低浓度MNNG激活转录因子

目的 :为了进一步研究 N-甲基 - N’-硝基 - N-亚硝基胍 (MNNG)引起的非定标性突变的发生机制 ,观察了低浓度 MNNG对转录因子 NF- κB、CREB、AP- 1和 c- Myc的影响。方法 :采用分泌型碱性磷酸酶报告基因和瞬时转染实验检测转录因子活性。结果 :经 0 .2 μmol/L MNNG处理后 ,转录因子 CREB活性是溶剂对照组的 1.4倍 (P<0 .0 5 ) ,AP- 1和 NF- κB活性均为溶剂对照组的 1.3倍 (P<0 .0 5 ) ;而 c- Myc的活性在对照组和 MNNG处理组都较低。结论 :低浓度 MNNG可以激活转录因子 AP- 1、CREB和 NF- κB,对 c- Myc则无明显激活作用 ,提示一些转录因子的激活可能参与了 MNNG引起的非定标性突变发生过程。     

CyclinE1、CyclinE2在低浓度MNNG诱发的FL细胞中的表达研究

目的研究低浓度N-甲基-N＇-硝基-N-甲基亚硝基胍对人羊膜FL细胞的细胞周期基因表达的影响。以助于阐明MNNG引起细胞应答反应的机制。方法用实时荧光定量PCR方法,检测FL细胞在1．0μmol／LMNNG处理后细胞周期基因CyclinE1及CyclinE2基因表达的改变,数据用ABI公司的SDS2．1软件分析。结果MNNG处理后,细胞周期基因CyclinE1及CyclinE2表达显著上调（P〈0．05）。结论低浓度MNNG攻击可使人羊膜FL细胞周期发生异常。     

低浓度MNNG诱发FL细胞应答反应的蛋白质组学研究

目的：研究低浓度甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对人羊膜FL细胞蛋白质表达谱的影响，以助于阐明环境致癌物引起细胞早期应答反应的分子机制。方法：FL细胞分别用MNNG和DMSO(溶剂对照)处理后，提取细胞总蛋白，用双向凝胶电泳分离蛋白质组成分，银染染色后用相应的分析软件分析数字化的凝胶图像，找出在MNNG处理后表达有差异的蛋白斑点，用基质辅助的激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。结果：在MNNG处理后有60多个蛋白斑点出现质和量的变化，其中18个蛋白斑点只能在MNNG处理的细胞中检测到，13个蛋白斑点则在MNNG处理后消失；同时检测到30个蛋白斑点在表达量上有显著变化，其中16个点表达升高，14个点则表达降低。通过数据库的检索，初步的鉴定了一批结构和功能各异的蛋白。结论：在低浓度烷化剂攻击后，FL细胞中的蛋白表达谱发生了显著的变化。     

人REV3基因启动子区的克隆和生物信息学分析及其对MNNG的反应

目的：了解人REV3基因对化学致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱发转录上调的机制。方法：根据BLAST序列比对、启动子和转录因子结合部位预测软件，对人REV3基因促进子区进行生物信息学分析；用巢式PCR技术克隆了人REV3基因启动子区；用瞬时转染二重荧光素酶报道基因系统检测人REV3启动子对化学致癌物MNNG的反应。结果：生物信息学分析显示，人REV3基因启动子区位于6号染色体PAC克隆RP3-415N12，假设的启动子区有启动子序列、富含cpG岛和包括AP-1／c-Jun／c-Fos、AP-2、STAT、CREBP和NF-kB等的转录因子识别部位。将启动子区2582bp的片段插入荧光素酶报道基因载体pGL3-Basic中，构建了重组体质粒pGL3-2582。瞬时转染检测显示，该假设的启动子区确有启动子功能，对MNNG发生反应。结论：成功地克隆了人REV3基因启动子区，并证明其对MNNG发生反应。提示当细胞处于基因毒应激状态下可在转录水平调节REV3基因。     

POLH基因反义阻断细胞系的建立及POLH在MNNG引起的非定标性突变中的作用

目的 :通过建立 POLΗ反义阻断细胞系 FL - POLΗ-,研究 POLΗ的功能。方法 :将 POLΗ基因的 14 73～ 2 131片段反向克隆到哺乳动物细胞表达载体 p MAMneo- amp-中 ,将重组表达质粒转染 FL细胞 ,G4 18筛选 ,获得 POLΗ基因被表达阻断的哺乳动物细胞系 FL - POLΗ-。采用穿梭质粒 p Z189介导的突变实验 ,观察在 POLΗ基因表达被阻断细胞系中进行复制时的自发突变频率和 MNNG引起的诱发突变频率。结果 :成功建立细胞系 FL -POLΗ-。穿梭质粒 p Z189在 FL- POLΗ-细胞中复制后 ,其 Sup F t RNA基因的自发突变频率为 13.5× 10 -4,而对照细胞 FL和 FL- M分别为 4 .9× 10 -4和 3.7× 10 -4。同时 ,质粒在接触过 MNNG的 FL- POLΗ-细胞中复制 ,其 Sup Ft RNA基因的非定标性突变频率不发生。结论 :POLΗ在维持哺乳类细胞的遗传稳定性中起重要作用 ,且参与哺乳动物细胞中 MNNG引起的非定标性突变。     

