选择性杀伤CEA阳性结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体的构建及应用

目的 构建能选择性杀伤表达癌胚抗原（CEA）的结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体。方法 PCR扩增CEA基因5’端调控序列,构建以EGFPLuc作为报告基因的表达质粒pCEA-EGFPLuc。利用脂质体将pCEA-EGFPLuc导入CEA阳性和阴性细胞中,通过检测增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达和荧光素酶（luciferase）活性,评价CEA启动子活性。构建由CEA 启动子调控的E1A,并携带HSVtk基因的条件复制型腺病毒Ad.CEA-E1A/CMV-TK,分别感染CEA阳性肿瘤细胞（Lovo和SW620）和阴性肿瘤细胞（HeLa）,通过E1A表达和细胞存活率检测,评价该病毒对CEA阳性肿瘤细胞的选择性杀伤效果及联合应用环氧鸟苷（GCV）后的协同效应。结果 CEA启动子具有较好的选择性和较高的活性。Ad.CEA-E1A/CMV-TK只在CEA阳性的肿瘤细胞中表达E1A。感染Ad.CEA-E1A/CMV-TK后,Lovo和SW620细胞的存活率分别为（36.72±2.49）%和（39.82±4.76）%,均显著低于HeLa细胞的（87.44±2.76）%（P<0.01）;联合GCV对Lovo和SW620的杀伤效果增加,细胞存活率分别为（17.26±3.65）%和（23.93±5.40）%,显著低于未加GCV的（36.72±2.49）%和（39.82±4.76）%（P<0.01）。结论 由CEA调控复制的Ad.CEA-E1A/CMV-TK对CEA阳性的结直肠癌细胞具有选择性杀伤作用,联合GCV后杀伤效果明显增强。     

KDR-CDglyTK融合基因系统对结肠癌细胞增值的影响

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人结肠癌细胞SW620增值的影响.方法 重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SW620细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciciovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine).观察该体系对SW620细胞生长增值的影响.结果 携带双自杀基因(CDglyTK)和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SW620和LS174T细胞中有GFP表达.已转染腺病毒的SW620和LS174T细胞同未转染的各自细胞在细胞生长方面无显著性差异(P>0.05).在前药应用下,已转染腺病毒的SW620和LS174T细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SW620细胞对前药具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01).融合基因的疗效优于单一自杀基因(P<0.01).结论 KDR基因启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人结肠癌SW620细胞,抑制其增值.     

靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK构建的初步研究

目的 构建由癌胚抗原启动子(CEA promoter,Cp)驱动的靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK,并观察其在CEA阳性大肠癌细胞中专一性表达和对增殖的影响.方法 采用PCR分别扩增出Cp、CD、TK三种目的 基因并采用双酶切、连接依次将Cp、CD、TK基因插入pcDNA3.1(-)质粒;将靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK分别转染CEA阳性的人大肠癌SW480细胞和CEA阴性的Hela细胞,采用RT-PCR检测CD-TK基因的表达.用MTT法检测转染pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK后的SW480细胞对化疗前药5-氟胞嘧啶(5-Fc)和丙氧鸟苷(GCV)的敏感性.结果 Cp基因片段、CD基因片段和TK基因均克隆正确.靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK经凝胶电泳和DNA测序证实构建正确.转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞经过RT-PCR鉴定证实有CD-TK基因的表达,CEA阴性Hela细胞则没有CD-TK基因的表达.细胞培养试验中,转染了靶向性载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK的SW480细胞对前药5-Fc和GCV敏感.结论 正确构建了靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK,靶向性双自杀基因治疗载体pcDNA3.1(-)Cp-CD-TK能够使CD-TK基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向杀伤大肠癌细胞目的 .     

