聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术在乙型肝炎病毒基因分型中的应用

目前乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)基因型的分型方法有 4种 ,即全基因测序[1] ,表面抗原基因 (Ｓ基因 )序列分析[2 ] ,聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (ＰＣＲ ＲＦＬＰ)基因分型[3 6] ,单克隆抗体酶联免疫吸附试验基因分型法[7] 。而ＰＣＲ ＲＦＬＰ方法是较成熟、准确、简单的方法 ,本研究用分析基因库软件和ＰＣＲ ＲＦＬＰ技术及Ｌｉｎｄｈ等[3] 基因分型方法对广州地区乙型肝炎无症状携带者 (ＡｓＣ)和患儿的基因型进行研究。一、材料和方法1.标本来源 :2 0 0 0年 1月至 9月本院就诊ＡｓＣ和乙型肝炎患儿血清 91份 ,其中ＡｓＣ血清 6 0份 …     

乙型肝炎病毒基因的巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分型及初步应用

目的 用改进的乙型肝炎病毒(HBV)巢式聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)的基因分型方法初探广州地区HBV基因型分布状态。方法 设计巢式PCR扩增前S基因，经限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切鉴别HBV A—G基因型；并对140份乙型肝炎患者血清进行基因分型，其中随机挑选3份进行克隆测序，并对20份患者血清进行巢式PCR—RFLP重复分型试验，以验证此分型技术的稳定性和特异性。同时采用PCR和巢式PCR对92份乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴性血清进行HBV DNA阳性率检测比较。结果 基因分型与测序结果一致；基因分型重复试验符合率100％；92份HBeAg阴性血清经PCR和巢式PCR扩增HBV DNA的阳性率分别为20．7％和68．5％。140份乙型肝炎患者血清中HBV基因型以C型(94份)和B型(42份)为主，偶见A型(4份)。结论 巢式PCR—RFLP HBV基因分型方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性，且操作简便，适用于临床和流行病学调查研究。     

构建乙型肝炎病毒基因参照品判断基因分型的探讨

目的利用乙型肝炎病毒（HBV）基因参照品判断HBV基因分型。方法自行制备HBV—S区基因参照品A、B、C、D型并测序及比较同源性，利用限制性内切酶MboI、EarI酶切参照品和样品扩增产物，从而确定样品基因型。利用该方法对克拉玛依地区272例HBV—DNA阳性血清基因分型。结果测序证实，HBV基因参照品与39例GenBank序列同源性均在96％以上。272例样品成功分型241例（88．6％）。检出B、C、D型，未检测到A型。抽检12例测序同源性大于96％。结论依据基因参照品核酸碱基片段大小判断分型，简明直观，适用于大样本的筛检及临床应用。     

乙型肝炎病毒基因分型的研究现状

乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝DNA病毒科嗜肝病毒素，它是已知的引起人类疾病的最小DNA病毒。HBV感染呈世界性分布，有血清学证据表明全世界约有20亿人曾经或持续感染乙肝病毒。1988年Okamoto首先提出了乙肝病毒基因分型法，近年来，随着分子生物技术的发展，人们对乙肝病毒基因型进行了大量研究。本文对乙型肝炎病毒基因型及临床方面研究进展综述如下：     

上海地区部分乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析

目的研究上海地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布情况。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测136例HBV DNA阳性的上海籍HBV感染者的基因型。结果136例HBV DNA阳性的HBV感染者中基因型B 43例,占31.6%,基因型C 92例,占67.6%,基因型D仅有1例,未发现基因型A、E、F。结论上海地区存在HBV基因B、C、D型,基因型A、E、F是否存在仍需扩大样本作进一步深入研究。     

上海地区部分乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析

目的 研究上海地区乙型肝炎病毒（HBV）基因型分布情况。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）检测136例HBV DNA阳性的上海籍HBV感染者的基因型。结果 136例HBV DNA阳性的HBV感染者中基因型B43例,占31．6％,基因型C92例,占67．6％,基因型D仅有1例,未发现基因型A、E、F。结论 上海地区存在HBV基因B、C、D型,基因型A、E、F是否存在仍需扩大样本作进一步深入研究。     

不同类型乙型肝炎患者HBV基因型的分布

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）各种基因型在不同类型乙型肝炎患者中的分布.方法 用PCR结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测56例HBV感染的肝癌、58例肝硬化、60例慢性乙型肝炎患者以及60例HBV无症状携带者血清HBV基因型.结果 无症状携带者中B基因型为46.7%（28/60）,C基因型为33.3%（20/60）,D基因型为20.0%（12/60）;慢性乙型肝炎组B基因型为41.7%（25/60）,C基因型为36.7%（22/60）,D基因型为21.7%（13/60）;肝癌患者中B基因型为33.9%（19/56）、C基因型为60.7%（34/56）、D基因型为5.4%（3/56）;肝硬化患者中B基因型为31.0%（18/58）、C基因型为63.8%（37/58）,D基因型为3.5%（2/58）.结论 在慢性乙型肝炎和无症状携带者中以B基因型为优势感染毒株,而肝硬化和肝癌患者则以C基因型为优势感染毒株.     