低浓度MNNG诱发细胞周期相关基因DK6及E2F7表达研究

目的 研究低浓度N-甲基-N'-硝基-N-甲基亚硝基胍对人羊膜FL细胞的细胞周期相关基因表达的影响,以助于阐明MNNG引起细胞应答反应的基因及其调控机制.方法 用实时荧光定量PCR方法,检测FL细胞在0.2μmol/L MNNG处理后细胞周期相关基因CDK6及E2F7基因表达的改变.数据用ABI公司的SDS2.1软件分析.结果 MNNG处理后,细胞周期相关基因CDK6及E2F7表达显著下调(P＜0.05).结论 低浓度MNNG攻击可使人羊膜FL细胞周期发生异常.     

低浓度MNNG诱发非DNA损伤依赖的细胞信号通路

目的：研究基因组DNA损伤与细胞信号通路激活的关系以及低浓度N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)对细胞膜表面受体的影响。方珐：采用EUSA法来检测蛋白激酶A(PKA)的活性，不连续梯度密度离心法完成细胞脱核，以及免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察细胞表面受体聚集情况。结果：0．2μmol／L MNNG能在脱核细胞中引起PKA活性升高2．3倍，并可在5min内引起vero细胞表面生长因子受体和肿瘤坏死因子α受体的聚集；在脱核细胞中，表面受体聚集现象与在完整细胞中一样。结论：低浓度MNNG对PKA的激活和诱导细胞表面受体聚集均不依赖于基因组DNA的损伤，表明细胞信号转导通路的起源可能位于细胞膜或者细胞质中。     

MNNG诱导GES-1细胞恶性转化细胞模型的建立

目的建立胃癌癌前病变细胞模型。方法使用与胃癌相关的亚硝胺类化合物N-甲基-N′-硝基N-亚硝基胍(MNNG)对永生化的人胃黏膜上皮细胞系GES-1进行恶性转化实验,得到转化后的MC细胞。比较观察GES-1细胞和MC细胞的形态,同时检测两种细胞中神经钙黏附素(N-cadherin)与磷酸化信号传导和转录激活因子3(P-STAT3)的表达。结果与GES-1细胞比较,MC细胞形态以及生长特性均发生了改变。随传代的延续,细胞呈现典型的"岛样"克隆生长。胃癌组织相关蛋白N-cadherin、P-STAT3的表达量增加。结论本研究成功构建了胃癌癌前病变细胞模型。     

钼酸钠对MNU和MNNG诱导V79细胞姐妹染色单体互换频率的作用

实验结果证实、预加10~(-7)～10~(-4)mol/L浓度钼酸钠能明显减少MNU诱导的V79细胞姐妹染色单体互换(SCE)频率。中等剂量(10~(-5)～10~(-6)mol/L)效果最明显,分别由18.32/细胞降至12.64和12.94/细胞(P<0.001);钼酸钠无论同时或预先作用于细胞,对于MNNG引起的V79细胞遗传物质损伤无明显保护作用。     

从形态及功能研究MNNG诱导GES-1永生化细胞的恶性转化

目的 探讨甲基硝基亚硝基胍(methyl nitro nitrosoguanidine,MNNG)作用于GES-1永生化细胞所发生的恶性转化.方法 MNNG作用于GES-1永生化细胞24 h后,通过显微镜和软琼脂集落形成实验观察细胞形态学、染色体变化和集落形成情况.统计采用t检验.结果 经MNNG处理的GES-1细胞(命名为MC)核增大,畸形,核染色质变粗,核仁肥大,核分裂.染色体可见双倍及多倍体,染色体断裂.克隆形成实验可见细胞接触抑制消失克隆形成,t=5.139,P＜0.05.结论 经MNNG诱导的GES -1细胞的生长特性改变,呈现肿瘤细胞的形态学及生长特征.     