pAdKDR/CD/TK自杀基因系统对大肠癌SW480细胞体外杀伤作用的实验研究

目的研究腺病毒介导的KDR/CD/TK双自杀基因系统对大肠癌SW480细胞的杀伤作用。方法构建pAdKDR/CD/TK重组腺病毒,采用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒感染大肠癌SW480细胞、ECV304细胞及LS174T细胞,再加入不同浓度前药（GCV、5-FC）培养后,以MTT法检测细胞生长抑制率,观察重组腺病毒联合GCV和5-FC对大肠癌SW480细胞、ECV304细胞和LS174T细胞的杀伤作用,了解前药GCV、5-FC、GCV/5-FC对3种细胞的杀伤作用及KDR启动子的靶向杀伤作用。结果 pAdKDR/CD/TK重组腺病毒对3种细胞具有相似的感染率,感染腺病毒的3种细胞中除LS174T细胞外,均检测到目的基因的表达。当转基因细胞的比率为50%时,SW480和ECV304细胞分别有（31.3±5.64）%、（33.5±5.4）%的存活,而LS174T细胞存活率仍为（98.1±0.95）%（P均〈0.01）。单用GCV浓度为80μg/ml时,SW480细胞、ECV304细胞、LS174T细胞的生存率分别为（45.6±6.5）%、（45.9±5.4）%、（99.5±4.7）%,单用5-FC浓度为1000μg/ml时,三者生存率分别为（40.4±5.8）%、（45.3±4.7）%、（97.0±6.2）%,联合用药（80μg/ml＋1000μg/ml）时,三者生存率分别为（20.5±0.46）%、（25.6±1.33）%、（97.3±3.96）%。联合用药分别与GCV及5-FC单独用药生存率比较,差异均有统计学意义（P均〈0.05）。提示单独应用GCV及5-FC对SW480细胞、ECV304细胞有较强的杀伤作用,联合用药效果更佳。结论含KDR启动子的融合基因,具有选择性杀伤作用。前药GCV、5-FC对转染融合基因的大肠癌SW480细胞具有体外抑制作用,且有较强的旁观者效应。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子，并观察hTERT启动子调控下tk／GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物，以HepG2基因组DNA为模板，用PCR方法扩增hTERT启动子；分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体：将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后。通过RT—PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况；用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp～ 40bp的核心启动子。RT-PCR和B-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达．hTERT启动子调控的tk／GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞，表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

新型非病毒载体介导融合自杀基因靶向治疗胃癌的实验研究

目的 构建靶向性基因治疗载体pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK,并以新型磷酸钙纳米为基因治疗载体,研究该基因治疗体系在胃癌细胞中体外与体内专一性表达和杀伤作用.方法 采用PCR、RT-PCR、融合PCK、酶切及连接等技术构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达栽体和融合自杀基因pcDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达栽体.以磷酸钙纳米为栽体分别转染CEA阳性的人胃癌细胞株SGC7901细胞和CEA阴性的Hela细胞.采用RT-PCR、免疫荧光法检测感染细胞中yCDglyTK基因的表达,并在体外观测其对胃癌细胞的作用.结果 SGC7901细胞在感染以上两种质粒表达栽体后均有yCDgtyTK mRNA表达,Hela细胞在转染纳米-pcDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在转染纳米-pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK复合物后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-FC对其亦无杀伤作用.在体外实验中,经纳米转染pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK筛选的阳性克隆组细胞存活率为8.0%,纳米-pcDNA3.1(-)CVyCDglyTK转染组为25.4%,而对照组的细胞存活率为99.0%.结论 本实验构建的由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因yCDglyTK靶向性基因治疗载体,能使融合自杀基因在CEA阳性的胃癌细胞中专一性表达,从而达到靶向治疗胃癌的目的.     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

[目的]探讨CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)与胸苷激酶(thymidine kinase,TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因.[方法]以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组,未转染者为对照组,5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-Fc)组系列质量浓度:10、8、6、4、2、0μg/mL;更昔洛韦(ganciclovir,GCV)组系列质量浓度:5、4、3、2、1、0μg/mL;两药联合应用的系列质量浓度:(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg/mL.光镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate,GIR)及半数抑制浓度(IC50).病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养,给予5-Fc5μg/mL或/和GCV 10μg/mL,噻唑蓝法测定细胞GIR.[结果]对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低,5-Fc组IC50为2 400 μg/mL,GCV组为3 500μg/mL.实验组随5-Fc与GCV剂量增加,对细胞的杀伤作用明显增加,5-Fc组IC50为5.75μg/mL,GCV组为3.50 μg/mL,两者同时应用相当于5-Fc1.90 μg/mL GCV 0.95 μg/mL,细胞对5-Fc的敏感性提高417.4倍,对GCV的敏感性提高1 000倍.病毒杀伤Lovo细胞具有明显的"旁观者"效应,联合应药组的"旁观者"效应明显高于单独应用组.[结论]双自杀基因细胞毒效应以及"旁观者"效应均高于单一自杀基因.     

CEA-rv诱导特异性CIK细胞对Lovo细胞株杀伤作用的研究

目的探讨癌胚抗原重组基因痘苗(CEA-rv)负荷脐血来源树突状细胞(DCs)诱导特异性CIK细胞对结肠癌细胞株Lovo杀伤活性的影响作用。方法取制备好的CEA-rv,用脐血单个核细胞(CBMC)分别制备DCs和CIK细胞;用负荷CEA-rv的DCs和CIK细胞共培养,诱导CEA-rv-DC-CIK细胞。用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测CBMC、CIK、Ag-CIK、Ag-DC-CIK和CEA-rv-DC-CIK对Lovo肿瘤细胞株的杀伤活性。结果脐血DCs高表达CD86、CD40,中度表达CD83和CD80。实验组细胞(CEA-rv-DC-CIK)对Lovo细胞的杀伤能力(62%)明显高于对照组(P<0.01)。结论 CEA-rv负荷的DCs能增强CIK细胞对Lovo细胞的杀伤活性,为CEA阳性肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。     

腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因对血管内皮细胞的靶向杀伤作用

目的: 体外实验评估腺病毒介导KDR启动子-胸苷激酶系统(HSV-tk)杀伤血管内皮细胞的作用. 方法:采用新型AdEasy系统,构建受KDR启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk和AdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外分别感染表达KDR的人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)和不表达KDR的人鼻咽癌细胞株CNE-2,用丙氧鸟苷(GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况. 结果:病毒滴度均为1×1013 pfu/L. 在感染复数(MOI)为100的条件下,GCV浓度由0增至50 mg/L时感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和CNE-2细胞存活率从(89.4±4.6)%和(91.5±4.4)%分别下降至(22.9±4.7)%和(71.4±2.9)%(P＜0.01),而感染AdCMV-tk的HUVEC细胞和CNE-2细胞存活率从(89.9±6.2)%和(90.8±5.7)%分别下降至(12.8±2.6 )%和(18.8±6.1)%(P＞0.05). 结论:腺病毒介导KDR启动子-胸苷激酶系统具有特异性杀伤血管内皮细胞作用.     

癌胚抗原慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达。方法:提取CEA阳性的人结肠癌组织总RNA,逆转录获得cDNA序列,CEA全基因引物进行PCR扩增,对所扩增出的大小约2100bp的基因片段胶回收纯化,与pGEM-T Easy载体连接得到重组质粒pGEM-T-CEA。分别用XhoL和HindⅢ双酶切重组质粒pGEM-T-CEA和慢病毒载体pLentiGFP,将双粘CEA片段与羟化后的双粘线形载体pLentiGFP连接得重组载体pLentiGFP-CEA。pLentiGFP-CEA与慢病毒辅助包装载体pΔ8.2和pVSVG共转染293FT细胞,Western Blot验证CEA在转染293FT细胞中表达,72h后收集病毒上清。结果:通过PCR扩增获得了CEA基因,将CEA正向克隆到慢病毒转移质粒pLentiGFP中,并在293FT细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论:成功构建了CEA慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨CEA功能奠定了基础。     

pGFP-FL质粒的构建及其在FL基因修饰性肿瘤疫苗中的应用

目的　构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法　利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒。在该质粒中,以CMV启动子驱动FL基因,同时以肽链延长因子（EF-1α）启动子驱动GFP基因,并引入原核和真核选择基因KanR/neo。对所获得的pGFP-FL质粒以限制性内切酶酶切鉴定后,再将其导入Hepa1-6细胞内,直接在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况,同时以RT-PCR和PCR产物测序的方法对GFP阳性细胞内FL基因的表达进行检测。结果　质粒的酶切鉴定结果表明所构建的pGFP-FL与预期的结构一致,FL和GFP两者能同时在Hepa1-6细胞内表达。结论　本研究构建了一种新型的FL基因修饰肿瘤疫苗研究载体,位于该载体上的GFP的表达能够反映FL基因的转录表达情况,可以作为FL基因表达的报告基因。     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果:PCR法获得了约1 810bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70的构建与鉴定

目的 构建癌胚抗原（CEA）与热休克蛋白70（HSP70）的真核双表达质粒，并检测其在体外的表达。方法 从结肠癌及正常肝组织中经RT-PCR扩增获得CEA及HSP70 cDNA，并将其定向克隆至真核双表达质粒pIRES中，重组质粒pIRES-CEA及pIRES-CEA-HSP70，经酶切及测序鉴定后，分别转染仓鼠卵巢细胞（CHO）；经RT-PCR及ELISA法检测，CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结果 真核双表达载体pIRES-CEA-HSP70构建成功且CEA和HSP70在CHO细胞中得到有效表达。结论 真核表达载体pIRES-CEA-HSP70的成功构建为治疗CEA阳性肿瘤提供一定的实验基础。     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的：构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法：采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体, PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP -CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果：PCR法获得了约1 810 bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论：构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控UPRT基因真核质粒的构建及表达

目的 构建前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达重组质粒(pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)。方法 采用PCR技术从大肠杆菌JMpPSMAenhaocer／promoter-UPRT109基因组中扩增UPRT基因，通过分子克隆技术将其克隆到包括前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的pEGFP-1的质粒。利用重组质粒pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)转染LNcap细胞，MTT法检测5-氯尿嘧啶(5-FU)对转染LNcap细胞存活率的影响。结果 质粒pPSMAenhaocer／promoter-EGFP双酶切去除EGFP，连接上UPRT基因，成功构建pPSMAenhaocer／promoter-UPRT,并转染LNcap细胞。使LNcap细胞对5-FU的杀伤敏感性大大提高。结论 pPSMAenhaocer／promoter-UPRT的构建和表达，为进一步研究UPRT基因对5-FU的靶向性杀伤前列腺癌细胞增强作用和对前列腺癌自杀基因系统(CD／5一FC系统)的放大效应奠定了基础。