重组人胰岛素样生长因子-1纯化及其鉴定的研究

目的：利川亲和层析法将家蚕幼虫中高效表达的重组人胰岛素样生长因子(recombinant human insulin—like growth factor-1．rhIGF-1)纯化并鉴定，以得到具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF-1生物制品。方法：蚕血淋巴中rhIGF—1初步提纯去除杂质。采用亲和层析法纯化rhIGF-1。以EUSA法测定纯化产物中rhIGF-1含量。用SDS-PAGE和Western—blot分析鉴定rhIGF-1纯度及免疫学活性．4-甲基偶氮唑蓝(tetrazolium salt，MTT)法观察其对MCF-7细胞增殖的影响。结果：纯化后rhIGF-1纯度约为40％，Western blot分析发现，主要纯化产物相对分子质量为7．5ku的成熟hIGF-1．所含非目的产物与hIGF-1无免疫交叉反应。细胞活性刺激实验显示，rhIGF-1纯品对MCF-7细胞有较好的刺激活性．促增殖能力优于来源于大肠杆菌的rhIGF-1产品。结论：蚕血淋巴中的rhIGF-1经亲和层析后初步得到纯化，并显示良好的免疫学活性和生物学活性。     

利用杆状病毒载体高效表达人胰岛素样生长因子-1及其纯化的研究

目的:利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的重组人胰岛素样生长因子-1(rhIGF-1).方法:将15kDhIGF-1前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体pBakPAK8中,构建重组病毒BmNPV/IGF-l.用BmNPV/IGF-1感染家蚕幼虫,提取家蚕血淋巴液,采用亲和层析法纯化rhlGF-1,ELISA法测定rhIGF-1含量,用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定rhIGF-1纯度及免疫学活性,MTF法观察其对MCF-7细胞增殖的影响.结果:ELISA测定显示,BmNPV/IGF-1感染家蚕幼虫120h rhIGF-1含量达最高值(23.36μg/ml).rhIGF-1纯度为40%,Westem-blot分析发现主要纯化产物为7.5 kD成熟hIGF-1.细胞活性刺激实验显示,纯化后rhIGF-11对MCF-7细胞促增殖能力明显优于来源于大肠杆菌的rhIGF-1产品.结论:实现了具有免疫学活性及生物学活性rhlGF-1在杆状病毒表达系统的高效表达,并使rhIGF-1得到初步纯化.     

重组人生长激素治疗前后血胰岛素样生长因子-Ⅰ、胰岛素样生长因子结合蛋白水平监测及意义

目的 通过对使用重组人生长激素(rhGH)患儿进行胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP3)的监测,探讨rhGH使用的安全性.方法 对在本院使用rhGH的患儿30例进行治疗前后血IGF-Ⅰ和IGFBP3浓度监测并计算IGF-Ⅰ和IGFBP3的比值,同时测定T3、T4、TSH,并以年龄、性别匹配20例儿童作为对照组.结果 治疗后平均身高增加(8.77±3.01)cm/y(t=7.773,P<0.001).IGF-Ⅰ治疗前与对照组差异无显著性(t=-0.475,P>0.05),IGFBP,治疗前组高于对照组,差异有显著性(t=3.759,P<0.01),IGF-Ⅰ和IGFBP,治疗后3个月即明显增高,与治疗前相比差异有显著性(t=4.212和7.733,P<0.01).治疗后IGF-Ⅰ各组之间差异无显著性(f=1.629,P>0.05);IGFBP3各组之间差异有显著性,(f=22.964,P<0.001)与治疗时间呈正相关.IGF-Ⅰ/IGFBP3治疗前后各组之间差异无显著性(f=6.081,P>0.05).结论 在使用rhGH中进行IGF-Ⅰ和IGFBP,监测十分必要;血IGF-Ⅰ和IGFBP3检测方便,可作为rhGH治疗期间是否存在诱发肿瘤高危因素的临床评价指标之一.     

