实时荧光定量PCR鉴别检测单纯疱疹病毒方法的建立

目的:建立快捷、灵敏、特异的单纯疱疹病毒(HSV)的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测及分型方法。方法:选择HSV1和HSV2的糖蛋白B基因设计一对通用引物和对应的探针组建2个FQ-PCR反应体系,应用克隆的质粒建立系列标准品制作标准曲线,进行重复性和敏感性试验,以其他种类的细菌、病毒、真菌进行特异性分析,并用于检测生殖器疱疹患者的HSV1和HSV2。结果:HSV1和HSV2两标准曲线的线性检测范围均为105到1011Copies/L,相关系数均大于0.99,其他种类的细菌、病毒、真菌均未出现特异性扩增;48例生殖器疱疹患者疱液中HSV1和HSV2的检出率分别为6.3%(3/48)和87.5%(42/48)。结论:实时FQ-PCR法鉴别检测HSV1和HSV2,具有快速、特异、灵敏、便捷的特点,有助于HSV感染的流行病学和病理机制的研究;生殖器疱疹患者以HSV2感染为主。     

实验动物皮肤病原真菌多重PCR检测方法的建立与初步应用

目的 建立石膏样毛癣菌(Tm)、石膏样小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴类毛癣菌(Am)的多重PCR检测方法,用于实验动物皮肤病原真菌的快速检测。方法 根据Genbank公布的四种皮肤病原真菌的18S-28S rRNA序列设计特异性引物,通过引物、dNTP、TaqDNA聚合酶浓度及退火温度和时间的优化,建立四种皮肤病原真菌的多重PCR体系。经特异性和敏感性检验后,对15份人工感染真菌大鼠毛和260份实验动物毛发样本进行检测。结果 所建多重PCR方法能够有效区分四种皮肤病原真菌,产生192 bp(Tm)、460 bp(Mg)、290 bp(Mc)和602 bp(As)的目的片段,最低检测限分别为5.9 pg/μL、6.6 pg/μL、9.5 pg/μL和5.1 pg/μL。被检的15份人工感染样本扩增结果准确,260份毛发样本中未检测出四种真菌。结论 所建立的多重PCR方法能够同时对实验动物中的四种皮肤病原真菌进行快速的检测,具有较高的应用价值。     

4种感染性腹泻病原菌免疫磁珠-多重PCR快速检测体系的建立

目的基于免疫磁珠分离及多重PCR技术建立出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的快速检测体系。方法根据出血性大肠埃希菌uidA、福氏志贺菌ipaH、空肠弯曲菌hipo及副溶血弧菌tlh的基因序列设计特异性引物,优化免疫磁珠分离过程及多重PCR扩增中的各个环节,建立上述4种病原菌同步快速扩增体系,并鉴定该体系特异性、敏感性。结果发现Mg2+浓度对该体系影响最大,在Mg2+浓度为4 mmol/L时扩增效率最高;该体系对4种病原菌的敏感性分别为:出血性大肠埃希菌2.7×10 cfu/ml、福氏志贺菌6.4×10 cfu/ml、空肠弯曲菌7.6×10 cfu/ml、副溶血弧菌3.6×10 cfu/ml。结论建立了出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的免疫磁珠-多重PCR快速检测体系,该体系特异性及敏感性高,检测过程简单,结果稳定,可应用于临床诊断及食品卫生监管中致病菌的快速检测。     

多重PCR技术及其在病原体检测中的应用

多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction,MPCR)是在常规PCR基础上发展起来的新技术,在同一个反应体系中加入一对以上引物,分别扩增不同的模板,得到不同的目的片段。这种方法既保留了常规PCR方法的特异性、敏感性,又减少了操作步骤及试剂用量,可以在同一反应中检测多种致病菌的特异基因。利用一次多重反应,可同时检测、鉴别出多种病原体。不论在致病微生物引起的传染病诊断方面,还是在环境中致病     

两种巢式PCR方法在HIV-1早期检测的应用和比较

目的 建立并应用HIV-1早期检测的单重巢式PCR和多重巢式PCR方法检测HIV-1感染,探讨两种方法检测结果的差异.方法 针对HIV-1主要流行毒株的pol、gag、env 3个基因的保守序列设计巢式PCR引物,建立单重巢式PCR和多重巢式PCR方法.运用两种巢式PCR方法对118例HIV-1阳性样本和48例HIV-1阴性样本进行检测.结果 多重巢式PCR方法的灵敏性为96.6%,高于env区单重巢式PCR的80.5%和pol区单重巢式PCR的88.1%(P＜0.05),但与gag区单重巢式PCR检测结果(90.7%)差异无统计学意义(P＞0.05);多重巢式PCR的特异性为99.2%,高于env区单重巢式PCR的85.4%(P＜0.05),但与gag区和pol区的特异性差异无统计学意义(P＜0.05);多重巢式PCR方法的平均重复性为98.3%,检测下限至少可以达到250 copy/ml.结论 多重巢式PCR检测方法与单重巢式PCR检测方法相比,具有更高的灵敏性、特异性以及较好的重复性,能检测到较低拷贝数的样本,是一种快速、简便、可靠的HIV-1早期检测方法.     