单链DNA构象多态性检测人胃粘膜上皮细胞H－ras基因的研究

用化学致癌剂甲硝基亚硝胍（ＭＮＮＧ）对人类胃粘膜上皮细胞株ＧＥＳ－１进行不同方式处理，常规方法提取ＤＮＡ，经聚合酶链反应扩增Ｈ－ｒａｓ原癌基因后，以单链构象多态性检测Ｈ－ｒａｓ原癌基因，作者发现长期小剂量的ＭＮＮＧ打击ＧＥＳ－１可以诱导此细胞发生Ｈ－ｒａｓ基因改变，而大剂量短期处理的ＧＥＳ－１组未见Ｈ－ｒａｓ基因构型改变，提示化学致癌剂ＭＮＮＧ诱发Ｈ－ｒａｓ癌基因改变是一个缓慢、剂量叠加的过程，在ＭＮＮＧ诱发的胃癌中，Ｈ－ｒａｓ基因的改变不是首发事件。     

Shh 蛋白及其下游转录因子 Gli-1 在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的观察非小细胞肺癌（non—small cell lung cancer,NSCI．C）及癌旁组织中Shh和Gli-1蛋白的表达,探讨Shh和Gli-1异常表达与NSCLC之间的关系。方法应用免疫组织化学技术检测NSCLC及癌旁组织中Shh和Gli-1蛋白的表达。结果Shh和Gli-1在癌旁组织中低表达,但在NSCLC中表达明显增强。Shh、Gli-1蛋白的表达与癌组织分化程度和淋巴结转移密切相关,分化程度低、淋巴结转移阳性者,表达增强明显。但与组织学分型无关。结论Shh和Gli-1蛋白的异常表明Hedgehog信号通路可能参与了NSCLC的发生、发展过程。     

SHH、Gli-1、MMP-2在胃癌组织中的表达及临床意义

目的：探讨胃癌组织中刺猬信号通路（Hedgehog signaling pathway,Hh）中的音猬因子（Sonic hedgehog,Shh）和胶质瘤相关癌基因同源物-1（Glioma-associated oncogene homolog -1,Gli-1）与金属基质蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2,MMP-2）的表达和临床意义。方法采用免疫组织化学方法检测40例人胃癌组织、人胃息肉组织和40例正常胃黏膜组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2蛋白的表达。结果胃癌组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2的阳性表达率分别为62.5％、67.5％、72.5％,高于胃息肉组织（阳性表达率分别为27.5％、37.5％、32.5％）和正常胃黏膜组织（阳性表达率分别为22.5％、17.5％、12.5％）（P＜0.05）;以上三者的表达与患者性别、年龄、组织学类型无关（P＞0.05）;而与分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关（P＜0.05）;音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2表达呈正相关。结论刺猬信号通路可能通过某些机制可上调金属基质蛋白酶-2的表达,从而增强胃癌的侵袭性。联合检测胃癌组织中音猬因子、胶质瘤相关癌基因同源物-1、金属基质蛋白酶-2的表达水平在一定程度上可以作为胃癌预后的客观参考指标。     

Shh、Gli1和MMP-9在胃癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨胃癌组织中Hedgehog(Hh)信号通路分子(Shh和Gli1)与基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达以及临床意义.方法 采用免疫组织化学方法检测54例人胃癌组织、癌旁组织和30例正常胃黏膜组织中Shh、Gli1和MMP-9蛋白的表达.结果 胃癌组织中Shh、Gli1和MMP-9的阳性表达率分别为68.52％、61.11％和64.81％,明显高于癌旁组织(阳性表达率分别为27.78％、24.07％和22.22％)和正常组织(阳性表达率分别为36.67％、26.67％和33.33％)(P＜0.05);三者的表达均与胃癌患者性别、年龄、部位无关(P＞0.05);而与分化程度、浸润深度以及淋巴结转移相关(P ＜0.05);Shh、Gli1分别与MMP-9表达呈正相关.结论 Hedgehog( Hh)信号通路可能通过上调MMP-9的表达促进胃癌的侵袭转移.联合检测胃癌组织中Shh、Gli1和MMP-9蛋白水平,可作为胃癌预后的客观参考指标.     

Gli-1 siRNA对PANC-1增殖及凋亡的影响

目的以Gli-1 siRNA转染胰腺癌细胞系PANC-1,研究其阻断Hh-Gli-1信号通路的作用效果,并观察其对靶细胞增殖及凋亡的影响。方法实验组以Gli-1 siRNA转染PANC-1细胞,转染后24h采用RT-PCR检测Gli-1表达水平的变化,MTT法测定细胞生长曲线观察细胞增殖的抑制情况,同时设立阴性对照组和空白对照组。结果相对于阴性对照组和空白对照组,Gli-1 siRNA可以明显减少Gli-1 mRNA的表达（P〈0.01）,抑制PANC-1细胞的增殖（P〈0.01）。结论实验初步证明Gli-1 siRNA通过阻断Gli-1 mRNA的转录,阻止下游基因的表达,从而抑制PANC-1的增殖并诱导细胞凋亡。     

