牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定

目的 用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫。 方法 改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小。以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增目的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树。 结果 上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为（5.6±0.49）mm×（5.2±0.51）mm。扩增出的18S rRNA基因片段为812 bp。上海牛源隐孢子虫分离株的18S rRNA与巴西的牛隐孢子虫（Cryptospridium bovis,GenＢank登录号为151935628）序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。 结论 上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫（C. bovis）。     

隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的　建立用巢式聚合酶链反应 (NestedPCR) 限制片段长度多态性 (Restrictionfragmentlength polymor phism ,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫 (Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫 (C .andersoni)的方法。　 方法　用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C .parvum与C .andersoni的Small SubunitrRNA (SSUrRNA)部分基因 ,并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切 ,进行RFLP分析 ,并与GenBank上的 17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。　结果　C .parvumHCC1、C .parvumBOCC1和C .andersoniBOCC1扩增产物片段大小分别为 83 0bp、83 0bp和 82 8bp ,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成 2种不同的RFLP图谱 ,根据RFLP图谱可鉴别C .parvum与C .andersoni。序列分析结果显示 ,C .parvumHCC1与国外牛源C .parvumBOH 6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.3 % ;C .parvumBOCC1与国外牛源C .parvumBOH6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.5 % ;C .andersoniBOCC1与国外C .andersoni相应序列同源性为 99.9%。系统发育分析结果显示 ,隐孢子虫虫种形成了 2个群 ,1个群包括C .parvum、C .baileyi、C .meleagridis、C .felis和C .wrairi,另 1个群包括C .a     

隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的建立用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫(Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫(C．andersoni)的方法。方法 用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C．parvum与C．andersoni的Small—Subunit rRNA(SSU rRNA)部分基因，并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切，进行RFLP分析，并与GenBank上的17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。结果C．parvum HCCl、C．parvum BOCCl和c．andersoni BOCCl扩增产物片段大小分别为830bp、830bp和828bp，经SspI和Vspl分别单酶切后形成2种不同的RFLP图谱，根据RFLP图谱可鉴别Cparvum与C．andersoni。序列分析结果显示，C．parvum HCCl与国外牛源C．parvum BOH6、C．parvum GCHl、鹿源C．parvum DRl相应序列同源性均为99．3％；C．parvum BOCCI与国外牛源C．parvum BOH6、C．parvum GCHl、鹿源C．parvum DRl相应序列同源性均为99．5％；C．andersoni BOCCl与国外Candersoni相应序列同源性为99．9％。系统发育分析结果显示，隐孢子虫虫种形成了2个群，1个群包括C．parvum、C．baileyi、C．meleagridis、C．felis和C．wrairi，另1个群包括C．andersoni、C．muris和C．serpentis。结论用巢式PCR技术可扩增隐孢子虫基因组DNA中特异片段，根据RFLP图谱可鉴别C．parvum和C．andersoni，表明本实验建立的检测、鉴别C．parvum和C．andersoni的巢式PCR—RFLP方法有效，为我国隐孢子虫分类、隐孢子虫病的分子流行病学研究和诊断打下了良好基础。     

微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫Rhomboid基因部分序列的克隆和分析

目的获得我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因（CPRho和CARho）部分序列并确定与国外分离株相应序列的同源性。方法应用RT-PCR技术扩增微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因片段,然后将其克隆到pMD18-T载体中,测得序列应用DNAMAN软件进行序列分析。结果经RT-PCR扩增出微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,大小均为723bp。经DNAMAN软件分析,表明我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid核苷酸序列同源性为99．6％,氨基酸同源性为99．2％。二者与GenBank公布的相应序列核苷酸同源性分别为99．9％和99．7％,而氨基酸同源性均为99．6％。结论获得了微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,为继续研究该基因的侵入功能等奠定了基础。     

以18SrRNA基因为分子标记的微小隐孢子虫系统发育研究

目的以18SrRNA基因为分子标记对分离自我国人和牛，以及澳大利亚和美国不同宿主来源微小隐孢子虫的系统发育进行探讨。方法用PCR扩增我国两个虫株的18SrRNA基因片段并进行序列测定，与登录于GenBank的澳、美两国虫株的相应序列进行比对。用NJ法构建分子系统树进行系统发育分析。结果分离自我国的小牛虫株（JLC）与GenBank中3个牛源虫株（澳大利亚的C1，美国的UCP和AUCP-1）亲缘关系近，位于系统发育树的同一枝；分离自我国的人源虫株（JSH）与澳大利亚鼠源虫株（M24）同源，共同位于系统发育树的另一枝。结论本研究中微小隐孢子虫株间亲缘关系的远近似主要由宿主因素决定，而受地理位置的影响较小。     