快速检测肺炎链球菌recA、ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用

目的：建立快速检测肺炎链球菌recA,ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法并应用。方法：设计肺炎链球菌的特异基因recA,ply及其菌属保守序列16SrRNA基因的引物,建立多重降落PCR的反应体系及条件,通过该方法检测13株标准菌株的基因以判定recA、ply、16SrRNA基因的检测特异性;并通过对不同稀释度肺炎链球菌DNA的检测判定该方法的灵敏度。最后,应用多重降落PCR方法检测98份痰标本的肺炎链球菌,并与细胞培养法进行比较。结果：建立的多重降落PCR方法检测肺炎链球菌的特异性达100％,灵敏度达5pg／μL,该方法对98份痰标本中肺炎链球菌的检测结果与细胞培养法一致。结论：成功建立检测肺炎链球菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可用于临床标本肺炎链球菌的快速检测。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

多重PCR结合毛细管电泳检测儿童呼吸道病原体方法的建立及应用

目的：建立肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.au）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,KP）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.Ae）、阴沟杆菌（Enterobacter cloacae,Ecl）、白色假丝酵母菌（Candida albicans,Cal）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,Aba）7种儿童呼吸道病原体多重PCR结合毛细管电泳法检测体系。方法：随机收集南京市儿童医院2020年11—12月266例儿童呼吸道病原体样本,针对MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、Cal、Aba保守序列设计特异性引物,设计并优化多重PCR结合毛细管电泳检测体系;将该检测结果与细菌培养以及荧光定量PCR比对,评估该方法的检测性能（灵敏度、特异度）。结果：所设计引物可以特异性扩增出呼吸道病原体;多重PCR结合毛细管电泳检测体系检出敏感性高;与其他呼吸道感染病原体未出现交叉反应,无明显的非特异峰,特异性较好。结论：成功建立一种能够快速筛查7种常见儿童呼吸道病原体的多重PCR结合毛细管电泳的检测方法。     

小型猪微卫星标记多重PCR体系的建立与应用

目的 建立实验用小型猪微卫星标记的多重PCR体系和进行实验猪群的遗传监测. 方法利用3种不同荧光标记的微卫星引物结合ABI3700 遗传分析仪测序的方法,通过筛选和优化反应条件,建立可用于实验用小型猪遗传质量控制的稳定的多重PCR反应体系.在此基础上进一步检测实验用小型猪近交群体的遗传变异以验证建立体系的效率.结果 筛选出了2组理想的组合:组合1包括SW742、S0228和S0218座位,复性温度58℃和56℃;组合2包括S0155、SW902和S0227三个座位,复性温度为60℃和58℃.组合内不同座位标记不同的荧光染料.还以此检测了实验用小型猪群体中的遗传变异.结论 初步建立了中国三种实验用小型猪微卫星标记检测的多重PCR体系, 为快速、大通量、准确的小型猪遗传监测提供了初步的技术基础.     

解脲支原体、人型支原体、生殖支原体多重PCR检测模板的建立

目的建立解脲支原体（urealytium;Uu）、人型支原体（mycoplasma hominis,Mh）、生殖支原体（mycoplasma genitalium,Mg）多重PCR检测模板,为临床泌尿生殖道支原体感染的筛选及检测提供便利的多重PCR方法。方法采用Uu、Mh、Mg提取目的RNA,采用定量荧光PCR技术进行目的基因扩增,进行纯化回收后构建多重PCR检测模板,对构建条件进行优化组合,并对临床样本进行检测,评价多重PCR检测的灵敏度。结果建立多重PCR模板最优扩增条件为50mM Tris—HCl（pH8．0）,50mM KCl,4mM MgCl2,10mM DTT。引物浓度各为0．5μl／L,反应条件93℃,退火温度55℃,反应40个循环。建立后的多重PCR检测模板上检测靶基因通过特异引物均能进行特异性扩增,目的条带清晰,灵敏度检测显示其灵敏度为100％。结论通过目的基因扩增、纯化能够建立满足临床检验需要的uu、Mh、Mg多重PCR检测模板,提高临床检测效率。     

