树鼩海马微灌流谷氨酸和钙所致线粒体应激及银杏内酯B的影响

目的观察树鼩海马微环境中谷氨酸(Glu)及钙(Ca2 )改变对细胞色素C(CytC)释放以及caspase凋亡基因激活的影响,探讨银杏内酯B(GB)干预海马神经元线粒体应激的分子机制。方法使用单泵等速微灌流系统行树鼩海马Glu及Ca2 微灌流,24h后用免疫组化法观察海马神经元CytC蛋白表达;免疫印迹法检测线粒体及胞质的CytC含量;实时荧光定量PCR技术检测海马caspase-3及caspase-9 mRNA的含量。微灌流Glu和Ca2 溶液后6h于舌下静脉注射银杏内酯B5mg/kg,24h后观察上述指标的改变。结果树鼩海马微灌流Glu和Ca2 溶液后24h,线粒体CytC含量显著下降,而胞质部分出现CytC;海马组织caspase-3、caspase-9 mRNA明显升高。GB治疗组线粒体CytC含量增多,胞质中仍有CytC存在,而海马组织caspase-9 mRNA显著降低,但caspase-3 mRNA无差异。结论海马微环境中Glu与Ca2 的大量堆积促进线粒体CytC的释放,可能是激活caspase级联反应而导致线粒体应激、神经元继发损伤的始动环节;GB的神经保护效应可能与其特异性拮抗血小板活化因子(PAF)受体,抑制Ca2 内流,部分阻滞CytC释放入胞质,从而减少caspase-9基因转录有关。     

创伤后应激障碍大鼠海马Ca2+/钙调蛋白的改变

目的 观察创伤后应激障碍（PTSD）大鼠海马神经元Ca²⁺信号及钙调蛋白（CaM）的表达变化,探讨PTSD行为异常的神经生物学机制。 方法 采用国际认定的无连续单一应激(SPS)方法刺激建立大鼠PTSD模型。成年健康雄性Wistar大鼠60只,随机分为SPS模型的12h、1d、4d、7d组及正常对照组,采用荧光探针标记法、免疫组织化学、免疫印迹和RT-PCR法检测Ca²⁺含量和CaM的表达变化。结果 SPS刺激后大鼠海马神经元内游离Ca²⁺浓度（nmol/L）于12h内升高,24h增至顶峰,7d恢复正常。CaM的表达于SPS刺激后1d表达最多,之后渐趋下降。 结论 海马Ca²⁺信号调控与CaM的表达变化可能是PTSD大鼠情感行为异常的重要病理生理基础之一。     

谷氨酸诱导海马神经元凋亡涉及线粒体释放细胞色素C

目的：建立体外谷氨酸诱导神经元兴奋损伤模型，探索其凋亡发生是否通过线粒体信号转导途径介导的细胞色素C（Cyt C）释放而实现，为今后干预性使用神经保护剂提供依据。方法:分离及培养新生Wistar大鼠海马神经元，选用合适谷氨酸浓度建立神经元损伤模型；利用LDH测定及流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测谷氨酸暴露后不同时点神经元凋亡及坏死的动态改变；采用Western blotting法检测caspase-3活性及线粒体内和胞浆内Cyt C水平动态变化。结果:谷氨酸诱导神经元损伤呈明显浓度及时间依赖性，50 μmol/L浓度可使LDH释放量明显增加 (18.4%,P<0.05)，暴露后6 h凋亡率显著增加；凋亡发生前，神经元caspase-3活性已明显增高（3 h），6 h达高峰；线粒体Cyt C释放发生在caspase-3增高前，30 min时胞浆内Cyt C水平即明显增加（P<0.05），3 h胞浆内Cyt C水平超过线粒体内，而线粒体内Cyt C水平进行性减少。结论:50 μmol/L谷氨酸可诱导海马神经元凋亡，凋亡机制可能是通过损伤线粒体膜，使Cyt C易位释放入胞浆激活caspase级联反应而致。     

钙调神经磷酸酶信号通路参与PGF2α诱导的心肌细胞肥大

目的： 研究前列腺素F₂α（PGF₂α）诱导心肌细胞肥大的作用及其细胞内信号转导通路。方法：利用乳鼠心肌细胞培养，以细胞直径、蛋白质含量和心房利钠因子（ANF）mRNA表达为心肌肥大反应指标，观察PGF₂α致心肌肥大效应。采用Fura-2/AM为荧光指示剂测定心肌细胞内钙浓度（［Ca²⁺］_i）；RT-PCR法半定量测定mRNA表达；Western blotting方法检测蛋白表达。结果：随着PGF₂α 浓度升高（10^-10-10^-5 mol/L），心肌细胞直径、蛋白含量和［Ca²⁺］_i均明显高于溶剂对照组（P﹤0.01）；PGF₂α 10^-7 mol/L使ANF mRNA表达明显高于对照组（P﹤0.01）；钙调神经磷酸酶（CaN）mRNA及CaN信号通路（含CaN及其下游因子NFAT₃和GATA₄）蛋白的表达亦明显高于对照组（P﹤0.05）。加入CsA（CaN阻断剂）后，PGF₂α诱导的心肌细胞肥大和［Ca²⁺］_i升高的作用明显降低（P﹤0.01），CaN mRNA和CaN信号通路蛋白的表达亦明显减少（P﹤0.05）。结论： PGF₂α诱导的心肌细胞肥大至少部分与其升高［Ca²⁺］_i从而激活CaN信号转导通路有关。     