PCR-RFLP技术及其在隐孢子虫基因分析上的应用

自1974年Grodjicker等提出限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）技术以来,它作为第一代DNA遗传标记极大地推动了人类DNA多态性的研究,现已广泛应用于人类遗传疾病的诊断及寄生虫的鉴定上。1985年Mulis等发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）技术,此后该技术即在生命科学中掀起了一场革命,它几乎渗透到生命科学的各个领域,使DNA多态性检测更为直接,快速。PCR—RFLP技术在隐孢子虫基因分析上的应用也逐渐增多,下面就其这方面的研究和应用作一综述。     

新疆水源性隐孢子虫的检测

目的检测新疆15个城市自来水和河水隐孢子虫污染情况。方法采集水样,分别应用改良美国环保局(EPA)1622法及巢式PCR(nested-PCR)方法进行检测。1)改良EPA1622法:水样经微孔滤膜抽滤、淘洗,磁抗体分离法分离纯化后免疫荧光染色鉴定。2)Nested-PCR法:用试剂盒提取纯化的隐孢子虫卵囊基因组DNA,针对隐孢子虫小亚单位核糖体RNA(18SrRNA)部分基因,依据文献设计并合成引物,用巢式PCR扩增,产物纯化后经SspⅠ及VspⅠ单酶切,并进行RFLP分析。结果2种方法检测新疆15个地区的自来水隐孢子虫卵囊均为阴性,改良EPA1622法检测乌鲁木齐市、昌吉市、伊宁市和吐鲁番市的河水隐孢子虫卵囊阳性。巢式PCR检测乌鲁木齐市和伊宁市水样,均扩增出约830 bp的特异片段,RFLP初步鉴定为小鼠隐孢子虫基因;昌吉市和吐鲁番市河水水样PCR检测阴性。结论新疆乌鲁木齐市、伊宁市河水检出隐孢子虫,初步鉴定为小鼠隐孢子虫。而当地的饮用水未受污染。     

广西西南部分地区龟隐孢子虫感染情况调查与分析

目的 了解广西西南部分地区4种龟类隐孢子虫的感染情况。方法 采集4个种类总计148只龟的粪便样品,利用巢氏PCR对18S rRNA基因进行检测和分析。结果 龟隐孢子虫总感染率为23.65%(35/148),其中黄额闭壳龟感染率为35.29%(6/17),地龟感染率为29.00%(29/100),黄缘闭壳龟(0/16)和木纹龟(0/15)中未检测出隐孢子虫感染,两种龟类隐孢子虫检测结果均为阴性,感染率为0。不同龟种中,地龟感染了Cryptosporidium.ducismarci,黄额闭壳龟存在Cryptosporidium.ducismarci与Cryptosporidium.testudinis两种隐孢子虫的混合感染。结论 广西西南部分地区龟类存在两种隐孢子虫的感染,且C.testudinis隐孢子虫可能对人兽健康存在潜在风险,本研究为明确目前广西西南地区的龟隐孢子虫的流行情况提供了参考依据。     

微小隐孢子虫的基因检测实验研究

目的 探讨聚合酶链反应（PCR）检测微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum)感染的特异性和敏感性。方法 用Sheather's蔗糖梯度离心法从微小隐孢子虫感染者粪便标本中分离纯化卵囊，用酚-氯仿法抽提卵囊总DNA，针对本虫18SrRNA基因片段设计1对引物，对模板DNA进行PCR扩增，同时以蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lambia)，溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica)。阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis)。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii)。日本血吸虫（Schis-tosoma japonicum)和旋毛虫（Trichinella spiralis)，以及人体血细胞等DNA样本为对照，用琼脂糖电泳和溴乙腚染色对PCR产物进行检测。结果 仅微小隐孢子虫DNA被扩增出-500bp的DNA片段，其它对照DNA样本均未出现扩增反应。结论 PCR对隐孢子虫检测的特异性可高达100%，敏感性也很强，可检测到20pg微小隐孢子虫卵囊的DNA，表明本实验建立的检测微小隐孢子虫的PCR方法有效。     