重组人生长激素治疗前后血胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子结合蛋白水平监测及意义

目的通过对使用重组人生长激素（rhGH）患儿进行胰岛素样生长因子-I（IGF-I）、胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP3）的监测,探讨rhGH使用的安全性。方法对在本院使用rhGH的患儿30例进行治疗前后血IGF-I和IGFBP3浓度监测并计算IGF-I和IGFBP,的比值,同时测定T3、T4、TSH,并以年龄、性别匹配20例儿童作为对照组。结果治疗后平均身高增加（8．77&#177;3．01）cm／y（t=7．773,P〈0．001）。IGF-I治疗前与对照组差异无显著性（t=-0．475,P〉0．05）,IGFBP,治疗前组高于对照组,差异有显著性（t=3．759,P〈0．01）,IGF-I和IGFBP,治疗后3个月即明显增高,与治疗前相比差异有显著性（t：4．212和7．733,P〈0．01）。治疗后IGF-I各组之间差异无显著性（f=1．629,P〉0．05）;IGFBP,各组之间差异有显著性,（f=22．964,P〈0．001）与治疗时间呈正相关。IGF-I／IGFBP,治疗前后各组之间差异无显著性（f=6．081,P〉0．05）。结论在使用rhGH中进行IGF-I和IGFBP,监测十分必要;血IGF-I和IGFBP,检测方便,可作为rhGH治疗期间是否存在诱发肿瘤高危因素的临床评价指标之一。     

抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.     

体外胰岛素样生长因子结合蛋白-1对人血管内皮细胞生长的抑制作用

目的 观察胰岛素样生长因子结合蛋白-1对人血管内皮细胞的影响及其对胰岛素样生长因子的调节作用。方法 MTT比色法观察IGFBP-1及与IGF-1预混后对脐静脉内皮细胞(ECV304细胞株)生长影响。结果 IGFBP-1对内皮细胞ECV304的生长具有抑制作用且与剂量成正比；预混后各组IGF-1促细胞生长作用明显被抑制。结论 IGFBP-1既可以直接也可以通过调节IGF-1抑制血管内皮细胞生长。     

血清胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-3与2型糖尿病肾病的关系

目的:测定血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGF-BP3)水平,探讨其与2型糖尿病肾病的关系。方法:选择2型糖尿病患者86例,根据其尿微量白蛋白排泄率(UAER)结果分为单纯糖尿病组(SDM组)33例、早期糖尿病肾病组(EDN组)28例和临床期肾病组(CDN组)25例。检测IGF-1、IGF-BP3、UAER等指标,分析IGF-1、IGF-BP3与糖尿病肾病的发病和病情轻重的关系。结果:CDN组血清IGF-1、IGF-BP3和UAER均明显高于SDM与EDN组(P <0.01),CDN组血清IGF-1、IGF-BP3和UAER亦均明显高于EDN组(P <0.01)。 IGF-1与肌酐、尿素氮、UAER和IGF-BP3均呈正相关关系(P <0.01),与年龄和糖化血红蛋白均无相关关系(P >0.05),而与空腹血糖呈负相关关系(P <0.01)。结论:血清IGF-1、IGF-BP3水平与2型糖尿病肾病的发生发展有相关性,可作为糖尿病肾病早期的诊断指标之一。     

胰岛素样生长因子-1与胰岛素样生长因子结合蛋白-1在妇产科临床应用的研究进展

1概述 胰岛素样生长因子系统(IGFs)包括IGF多肽(IGF-1、IGF-2)、两种IGF受体、6种胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP1～6)以及一组胰岛素样生长因子结合蛋白酶。IGF通过与其受体结合发挥其生物学效应，与IGFBP结合成无活性复合物存在，IGFBP具有延长循环水平的IGF、半衰期和稳定IGF血浓度的作用。IGFs中的IGF-1及IGFBP-1与妇产科的关系密切。     

人重组胰岛素样生长因子-1对糖尿病大鼠肾脏的影响

目的观察人重组胰岛素样生长因子1(rhIGF-1)对糖尿病大鼠肾脏的影响。方法采用生化法、放射免疫法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术等方法。结果(1)糖尿病治疗组24h尿白蛋白排泄率和尿量低于糖尿病对照组;(2)糖尿病对照组血清IGF-1含量、肾组织IGF-1含量及IGF-1信使核糖核酸(IGF-1mRNA)表达明显低于正常对照组;糖尿病治疗组血清IGF-1含量明显高于糖尿病对照组,肾组织IGF-1含量及IGF-1mRNA表达与糖尿病对照组无明显差异;(3)糖尿病对照组血清生长激素(GH)高于正常对照组,糖尿病治疗组血清GH低于糖尿病对照组;(4)电镜观察大鼠肾脏病理切片发现rhIGF-1对糖尿病大鼠肾脏损害有改善作用。结论小剂量外源性rhIGF-1不会加重糖尿病肾脏的损害     