JNK通路促进大鼠脑缺血再灌注海马神经元凋亡

目的:探讨c-JunN端激酶(JNK)通路在大鼠脑缺血再灌注后海马神经元凋亡中的作用。方法:雄性SD大鼠90只,随机分为假手术组、全脑缺血再灌注组、全脑缺血再灌注+JNK抑制剂(SP600125)组、全脑缺血再灌注+JNK激动剂(茴香霉素)组和全脑缺血再灌注+溶剂对照组,每组再灌注后24h取材。分别采用免疫组化、Westernblotting和实时荧光定量PCR检测海马神经元caspase-3蛋白和mRNA的表达;采用TUNEL染色检测海马神经元凋亡情况。结果:全脑缺血再灌注组caspase-3蛋白和mRNA表达较假手术组增加(P<0.05);与全脑缺血再灌注组相比,全脑缺血再灌注+JNK抑制剂组caspase-3蛋白和mRNA表达均降低(P<0.05),而全脑缺血再灌注+JNK激动剂组caspase-3蛋白和mRNA表达均增加(P<0.05),全脑缺血再灌注+溶剂对照组则无明显变化(P>0.05)。各组海马神经元凋亡趋势与caspase-3蛋白和mRNA变化趋势一致。结论:JNK通路的激活可增加大鼠脑缺血再灌注后海马神经元caspase-3的表达,促进海马神经元凋亡。     

树鼩海马微环境谷氨酸异常与rCBF相互作用的探讨

目的:探讨海马微环境内异常谷氨酸与局部脑血流(regional cerebral blood flow,rCBF)互动变化及其可能机制。方法:单泵等速微灌流系统分别行树鼩海马高、中、低谷氨酸微灌流4 h,通过激光多普勒血同时NM-DA-NR1表达增加流计测量海马CA1区rCBF含量;并用免疫组化观察海马CA1区血管内皮细胞NMDA-NR1表达。微灌流谷氨酸溶液后原位灌流其受体拮抗剂MK-801,并观测上述指标改变。结果:树鼩微环境内随着谷氨酸的增加海马rCBF逐渐降低(P<0.01),其中高浓度谷氨酸微灌流后的rCBF(PU)最低(6.9±0.3,P<0.01)同时NMDA-NR1表达增加(P<0.01),使用Glu受体NMDA拮抗剂MK-801后可显着升高rCBF,同时可降低NM-DA-NR1表达(P<0.01)。结论:海马神经元微环境中Glu增多时,可诱导局部脑血管内皮细胞损伤继而可能是诱发海马神经元损伤的原因之一。     

肝门阻断再灌注对脑兴奋性氨基酸及受体mRNA表达的影响

目的： 探讨无肝期后的再灌注对脑组织兴奋性氨基酸（EAAs）及其受体mRNA表达的影响。方法：分别采用血气分析、高效液相色谱荧光检测和半定量RT-PCR方法，研究大鼠肝门阻断和假手术组再灌注6 h、12 h和24 h后门静脉电解质和pH、脑组织Glu、Asp含量以及大脑皮层中NMDAR mRNA的相对含量表达的差异，观察无肝期后再灌注损伤对肝外远隔脏器脑EAAs及NMDA受体mRNA表达的的影响。结果：肝门阻断期间门静脉pH显著降低，［K⁺］升幅超过1倍，但开放后逐渐恢复；［Ca²⁺］于再灌注后持续下降至12 h；脑皮层中的Glu和Asp再灌注后分别在6 h、24 h出现2个高峰［Glu:(349±145) μg·g^-1wt,(456±203) μg·g^-1wt vs (238±24) μg·g^-1wt,(225±59) μg·g^-1wt;Asp: (134±50) μg·g^-1wt,(166±50) μg·g^-1wt vs (99±24) μg·g^-1wt,(71±20) μg·g^-1wt］；NMDAR亚单位NR1mRNA的表达在再灌注后显著升高后逐渐下降［(1.63±0.06) μg·g^-1wt vs (1.18±0.05) μg·g^-1wt;(1.73±0.06) μg·g^-1wt vs (1.17±0.03) μg·g^-1wt］,而NR2B mRNA在12 h升高(1.75±0.04 vs 1.18±0.05)，2者24 h时均恢复至对照组水平。结论：肝门阻断后肝和肠道再灌注过程可启动神经突触前Glu大量释放和重吸收抑制，引起脑皮层EAAs的堆积，同时刺激NMDARmRNA的表达，通过Glu - NMDAR途径可能引发脑损伤。     