儿童血流感染多重PCR检测方法的建立

目的：探索建立一种可快速鉴定儿童血流感染常见病原菌的多重PCR体系。方法通过16S rD－NA－PCR筛选出7种引起血流感染的常见病原菌,并针对这些病原菌设计特异性引物组合成多重PCR系统,检测该系统的特异性和敏感性;将该体系的检测结果与血培养及16S rDNA－PCR比较。结果该体系可以扩增出7种病原菌的特异性基因片段,病原菌检出率高于血培养且与16S rDNA－PCR差异无统计学意义,敏感性和特异性良好。结论本研究建立的多重PCR方法可快速、准确地鉴定引起儿童血流感染的常见病原菌,可作为快速检测方法在临床实验室中应用。     

海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌二重PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种能同步检测鉴定海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的二重PCR 方法,为手部及皮肤软组织感染海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌早期诊断、早期治疗服务。方法 通过GeneBank 数据库和文献查找海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的特有基因序列,设计2 对能扩增海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌特有序列的引物,建立能同步检测鉴定海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的二重PCR,特异性及敏感性。并初步应用该二重PCR 检测鉴定19 份临床考虑上肢感染NTM 的标本。结果 本研究成功地建立能同步检测鉴定海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的二重PCR,扩增产物的长度海分枝杆菌为429 bp,溃疡分枝杆菌为240 bp,检测其他非结核分枝杆菌时未出现阳性条带,敏感性试验最低可检测出0.508 pg/μl 海分枝杆菌,44.8 fg/μl 溃疡分枝杆菌。检测鉴定19 份临床标本,42.1%（8 份）为海分枝杆菌感染,15.8%（3 份）为溃疡分枝杆菌感染,42.1%（8 份）未检出病原菌。结论 本研究建立的二重PCR 可早期、快速地诊断手部及皮肤软组织感染海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌,为临床制定最佳治疗方案提供一定依据。     

啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种可同时检测肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌的多重PCR方法。方法根据已公布的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌16SrRNA基因序列设计三对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果三对引物能分别扩增出特异性的417 bp、364 bp、324 bp目的条带。最佳退火温度为52℃,镁离子浓度为2.0mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,引物浓度为0.625μmol/L。在此条件下多重PCR同时检测的肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌敏感度均为10 fg。结论本实验建立的多重PCR是一种敏感、特异、高效的方法,为同时检测啮齿动物中肝、胆汁、啮齿类三种螺杆菌奠定了良好的基础。     

布氏杆菌PCR检测方法的建立

根据编码31一kDa布氏杆菌蛋白的基因(BSCP31)，设计两对引物。对布氏杆菌R型(粗糙型)抗原及S型(光滑型)抗原、大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌分别采用两种提取、纯化DNA的方法，并以纯化的各细菌DNA为模板，分别进行内、外引物PCR反应及套式PCR反应，反应时以灭菌超纯水作为空白对照。结果显示：进行内、外引物P(、R反应和套式PCR反应时，布氏杆菌R型及S型均出现预期的扩增带594bp、460bp及460bp，且套式扩增后条带亮度明显增强，而作为验证PCR特异性或对照的大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌、灭菌超纯水均无扩增带。验证敏感性时用外引物对布氏杆茵R型、S型DNA进行扩增后，最低可检测到1pg的布氏杆菌DNA。     

HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:评估一个新设计的HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法.方法:以肝穿组织为检测标本,采用LightcycleTM探针,通过一对特殊引物,使HBVcccDNA可以扩增而病毒基因组不能扩增;同时利用一种依赖于ATP的特异性DNase提高反应的特异性,以此实现对cccDNA的检测.结果:成功建立了HBV cccDNA荧光定量PCR的检测方法,线性范围为2.5×101～2.69×109拷贝/ml.对5个病例的肝穿样本进行分析,其中3例为乙肝感染患者,并均接受抗病毒治疗达1年,另2例为乙肝阴性患者.检测结果如下:1)2例乙肝阴性患者的肝组织检测结果cccDNA及tDNA皆为阴性.2)接受拉米夫定治疗1年的病人tDNA为7.10×103拷贝/ml,cccDNA为2.64×103拷贝/ml;接受恩替卡韦治疗1年的病人tDNA为1.00×105拷贝/ml,cc-cDNA为4.04×103拷贝/ml;第3例病人接受拉米夫定治疗前tDNA为6.62×103拷贝/ml,cccDNA为3.03×102拷贝/ml,拉米夫定治疗1年后tDNA为5.19 × 103拷贝/ml,cccDNA为1.51×102拷贝/ml.结论:本研究结果显示,所建立的HBVcccDNA荧光定量PCR方法具有良好的线性范围,灵敏度、特异性及准确性均达到预期目标,而且检测所需样本量少,只需约1mg肝穿组织.可作为临床监测抗病毒治疗效果的有效手段和开展HBV复制调控研究的重要工具.     