应用多重PCR-RFLP技术检测头发、口腔腭粘膜的ABO基因型

目的探讨对头发、口腔腭粘膜等组织标本进行ABO基因分型的可行性.方法应用多重聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(多重PCR-RFLP)技术,检测8例头发和6例口腔腭粘膜标本的ABO基因型,标本的基因组DNA经2对引物同时进行扩增,扩增后的产物同时用Msp Ⅰ和Kpn Ⅰ 2种限制酶进行消化,通过消化后产生的片段即可判断结果.然后将分析结果与血清学技术检测的ABO表现型和受检者血液标本的基因型进行比较.结果 14例标本共检出6种ABO基因型,与表现型和血液标本的基因型结果完全一致.结论该方法操作方便,重复性、稳定性好,可鉴定15种基因型,应用于法医学鉴定具有可行性.     

应用多重PCR-RFLP技术检测头发、口腔腭粘膜的ABO基因型

目的　探讨对头发、口腔腭粘膜等组织标本进行ABO基因分型的可行性。方法　应用多重聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (多重PCR RFLP)技术 ,检测 8例头发和 6例口腔腭粘膜标本的ABO基因型 ,标本的基因组DNA经 2对引物同时进行扩增 ,扩增后的产物同时用MspⅠ和KpnⅠ 2种限制酶进行消化 ,通过消化后产生的片段即可判断结果。然后将分析结果与血清学技术检测的ABO表现型和受检者血液标本的基因型进行比较。结果　 14例标本共检出 6种ABO基因型 ,与表现型和血液标本的基因型结果完全一致。结论　该方法操作方便 ,重复性、稳定性好 ,可鉴定 15种基因型 ,应用于法医学鉴定具有可行性。     

简便HBV基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立

目的 建立简便HBV基因型S基因PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分型方法(以下简称“简便PCR-RFLP法”),并评价其临床应用价值.方法 临床诊断研究.查阅并比较GenBank中128株HBV(基因型A～D型)S基因片段(S区nt253-687),设计限制性内切酶Hinf Ⅰ、Ear Ⅰ、Apo Ⅰ鉴别A～D基因型分型方法,并评价简便PCR-RFLP法检测HBV DNA的最低检测下限、重复性;然后,用该方法检测50例慢性乙型重型肝炎患者的HBV基因型,同时用直接测序法验证简便PCR-RFLP法检测HBV基因型的一致性.结果 建立了简便PCR-RFLP法HBV基因分型的方案,通过限制性内切酶Hinf Ⅰ一次酶切就可分出我国流行的B型、C型、D型等毒株及B/C混合型.随机抽取3份标本,不同稀释浓度下,用简便PCR-RFLP法重复检测HBV基因型,分型结果均与原血清完全一致,且最低检测下限约为7 ～9 IU/ml.经Hinf Ⅰ酶一步酶切后,用简便PCR-RFLP法从50例患者标本中,检出B型23份、C型10份;经直接测序法验证,从PCR产物中检出B型23份、C型10份,2种方法检测B、C型基因结果完全一致(Kappa=1.00,P=0.001),简便PCR-RFLP法检出B/C混合型9份,优于PCR产物直接测序法(0份,x2=18.00,P=0.001).Hinf Ⅰ酶一步酶切后分出的ABD型8份,进一步酶切及应用PCR产物直接测序法检测均为B型变异株.结论 建立的简便PCR-RFLP法对HBV基因分型有较高的灵敏度和重复性,且在检出混合基因型方面具有优势,更为简便.     