腔阔盘吸虫18S rRNA及亲缘关系分析

目的 利用分子生物学技术，研究腔阔盘吸虫的分类。 方法 提取腔阔盘吸虫基因组DNA，利用保守引物，PCR扩增18S rRNA片段并测序。应用DNAStar和MEGA3软件，分析腔阔盘吸虫与其他双腔吸虫18S rRNA的同源性，在此基础上绘制出系统进化树，确定它们的进化关系。 结果 腔阔盘吸虫和其他双腔吸虫18S rRNA的同源性很高，其中腔阔盘吸虫和支双腔吸虫（D. dendriticum）的差异最大，为2.42%，而与愁体吸虫（L. collurionis）的差异较小，为1.75%; D. dendriticum和分叶短腺吸虫（B. lobatum）的进化关系相对较近，差异为1.09%。 结论 双腔科吸虫的18S rRNA序列非常保守，腔阔盘吸虫和L. collurionis的亲缘关系最近，而与B. lobatum和D. dendriticum在进化上关系相对较远。     

基于COI与18S rRNA基因序列的4种肉食螨DNA条形码研究

目的　基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）与核糖体18S小亚基（18S rRNA）基因序列,分析确定4种肉食螨合适的DNA条形码,从而进一步完善肉食螨DNA条形码数据库。方法　2018年5月—2019年7月于安徽省阜阳、芜湖、铜陵等3市小型面粉作坊采集分离肉食螨样本,经形态学鉴定后,提取单个螨基因组DNA,经PCR扩增、克隆和测序获得COI与18S rRNA基因序列,所获序列进行BLAST比对。结合已报道肉食螨序列,用ClustalX 1.83软件进行多序列比对,基于MEGA X软件进行序列分析并计算遗传距离,采用最大似然法构建系统发育树。结果　马六甲肉食螨、转开肉食螨、鳞翅触足螨分子鉴定结果与形态学一致,而GenBank中缺少网真扇毛螨相关序列。4种肉食螨COI与18S rRNA 基因序列（A + T）分别为69.6%和55.1%,碱基替换数分别为137对和46对。基于COI与18S rRNA基因序列变异位点分析,发现4种肉食螨种间变异位点分别为154 ~ 321个和58 ~ 99个。4种肉食螨COI与18S rRNA基因序列种内遗传距离均≤ 0.020,种间遗传距离分别为0.235 ~ 0.583和0.078 ~ 0.114。基于COI与18S rRNA基因序列的系统发育树显示,4种肉食螨均能各自聚为一支,支持率均达100%,与形态学鉴定结果一致。结论　线粒体COI基因序列作为4种肉食螨DNA条形码优于18S rRNA基因序列,更适用于探索肉食螨的属、种低阶元亲缘关系。     

基于18S rRNA基因的芜湖市疟疾病例溯源研究

目的 研究芜湖市疟疾病例疟原虫种系发育和地理聚类.方法 采集2018年8月至2019年9月皖南医学院附属弋矶山医院收治的4例疟疾患者血样,提取血样疟原虫DNA,采用巢式PCR技术对其18S rRNA基因进行扩增、克隆测序分析,并与GenBank中疟原虫相应序列进行比较分析,采用MEGA X软件建树,运用分子进化树分析芜...     

河南猪株旋毛虫18S rRNA基因的同源性序列分析

目的通过分析18SrRNA基因序列同源性,对河南猪株旋毛虫进行分子鉴定及分类。方法收集河南猪株旋毛虫成虫,提取总RNA,反转录合成cDNA,经特异引物扩增获得18SrRNA基因片段。将此目的基因与pMD18-T载体连接,转化大肠埃希菌感受态细胞,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后进行序列测定及分析,构建系统发育树。结果构建的重组质粒酶切片段大小分别为2 700和1 800bp,与预期值相符。根据18SrRNA碱基序列构建系统发生树,河南猪株旋毛虫与虫株Trichinella nativa(AY487254.1)的亲缘关系较近,同源性为99.1%。结论河南猪株旋毛虫归属于T2。     

用PCR—RFLP和16SrDNA指纹图法分析幽门螺杆菌基因型

本文建立了PCR－RFLP和16srDNA指纹图法．对19株幽门螺杆菌（HP）进行基因型分析：HP尿素酶C基因的PCR扩增产物．分别用HindⅢ、HaeⅢ、AluⅠ酶切，结果显示：每个酶均将19株HP分为3种RFLP图谱．综合HindⅢ，HaeⅢ和AluⅠ酶切结果，19株HP分为10个酶切带型；PCR扩增HP标准株16SrRNA基因，地高辛标记制备550bp探针，19株HPDNA分别经HaeⅢ和EcoRⅠ酶切、电泳后，通过Southern杂交获16SrDNA指纹图，结果显示：HaeⅢ酶切分为14个杂交带型，EcoRⅠ酶切19株HP杂交带型均不同。本实验表明：上述两种方法重复性好，分群力高，可准确有效地对HP作出鉴定并将其分型。19株HP株间存在基因型差异。     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.     

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.