泰泽菌PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立和应用泰泽菌巢式PCR检测方法。方法 参照日本学者Goto检测泰泽菌16S rDNA序列设计的两对引物,对PCR的检测条件进行了改进和优化。结果 巢式PCR反应的外引物能引导扩增出一条625 bp的DNA片段,内引物则能引导扩增出一条196 bp的DNA片段。此625 bp和196 bpDNA片段的大小均与Goto报道的结果完全一致。试验证明196 bp的阳性带为泰泽菌16S rDNA特异性保守片段。通过将泰泽菌阳性肝组织标本经系列稀释的试验表明,该PCR方法的检测灵敏度为2个菌。另外,将阳性对照标本扩增的625 bp DNA片段作核酸序列测定,发现其碱基序列与Goto报道的泰泽菌MSK株及RJ株16S rDNA序列均有99％同源性。结论 根据上述结果,我们应用本方法对普通级小鼠、大鼠、金黄色地鼠肝组织标本各5份、普通级豚鼠肝组织标本10份、沙鼠肝组织标本10份、MHV3感染的小鼠肝组织1份进行了初步检测,结果未发现带菌动物。     

隐孢子虫PCR检测体系的建立及其应用

目的建立快速检测隐孢子虫卵囊的PCR检测体系,以期在人群和食品及其饮用水腹泻原虫监测中推广应用。方法以隐孢子虫小亚基SSU r RNA和卵囊壁蛋白(COWP)为靶基因,设计巢式PCR和荧光PCR的引物和探针;以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,分别进行两种检测方法的敏感性和特异性试验;再用某水牛养殖场采集的58份牛粪样考核检测体系的应用价值。结果设计的巢式PCR引物和荧光PCR引物探针特异性都很高,巢式PCR对隐孢子虫DNA的检测最低OD阈值为2 pg隐孢子虫DNA;实时荧光PCR显示最低检测阈值为200 fg隐孢子虫DNA,灵敏性都比较高,实时荧光PCR的灵敏性比巢式PCR高1个数量级(10倍);58份检测样本中,有一份为阳性样本,PCR产物经序列分析显示为微小隐孢子虫。结论巢式PCR和实时荧光PCR检测隐孢子虫的特异性和灵敏性均高,操作简便,能为隐孢子虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型,具有人兽共患传播的可能性。     

ELISA法与荧光定量PCR法检测HSVⅡ感染的应用研究

目的：分析ELIS法和荧光定量PCR法联合检测生殖器范疹感染HSVⅡ的敏感性。方法：对191例生殖器疮疹患者同时运用改良的ELISA法和荧光定量PCR法进行检测。结果：ELISA法检测抗体阳性率为61．8％，荧光定量PCR法检测HSVⅡ阳性率85．9％，总阳性率92．1％。结论：荧光定量PCR法灵敏度优于ELISA法，两种方法联合进行检测可提高校测阳性率。     

布氏杆菌PCR检测方法的建立

根据编码 31- k Da布氏杆菌蛋白的基因 (BSCP31) ,设计两对引物。对布氏杆菌 R型 (粗糙型 )抗原及 S型(光滑型 )抗原、大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌分别采用两种提取、纯化 DNA的方法 ,并以纯化的各细菌 DNA为模板 ,分别进行内、外引物 PCR反应及套式 PCR反应 ,反应时以灭菌超纯水作为空白对照。结果显示 :进行内、外引物 PCR反应和套式 PCR反应时 ,布氏杆菌R型及 S型均出现预期的扩增带 5 94 bp、4 6 0 bp及4 6 0 bp,且套式扩增后条带亮度明显增强 ,而作为验证PCR特异性或对照的…     

猴腺病毒(SAdV)PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立SAdV特异的PCR检测方法并研究实验猴群和猴源性生物制品中SAdV感染或污染情况。方法比对分析多株SAdV序列,设计SAdV特异引物,优化PCR实验条件,建立的PCR方法经验证后检测实验猴群和猴源性生物制品,阳性产物测序并构建进化树。结果经特异性和敏感性鉴定,在设计的5对引物中确定一对最佳引物,可以区分SAdV和MAD,ICH,CELO且可以检测到的最小DNA量为47.9 pg/mL。PCR方法检测实验猴群,阳性率49.2%,测序及进化分析表明,SAdV感染型别呈广泛基因多样性。主要分布在G亚属和以SAdV-49为代表的分支。结论经测序验证,PCR检测方法具有很好准确性,初步应用表明我国实验猴群中SAdV高度流行,应加强实验猴群及相关生物制品中SAdV的监测,避免人类感染SAdV的潜在风险。