鉴别乙型肝炎病毒野毒株及E阴性突变株的新方法

目的同时检测乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）野毒株及２种ＨＢｅＡｇ阴性突变株（Ｅ阴性突变株）。方法用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法，以人为改变核苷酸序列的２对引物，自乙型肝炎患者血清ＤＮＡ中，同时扩增出１４８ｂｐ及１０２ｂｐ两种产物，根据限制性内切酶Ｂｓｕ３６Ⅰ和ＡｆｌⅢ对ＰＣＲ产物消化后片段长度多态性的分析，鉴别ＨＢＶ野毒株Ｍ０与２种Ｅ阴性突变株Ｍ１、Ｍ２。结果突变株Ｍ１的１０２ｂｐ扩增产物经Ｂｓｕ３６Ⅰ酶切，可产生一８２ｂｐ片段；突变株Ｍ２除１０２ｂｐ产物含Ｂｓｕ３６Ⅰ酶切点外，其１４８ｂｐ产物经ＡｆｌⅢ酶切后，可产生一１１７ｂｐ片段；野毒株Ｍ０的２种产物不含上述酶切点。用该法对３４例ＨＢｅＡｇ阴性患者进行检测，结果与寡核苷酸探针杂交完全一致。结论该方法简便、准确，为ＨＢＶ变异株的检测探索了一条非放射性的新途径。     

裂解酶片段长度多态性在沙眼衣原体主要外膜蛋白基因分型中的应用研究

目的 建立沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白基因（ompl）上游引物5′末端地高辛标记裂解酶片段长度多态性（CFLP）分型方法，并对Ct临床分离株进行分型。方法 取临产孕妇宫颈刮片及其新生儿鼻咽拭子组成母婴配对标本300对605份，用套式聚合酶链反应扩增Ct ompl第四可变区；用建立的CFLP方法对其进行基因分型。结果 孕妇宫颈Ct检出率11％（33／300），母婴传播率24．2％（8／33）；8对Ct阳性母婴配对标本CFLP图谱呈四类，经测序证实分别为E、F、H、D型（各3、2、2、1对），各占37.5％、25％、25％和12．5％，且每对母子CFLP图谱完全一致；同一标本不同批次和相同基因型不同标本的CFLP图谱一致。结论 上游引物5′末端地高辛标记Ct ompl CFLP分型方法灵敏度高、重复性好、操作简便、快速、费用相对低廉，无放射污染，是一种极具潜力的Ct基因分型方法。     

乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量与乙型肝炎病毒血清免疫学标志相关性的研究

荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)的特点是敏感性、特异性好。许多研究证明，乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)定量检测是衡量乙型肝炎传染性的最精确指标．是确定HBV感染不同复制状态的非常有价值的检测手段。有关FQ-PCR法进行HBV-DNA定量与HBV血清免疫学标志相关性研究较少见报道。我们用FQPCR检测了635例患者     

小儿常见感染菌16S—23S rRNA基因区间的分子生物学研究

目的：探讨聚合酶链反应（PCR）加限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析在细菌rDNA区间检测中的应用。方法：以16S－23S RNA基因区间为靶序列,设计引物,选择合适的内切酶,采用PCR法加RFLP法检测标准菌株及临床菌株的rDNA区间。结果：26株不同的标准菌株经PCR扩增后,分别出现一条带,两条带,三条带及多条带的不同DNA图谱,敏感性试验可检出2．5CFU的细菌,与人类基因组DNA,真菌及病毒无交叉反应,其中14种菌经一步PCR扩增即可区分,另12种菌除肺炎克雷伯氏菌与坚韧肠球菌经Hinf I或Alu I酶切后仍不能区分外,其余经其中一内切酶酶切后均能区分,32例血培养阳性标本均扩增出与相应标准菌株相一致的图谱。结论：16S－22S rRNA区间基因PCR．扩增加RFLP技术检测细菌rDNA区间,具有特异,敏感,快速,准确的特点,为细菌感染的病原诊断提供新的科学依据。     

阿尔茨海默病患者神经型尼古丁受体α7亚单位基因多态性：发现一个新的GTG三碱基插入突变

目的：探讨阿尔茨海默病患者神经型尼古丁受体α7亚单位基因多态性情况。方法：选择2001—01—01／2002—12—03贵阳医学院附属医院及贵阳中医学院附属医院住院的贵州籍汉族阿尔茨海默病患者12例。年龄62～81岁，平均（70．0&;#177;21．9）岁，其中男9例，女3例，病程均超过1年。用聚合酶链式反应一温度梯度凝胶电泳分析阿尔茨海默病患者神经型尼古丁受体α7亚单位基因全部10个外显子及其两侧的部分内含子DNA片段，电泳条带异常者进行DNA序列分析，借以了解贵州汉族阿尔茨海默病患者的神经型尼古丁受体α7亚单位基因多态性情况。结果：12例阿尔茨海默病患者中，含外显子7和部分内含子7序列的DNA片段温度梯度凝胶电泳结果均出现两条带，在神经型尼古丁受体α7亚单位基因上发现1个新的突变位点，即在外显子7附近的内含子7上的117643＋GTG三碱基插入突变。结论：在贵州汉族阿尔茨海默病患者的神经型尼古丁受体α7亚单位基因上发现一个新的多态性位点，与阿尔茨海默病的发生是否有关联尚需进一步的研究。     