重组截短型人角质细胞生长因子-1的表达及纯化

目的：构建高效表达N端缺失的23个氨基酸重组人角质细胞生长因子1( rhKGF1_dest23)的基因工程菌,为治疗放化疗后口腔黏膜炎的新药开发提供实验数据。方法：利用PCR方法分别以pET3c-hKGF1及sumo-EGF为模板合成N端缺失的23个氨基酸rhKGF1_dest23及sumo基因片段,构建4种原核表达载体pET22b-rhKGF1_dest23﹑pET22b-sumo-rhKGF1_dest23﹑pET3c-rhKGF1_dest23和pET3c-sumo-rhKGF1_dest23,分别转化原核表达宿主菌Rosetta(DE3) plysS、BL21(DE3) 、BL21(DE3)Star plysS、origima(DE3) 和BL21AI,筛选rhKGF1_dest23蛋白表达的最佳质粒与宿主菌组合。CM离子交换和肝素亲和层析法纯化rhKGF1_dest23蛋白,Western blotting法鉴定rhKGF1_dest23蛋白。结果： pET22b-rhKGF1_dest23质粒与BL21AI 宿主菌为最佳组合表达,经IPTG与阿拉伯糖诱导, SDS-PAGE电泳后表明目的蛋白大部分以可溶性形式存在,约占菌体总蛋白的10％,经CM和肝素两步纯化后rhKGF1_dest23蛋白纯度为95%以上,Western blotting法鉴定为rhKGF1_dest23蛋白。结论：成功构建表达人KGF1_dest23重组蛋白的基因工程菌,经IPTG与阿拉伯糖诱导,CM弱阳离子与肝素亲合层析后,得到了纯化的rhKGF1_dest23蛋白。     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。     

食管癌患者血清胰岛素样生长因子-1水平检测

目的:检测食管癌患者血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1的水平.方法:采用ELISA法检测52例食管癌患者手术前后血清IGF-1含量,以22名正常健康人为对照.结果:手术前食管癌患者血清IGF-1水平为(292.57±100.53 μg/L),手术后为(280.50±81.46 μg/L,正常人血清IGF-1水平为(196.75±58.31 μg/L).食管癌患者手术前后血清IGF-1水平均高于正常人(P＜0.05).手术前后食管癌患者血清IGF-1水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论:IGF-1参与食管癌的发病过程,是食管癌发生发展过程中重要的生长因子之一.     

瘦素促胎儿生长作用及其与胰岛素和胰岛素样生长因子1关系的探讨

目的:探讨瘦素促胎儿生长作用及其与胰岛素和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的关系.方法:采用放射免疫法检测100例足月新生儿脐血血清瘦素、胰岛素和IGF-1水平,根据新生儿出生体重分为大于胎龄儿(LGA)组19例,适于胎龄儿(AGA)组65例,小于胎龄儿(SGA)组16例.结果:(1)脐血瘦素水平与新生儿出生体重呈正相关关系(r=0.57,P＜0.01),其中LGA组脐血瘦素水平为(13.38±6.75)μg/L,显著高于AGA组(7.40±4.45)μg/L;SGA组(2.79±1.54)μg/L低于AGA组,差异有显著性(P＜0.01);(2)脐血胰岛素和IGF-1水平分别与新生儿出生体重呈显著正相关关系,相关系数(r)分别为0.30和0.35;(3)脐血瘦素和胰岛素水平呈正相关关系(r=0.32,P＜0.01),脐血瘦素与IGF-1水平之间元相关关系(r=018,P＞0.05).结论:脐血瘦素水平与胎儿生长发育状态密切相关,瘦素和胰岛素对胎儿体重有双向调节作用,IGF-1和瘦素具有各自独立的调控胎儿生长发育体系.     

含hIGF-1基因腺病毒的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1,然后转染兔骨髓间充质干细胞并检测其表达.方法根据GenBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T载体,鉴定后酶切出目的基因插入pAdtrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-hIGF-1,经Pme Ⅰ线性化后采用电穿孔法转化至已包含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌中,挑选同源重组质粒线性化后转染HEK293细胞收获腺病毒,然后转染靶细胞兔骨髓间充质干细胞,通过绿色荧光蛋白表达情况以及流式细胞仪、免疫细胞化学等方法检测hIGF-1的表达.结果成功构建了绿色荧光蛋白基因标记的腺病毒Ad-hIGF-1,并在兔骨髓间充质干细胞得以高效表达.结论Adeasy腺病毒系统是基因转染的高效载体系统.腺病毒Ad-hIGF-1转染的骨髓间充质干细胞可作为基因修饰的软骨组织工程种子细胞.     