Shh蛋白在前列腺癌组织中的表达及临床意义

目的探讨Shh蛋白在人前列腺癌、前列腺增生组织中的表达及意义。方法采用免疫组化法检测60例前列腺癌和60例前列腺增生组织Shh的表达。结果 Shh在前列腺增生组织中不表达或低表达,而在前列腺癌组织中的表达明显高于增生组织,前列腺癌中Shh的表达与病理分级密切相关。结论 Hedgehog信号通路中Shh蛋白表达上调可能参与了前列腺癌的发病,其在前列腺癌的发生、发展等方面可能具有重要作用。     

Shh mRNA在成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后的表达及其意义

目的:观察成年大鼠慢性压迫性脊髓损伤后与发育相关的重要分子Shh mRNA的表达,探讨其在神经再生过程中的作用.方法:将30只同龄Wistar大鼠置入后路渐进式压迫装置,制作成慢性压迫性脊髓损伤模型.随机分为对照组(5只)和慢性脊髓损伤组(25只).应用原位杂交检测方法,于脊髓损伤后1,3,7,14,28 d对损伤区行Shh mRNA检测.结果:脊髓损伤后7 d,Shh mRNA表达水平达到最大值,在损伤区至远端10 mm处的灰质和白质中均有表达,这种高水平的表达至少维持到损伤后28 d.Shh mRNA在室管膜细胞的表达远远低于在灰质和白质中的表达,其在室管膜区域的表达仅限于损伤区域周围5 mm范围内,分布范围远远小于在灰质和白质中的表达.结论:慢性压迫性脊髓损伤可激活Shh mRNA的表达,其表达对脊髓损伤后神经细胞再生的意义值得进一步探讨.     

环巴胺对胃癌细胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表达的影响

目的:探讨环巴胺对胃癌细胞BGC-823增殖凋亡及Shh、Gli-1基因表达的影响。方法:采用MTT法检测环巴胺对BGC-823细胞的生长抑制效应,倒置显微镜及AO/EB荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Shh、Gli-1 mRNA的表达情况。结果:环巴胺可明显抑制BGC-823细胞的生长,呈时间-剂量依赖性,并出现典型的细胞形态学改变;经32、64、96μmol.L-1的环巴胺作用24 h后的凋亡率依次为12.50%、31.50%、56.10%,明显高于空白对照组的2.10%(均P<0.01);Shh及Gli-1 mRNA均表达,环巴胺可下调Gli-1 mRNA表达,但对Shh mRNA表达无明显影响。结论:环巴胺可以抑制胃癌细胞BGC-823增殖并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Gli-1基因表达有关。     

亚硒酸钠对MNNG诱导Wistar大鼠胃癌形成过程中肥大细胞与VEGF的影响

目的　探讨亚硒酸钠对MNNG诱导Wistar大鼠胃癌形成过程中肥大细胞与VEGF的影响。方法　用MNNG(2 0mg/kg)给大鼠灌胃 ,每天一次 ,连续 10天 ,以诱导大鼠胃癌形成。观察到实验的第 4 3周 ,用HE染色、病理诊断和AB PAS反应方法比较了硒在MNNG诱导Wister大鼠腺胃癌形成过程中的作用 ,用 0 2 5 %甲苯胺蓝(toluidineblueTBpH6 4 )染色显示肥大细胞 ,并进行计数。用免疫组织化学SP法研究在此过程中VEGF蛋白表达 ,并对其结果进行定性、定位、图像分析。结果　饮水中加入 2mg/L和 4mg/L的亚硒酸钠加重胃粘膜的糜烂、出血 ,促进胃粘膜的肠上皮化生 (P <0 0 5 ) ,更有意义的是在MNNG诱癌过程中发生了浆膜下平滑肌瘤 ,而且亚硒酸钠可以增加平滑肌瘤的发生率。肥大细胞计数各组之间无显著性差异。免疫组织化学结果显示 :VEGF阳性产物呈棕黄色 ,广泛分布在胃粘膜全层 ,主要分布在胃腺细胞的胞质内。图像分析结果显示 :实验对照组比正常对照组VEGF的平均光密度 (MOD)略有增高 (P >0 0 5 ) ,加硒各组VEGF的MOD比实验对照组也略有增高 (P >0 0 5 )。结论　在MNNG诱导Wistar大鼠胃癌形成过程中 ,亚硒酸钠并不能预防肿瘤发生 ,其机制与胃壁内的肥大细胞和VEGF表达无明显相关性。