心肌α-肌球蛋白重链(α-MHC)荧光蛋白表达情况变化,观察抑制内源性内皮细胞、添加外源性内皮细胞以及两者并存情况下,胚胎干细胞分化所得心肌细胞数量的变化. 结果:(1)在胚胎干细胞分化过程中,加入外源性内皮细胞后,心肌细胞形成明显增多.(2)特异性抑制内源性内皮细胞,心肌细胞形成明显减少.(3)外源性内皮细胞与胚胎干细胞共培养能够部分挽救由于内源性内皮细胞抑制所导致的心肌细胞形成障碍. 结论:在胚胎干细胞分化过程中,内源性内皮细胞对于促进心肌细胞形成起着至关重要的作用,是形成心肌细胞发育微环境的关键因子.在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,外源性内皮细胞可以刺激心肌细胞形成,从而得到大量心肌细胞,具有潜在的临床应用价值.     

小鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞分化的研究

目的：小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）体外定向心肌细胞分化模型的建立。方法：通过悬滴培养技术定向诱导ES细胞分化为拟胚体,进而分化为心肌细胞,并用RT－PCR对四种肌肉肌动蛋白在EBs中的表达进行了鉴定。结果：在拟胚体和进一步分化的ES细胞中观察到自发节律性收缩的心肌细胞,α－平滑肌肌动蛋白（血管和胃肠道平滑肌）以及纹状肌肉肌动蛋白（心肌和骨骼肌）在这些心肌细胞样的细胞中均能表达。结论：小鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞分化模型的建立,可用于研究相关基因在心肌发育过程中的直接或间接作用,有助于胚胎干细胞衍生的心肌细胞用于临床治疗作用的研究。     

诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究进展

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过重编程体细胞而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。iPSCs向心肌细胞分化是一种使心肌细胞再生,治疗心肌梗死、心力衰竭等相关疾病的一种新兴技术。本文通过对近年来发表的iPSCs向心肌细胞分化的相关文献的整理、总结和分析,介绍近年来iPSCs及其向心肌细胞分化的相关研究进展、所面临的问题以及未来的发展方向。     

体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化

长期以来人们一直在研究心肌再生的可能性。人工诱导多功能干细胞由于其在跨越了胚胎干细胞所面临的医学伦理学问题的同时具有多分化潜能而成为人们研究的热点。在体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的试验中,研究者对细胞进行向心肌细胞分化的诱导,检测其分化效率;对分化的心肌细胞进行基因、蛋白水平的验证,并对细胞电生理特性进行比较分析,发现其与正常心肌细胞在各个方面均相似。这些研究为寻找心肌损伤后心肌细胞再生提供了理论基础,并为人们研究心肌细胞在疾病病因学、明确药物效能以及最终的患者特异性治疗方面有广泛的应用价值,为转化医学提供了前景。     

间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导研究

间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞,能在多种诱导条件下形成心肌细胞。化学因素:化学小分子可以通过改变间充质干细胞DNA甲基化和组蛋白修饰(乙酰化、甲基化和磷酸化等)等表观遗传特性;物理因素:电磁场和力学因素可以诱导间充质干细胞;生物因素:生长因子、激素等对心肌细胞的发育起着重要作用等这些诱导条件,在体外环境下成功诱导间充质干细胞分化为心肌细胞。该文阐述不同的诱导条件对间充质干细胞向心肌细胞分化的影响和相关机制。     

Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响

目的：观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）心肌细胞分化的影响。方法：用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体（embryoidbodies,EBs）。用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk一1观察对搏动EBs百分率的影响。用RT—PCR检测Nk同源异型盒5（Nkx2．5）、锌指转录因子-4（GATA．4）、B．肌球蛋白重链（[~-MHC）及心房钠尿肽（ANP）基因表达水平的变化。用Westernblot检测cTnT表达水平的变化。将不加入Wnt3a,分化第0—5天及5～lO天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5．10组。加入Dkk．1的组命名为Dkk．1组。结果：通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。EBs形成过程中即分化第0—5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2．5、GATA4、B．MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5—10天加入Wnt3a的结果相反。分化第5—10天加入Dkk．1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0—5天分别加入Wnt3a及Dkk．1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高。结论：Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞。     

Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响

目的:观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)心肌细胞分化的影响。方法:用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体(embryoid bodies,EBs)。用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk-1观察对搏动EBs百分率的影响。用RT-PCR检测Nk同源异型盒5(Nkx2.5)、锌指转录因子-4(GATA-4)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)及心房钠尿肽(ANP)基因表达水平的变化。用Western blot检测cTnT表达水平的变化。将不加入Wnt3a,分化第0~5天及5~10天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5-10组。加入Dkk-1的组命名为Dkk-1组。结果:通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。EBs形成过程中即分化第0~5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2.5、GATA4、β-MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5~10天加入Wnt3a的结果相反。分化第5~10天加入Dkk-1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0~5天分别加入Wnt3a及Dkk-1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高。结论:Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞。     