乙型肝炎病毒基因型分型方法的研究进展

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布。我国为HBV感染高发区，一般人群HBsAg阳性率9．7％。过去对HBV的血清型研究较多，曾认为血清型是基因型表达的表现型。事实上，d或y是由HBsAg的第122密码为赖氨酸或精氨酸所决定；W或r是由第160密码为赖氨酸或精氨酸决定，因而s基因核苷酸序列365和479任一A／G的点突变，均可以引起血清型的改变，     

新疆哈萨克族居民载脂蛋白E基因多态性与血脂的关系

目的探讨新疆哈萨克族居民载脂蛋白E（apoE）基因多态性与血脂的关系。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）对100例新疆石河子地区哈萨克族高脂血症患者和91例健康对照者进行apoE基因分型,并对其血脂水平进行检测。结果高脂血症患者总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL—C）水平明显高于健康对照组（P〈0．01）。共检出5种基因型,两组各基因型、等住基因频率分布无差异（P〉0．05）,均以野生型E3／3基因型和￡3等位基因为主。ε2等位基因携带者的LDL—C水平在两组中与其他等位基因携带者相比均有统计学差异。结论apoE基因多态性对新疆石河子地区哈萨克族的血脂、载脂蛋白水平有影响,即ε2等位基因携带者的LDL—C、apoB水平较低,而84等位基因携带者的LDL—C、apoB水平较高。     

载脂蛋白E基因型分型方法

目的建立载脂蛋白Ｅ基因型分型聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法。方法用特异的探针对氨基酸１１２和１５８多形基因区基因组的ＤＮＡ扩增，产物用ＨｈａⅠ酶消化，其片段在４％琼脂糖凝胶分离。结果经消化的载脂蛋白Ｅ片段在琼脂糖上，ε２／ε２为９１、８３、３８ｂｐ，ε３／ε３为９１、４８、３８ｂｐ，ε４／ε４为７２、４８、３８ｂｐ，ε２／ε３为９１、８３、４８、３８ｂｐ，ε２／ε４为９１、８３、７２、４８、３８ｂｐ，ε３／ε４为９１、７２、４８、３８ｂｐ。３００名献血员其载脂蛋白Ｅ基因分布频率分别为ε２／ε２０％，ε３／ε３７４％，ε４／ε４０％，ε２／ε３１６％，ε２／ε４２％，ε３／ε４８％。结论以聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法进行载脂蛋白Ｅ基因型分型，具有清晰、简便、快速等优点     

HOTAIR基因多态性与结直肠癌发病风险

目的探讨HOTAIR基因rs920778、rs4759314、rs1899663多态性位点与结直肠癌(colorectal cancer,CRC)易感性的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法对200例CRC患者和200例健康人对照组HOTAIR基因rs920778、rs4759314和rs1899663多态性位点进行基因分型,并通过SHEsis在线软件构建单倍型。结果 rs1899663基因型频率在病例组和健康人对照组间差异有统计学意义(P=0.009)。与GG基因型相比,该位点TT基因型携带者与CRC发病风险降低相关(OR=0.36,95%CI:0.15～0.84,P=0.019),而GT/TT基因型携带者与CRC的风险降低亦存在相关性(OR=0.56,95%CI:0.37～0.85,P=0.006)。结论 HOTAIR基因rs1899663位点的T等位基因与CRC的发生率降低相关,rs920778和rs4759314位点的多态性与CRC的遗传易感性无关。     

Cystatin C基因5’端-157G/C突变与阿尔茨海默病的相关性研究

目的探讨Cystatin C基因5’端-157G/C突变与中国昆明地区汉族人阿尔茨海默病是否存在关联。方法运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法在134例无亲缘关系之中国昆明汉族人(正常对照组73例,阿尔茨海默病患者61例)中对Cystatin C基因变异进行检测。同时检测两组人群血浆Cystatin C之浓度。结果在阿尔茨海默病患者中GG,GC和CC基因型频率分别为16.39%,50.82%和32.79%;正常对照组中分别为26.03%,41.10%和32.87%。G等位基因频率在阿尔茨海默病组中和正常对照组中分别为41.80%和46.58%。基因型频率和等位基因频率在阿尔茨海默病患者与对照组之间无统计学差异。两组人群血浆Cystatin C浓度也无统计学差异。结论在中国昆明汉族人群中存在Cystatin C基因5’端-157G/C变异的多态性,但可能对阿尔茨海默病的发生不起作用。