外源性胰岛素样生长因子-1对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的改善作用

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的改善作用及其脑保护机制.方法:36只大鼠随机分为3组:假手术组、模型组和IGF-1组,每组12只.模型组和IGF-1组采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,假手术组除不插线外其余步骤同模型组.IGF-1组于缺血2 h再灌注1 h后经尾静脉注入5 mg/L IGF-11 ml,假手术组和模型组同时经尾静脉注入1 ml生理盐水.脑缺血再灌注24 h后,各组取6只大鼠灌注,取视交叉前后各2 mm的脑组织,光镜下观察病理改变,免疫组化法测nNOS阳性表达.另6只断头取脑,TTC染色测脑梗死体积.结果:光镜下观察,假手术组大鼠脑组织结构无明显变化.模型组大鼠皮层少见正常神经细胞,神经细胞减少,有大量淋巴细胞浸润;损伤神经元空泡变性多而明显.与模型组相比,IGF-1组皮层神经元细胞空泡变性较少,程度较轻;正常细胞增多,可见少数淋巴细胞浸润.假手术组未发生脑梗死.IGF-1组脑梗死体积百分比为(12.4±0.9)%,较模型组的(24.6±3.7)%减小(t=9.97,P＜0.01).模型组、IGF-1组和假手术组大鼠脑皮层nNOS阳性细胞数依次为(38.83±2.92),(28.33±2.58)和(15.00±1.41),逐渐降低(F=106.8,P＜0.05).结论:外源性IGF-1对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用,该作用可能与抑制nNOS的上调有关.     

人参皂苷Rg1对脑挫伤后大鼠脑内胰岛素样生长因子1表达的影响

目的：探讨人参皂苷Rg1对脑组织挫伤后大鼠脑中胰岛素样生长因子1（insulin—like growth factor-1，IGF-1）表达的影响。方法：Wistar大鼠26只，分为正常对照组（2只），脑挫伤模型组（8只）及人参皂苷Rg1治疗组（16只），在损伤后不同时间点（损伤后6h、12h、2d及6d）分别处死大鼠，使用免疫组化方法观察并检测脑中IGF-1的表达。结果：与对照组相比，脑挫伤模型组损伤后各时间点脑组织中IGF-1的表达有所升高（P〈0．05）；与模型组比较，人参皂苷Rg1治疗组IGF-1的表达明显升高（P％0．05）。结论：人参皂苷Rg1可能通过促进脑挫伤后脑组织IGF-1的表达，促进脑组织的功能恢复。     

胰岛素样生长因子1受体在甲状腺相关性眼病眼眶脂肪细胞增殖和分化中的作用

目的 观察胰岛素样生长因子1 (IGF-1)受体(IGF-1R)在甲状腺相关性眼病(TAO)眼眶脂肪组织中的表达及分布情况,探讨IGF-1对眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响.方法 收集2014年9月至2015年1月期间入住第二军医大学长征医院的TAO组患者(n=6)和对照组患者(n=5)的眼眶脂肪组织,用蛋白质印迹法、实时定量PCR及免疫组化法检测两组患者眼眶脂肪组织中IGF-1R的表达及分布情况.分别提取两组患者的眼眶前脂肪细胞,用CCK-8法检测不同浓度(0、1、5、10、20 nmol/L) IGF-1对细胞增殖能力的影响.体外分化细胞后用油红O染色法及蛋白质印迹法观察两组细胞的分化情况和IGF-1R的表达变化;实时定量PCR检测不同浓度(0、1、5、10、20 nmol/L) IGF-1对TAO组细胞分化水平的影响.结果 TAO组患者眼眶脂肪组织中IGF-1R蛋白及mRNA的表达均高于对照组(P＜0.01).不同浓度IGF-1均可以促进眼眶前脂肪细胞的增殖,且在1～20 nmol/L IGF-1作用下在TAO组细胞的增殖能力均高于对照组(P＜0.05,P＜0.01).TAO组前脂肪细胞分化前、后细胞中IGF-1R的表达水平均明显高于对照组.相较于未加IGF-1组,1～20 nmol/L IGF-1均促进TAO组前脂肪细胞中PPARγ mRNA的表达(P＜0.01);油红O染色检测结果显示随着IGF-1浓度的升高,脂滴合成逐渐增加(P＜0.05,P＜0.01).结论 IGF-1R在TAO患者脂肪组织及前脂肪细胞中的表达较高,IGF-1可以促进TAO眼眶前脂肪细胞的增殖和分化.