绿色荧光蛋白标记的小鼠胚胎干细胞系的建立及向心肌细胞分化

目的建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent prote in,GFP）的小鼠胚胎干细胞系,并诱导其向心肌细胞分化。方法质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染小鼠胚胎干细胞,经G418筛选后选取GFP强阳性克隆进行扩增建系。对稳定表达GFP的胚胎干细胞系进行畸胎瘤形成检测,观察其多向分化潜能。诱导GFP阳性胚胎干细胞向心肌细胞分化。免疫荧光及RT-PCR检测心肌细胞特异性标志物。结果转染后胚胎干细胞经20次传代后仍然表达GFP,裸鼠皮下接种胚胎干细胞后3050 d均可形成畸胎瘤。GFP阳性胚胎干细胞成功向心肌细胞分化。结论成功建立表达GFP的小鼠胚胎干细胞系,并可诱导其向心肌细胞分化。     

体外诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

间充质干细胞是近年来一类倍受人们关注的干细胞,它有望成为心脏组织修复工程最理想的种子细胞。多项研究表明,间充质干细胞能在体外被诱导分化为心肌细胞,但是与其分化的相关因素和分化机制还需要进一步的研究探讨。     

维生素C联合内皮素-1促进胚胎干细胞向心肌细胞分化及机制

目的探讨维生素(Vit)-C联合内皮素(ET)-1对胚胎干细胞(ESC)向心肌细胞分化的影响及其可能机制。方法体外培养ESC并给予Vit-C,摸索Vit-C作用于ESC的最佳浓度和干预时间;然后给予ET-1(100 nmol/L)或Vit-C(100μmol/L)+ET-1(100 nmol/L),观察两组对拟胚体搏动、Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达的影响。同时,以RNA干扰方法沉默Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达,观察沉默相应启动子表达水平后对Vit-C联合ET-1介导的拟胚体搏动增加的影响。结果 Vit-C最佳作用浓度为100μmol/L,最佳干预时间为分化的第4~9天,可使拟胚体搏动增加11.19%,同时上调拟胚体中心肌细胞标志物c Tn T以及心肌发育启动子Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达。在Vit-C基础上进一步给予ET-1,可进一步使拟胚体搏动增加11.07%,同时进一步上调c Tn T、Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达水平。沉默Shox2基因表达使拟胚体搏动幅度减少最明显,达12.94%。结论 Vit-C联合ET-1可获得进一步纯化的心肌细胞,上调Shox2是其促进ESC分化的最重要机制。     

人诱导多潜能干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的探究通过阶段性调控经典Wnt信号通路促使人诱导多潜能干细胞向心肌细胞分化。方法采用阶段性激活或抑制Wnt信号通路的方案使人尿路上皮细胞来源的多潜能干细胞(U1细胞系)定向分化为心肌细胞,在分化第14天,采用流式细胞术检测U1细胞向心肌细胞分化的效率,利用免疫细胞化学检测心肌细胞肌钙蛋白表达,通过激光扫描共聚焦荧光显微镜检测人诱导多潜能干细胞来源的心肌细胞(hiPSC-CMs)的Ca²⁺活动,利用全细胞膜片钳技术记录hiPSC-CMs的电生理特性。结果 U1细胞系向hiPSC-CMs分化的效率为(88±3)%;全细胞膜片钳技术记录的动作电位特征显示hiPSC-CMs可分为心室肌样细胞、心房肌样细胞和窦房结样细胞,其中主要是心室肌样细胞。窦房结样细胞的比例、动作电位时程、动作电位幅度及最大去极化速率均明显小于心室肌样细胞和心房肌样细胞。结论阶段性调控Wnt信号通路能促使hiPSCs定向分化为hiPSC-CMs,并且hiPSC-CMs具有哺乳动物心肌细胞相似的电生理特征。     

机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究

目的研究机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化效率的影响。方法诱导多能干细胞形成拟胚体后将拟胚体分为四组:对照组(未行牵张处理),牵张组1(5-6天行24小时牵张),牵张组2(5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张),牵张组3(5-6天行24小时牵张,7-10天再行72小时牵张),通过对小鼠诱导多能干细胞施加20%形变率的机械牵张力后,于第15天,分别计数每组跳动克隆数目从而初步在上述四组中选出诱导效率最高组,此后用荧光免疫染色、Westernblot、RT-PCR和激光共聚焦法,进一步鉴定对照组和初步筛选出的牵张组最终分化效率和细胞成熟度差异。结果机械牵张刺激下,分化15天时,牵张组2的跳动克隆数上升(P<0.05),初步筛选出牵张组2可以提高分化效率;统计α-MHC免疫荧光染色面积发现牵张组2是对照组的2.1倍(P<0.05);牵张组2TroponinI的蛋白表达量为对照组的1.7倍(P<0.05);半定量PCR结果发现,心肌细胞标志基因β-MHC,MLC-2v及心肌细胞早期转录因子Nkx2.5的表达量分别提高了6.7倍、4.4倍和11.4倍(P值均<0.05);激光扫描共聚焦显微镜对分化来的单个心肌细胞进行α-actinin观察发现,牵张组2有利于心肌细胞的伸展和成熟。结论初步验证机械牵张力作为一种刺激诱导因素,20%拉伸形变率,牵张组2(贴壁的拟胚体5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张)的处理方法可以显著促进诱导多能干细胞向心肌细胞的分化效率,为以后的深入研究和临床应用提供了实验基础。     

诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 观察乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB 、5-氮胞苷(5-aza)及SalB联合5-aza体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.方法 分离培养及鉴定大鼠MSCs,培养乳鼠心肌细胞,收集条件培养液对其进行分组诱导:①SalB(终浓度为250 μg/L),②5-aza组(终浓度为10 μg/L),③SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L),④乳鼠心肌细胞条件培养液,⑤未加诱导剂的阴性对照组.选取MSCs进行诱导,诱导周期为4 w.倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4 mRNA的相对表达量.结果 细胞形态学显示,诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示,诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组和条件培养液两组蛋白表达较低,SalB联合5-aza组蛋白表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示除阴性对照组外,其他四组表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他三组.结论 SalB联合5-aza诱导MSCs表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT;上调心肌早期基因NKX2.5、GATA-4mRNA的表达,证实其能够向心肌细胞分化能力;条件培养液不能上调心肌细胞的早期基因和蛋白,不能诱导其分化.     

半固体凝胶介质诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

目的利用半固体凝胶介质诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌细胞分化,确立一种基于物理特性的心肌细胞诱导分化方法。方法原代分离培养和鉴定BMSCs。以DMEM培养基和低熔点琼脂糖按不同配比配制成6.4%、3.2%、1.6%、0.8%、0.4%和0.2%6种物理密度基质,将BMSCs培养于上述基质。RT-PCR方法检测细胞分化标记基因心肌特异性基因肌球蛋白重链α(α-MHC)和抗小鼠心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)的mRNA水平;细胞免疫荧光方法检测cTnT和α-MHC的蛋白质表达情况。结果 RT-PCR结果显示BMSCs中cTnT mRNA表达峰值出现在物理密度为1.6%的培养基质中,而α-MHC的峰值出现在物理密度为3.2%的培养基质中。细胞免疫荧光结果显示BMSCs在不同密度基质中培养时表达cTnT和α-MHC的总体趋势与RT-PCR结果一致。结论利用半固体凝胶介质可实现将BMSCs向心肌细胞诱导分化。     

血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法采用悬滴培养法,分别以10、20、50 ng/ml的VEGF对iPSCs细胞进行诱导分化,自然分化作为阴性对照组,加入1%二甲亚砜诱导剂为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞生长情况,记录跳动的拟胚体出现的时间和数目,计算心肌细胞分化率,细胞免疫荧光检测心肌细胞cTnT的表达,RT-PCR检测心肌发育基因α-MHC和β-MHC mRNA的表达。结果与自然分化组相比,三个浓度组的VEGF均可提高iPSCs的心肌细胞分化率(P<0.05),浓度为20 ng/ml时,iPSCs的心肌细胞分化率最高;与二甲亚砜组相比无统计学差异(P>0.05)。分化的心肌细胞可自发搏动,同时表达心肌特异蛋白cTnT和调控心肌发育的基因α-MHC和β-MHC;VEGF可上调α-MHC和β-MHC的表达(P<0.05)。结论 VEGF可以促进诱导iPSCs向心肌细胞分化。     

骨髓干细胞向心肌细胞分化的研究现状

心肌细胞在生理和病理状况下存在细胞增殖现象。骨髓干细胞被认为是再生心肌细胞的来源之一。骨髓细胞不论是全髓细胞、造血干细胞，还是间质干细胞，体内移植都可向心肌细胞分化，在一定程度上改善心功能。体外诱导不仅可出现心肌细胞表型，还表达功能性受体。