创伤后应激障碍大鼠海马细胞凋亡中细胞色素C的表达与释放

目的:观察创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元凋亡和细胞色素C(Cyt C)的表达与释放,探讨细胞凋亡与Cyt C的关系.方法:采用单一延长应激(SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型,取SPS刺激后4、 7、 14、 28d组和正常对照组.用原位末端标记法观察神经元凋亡,免疫组织化学和免疫印迹法检测Cyt C蛋白的表达,酶电镜组织化学术观察Cyt C的释放.结果:SPS刺激后4d线粒体肿胀,外膜破裂,Cyt C释放.胞质中Cyt C蛋白于SPS刺激后4d达到高峰并维持较高水平,SPS刺激后7d逐渐下降.凋亡细胞于SPS刺激后7d达高峰.结论:Cyt C从线粒体释放入胞质是引发PTSD大鼠海马神经元凋亡的关键步骤.     

正常和缺血大鼠脑线粒体对环孢菌素A的反应

目的：研究正常和缺血脑线粒体对环孢菌素A（CsA）的反应，并观察线粒体ATP敏感性钾通道与线粒体渗透性转换孔的关系。方法：本实验采用分光光度法，在分离线粒体上观察线粒体渗透性转换孔抑制剂和线粒体ATP敏感性钾通道开放剂对正常与缺血脑线粒体肿胀的影响。结果：在正常脑线粒体，0.5 μmol/L和 1 μmol/L CsA以及30 μmol/L 二氮嗪（DE）均可明显减轻Ca²⁺诱导的线粒体肿胀程度，苍术苷（Atr）能取消此作用，而5 μmol/L CsA不能减轻线粒体的肿胀。在全脑缺血5 min后的线粒体，0.5 μmol/L CsA可减轻Ca²⁺诱导的线粒体肿胀，该作用可被Atr取消，但1 μmol/L CsA不能减轻肿胀；30 μmol/L DE也可明显减轻Ca2+诱导的缺血脑线粒体肿胀程度，100 μmol/L和200 μmol/L 5-羟基癸酸盐（5-HD）和Atr均可取消其作用。结论：缺血脑线粒体对线粒体渗透性转换孔开放的抑制剂比正常脑线粒体更为敏感，脑线粒体ATP敏感性钾通道激活可能是抑制线粒体渗透性转换孔开放的调控机制之一。     

维生素E对D-半乳糖诱致衰老小鼠脑抗氧化能力、钙稳态和线粒体DNA（mtDNA）损伤的影响

目的：探讨维生素E（Vit-E）对D-半乳糖诱致衰老小鼠脑抗氧化能力、胞浆游离Ca²⁺（［Ca²⁺］i）稳态和线粒体DNA（mtDNA）损伤的影响。方法:小鼠连续皮下注射（sc）D-半乳糖（1 000 mg·k^-1·d^-1）8周制备衰老模型，并于第3周开始给予维生素E（100 mg· kg^-1；250 mg· kg^-1）处理；8周后采用水迷宫测定小鼠学习记忆能力，并取脑组织测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性，测定一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活性。Fura-2/AM负载法和PCR方法分别测定海马神经细胞［Ca²⁺］i浓度和mtDNA缺失突变。结果:维生素E处理能明显改善D-半乳糖诱致衰老小鼠学习记忆障碍，抑制脑组织NOS活性，降低NO含量，提高GSH-Px和SDH活性，降低［Ca²⁺］i水平（P＜0.01， P＜0.05），并防止mtDNA缺失突变的发生。结论:维生素E具有提高衰老小鼠脑抗氧化能力和调节［Ca²⁺］i稳态的作用，并抑制氧化应激引起的mtDNA损伤，从而改善衰老动物学习记忆障碍。     

Possible mechanisms of Cyclosporin A ameliorated the ischemic microenvironment and inhibited mitochondria stress in tree shrews’ hippocampus

Objective: The ischemic brain damage is always accompanied by the significant accumulation of glutamate and calcium ions (Ca²⁺). Our objectives were to observe the effects of glutamate and Ca²⁺ overloading in tree shrew's hippocampal microenvironment on mitochondrial stress resulting in cytochrome C release and caspase apoptotic gene activation, and to explore the possible mechanism of Cyclosporin A (CsA) inhibiting mitochondrial stress. Methods: The thrombotic focal cerebral ischemia was induced by photochemical reaction in tree shrews. The extracellular contents of amino acidic neurotransmitters and Ca²⁺ were determined, respectively, with high performance liquid chromatography (HPLC) and atomic absorption spectrophotometry at 4, 24 and 72 h after cerebral ischemia. The glutamate–calcium chloride solutions were microperfused into hippocampus by a kind of single-pumped push–pull perfusion (SPPP) system under three-dimensional orientation instrument in tree shrews. At 24 h, the expression of cytochrome C was observed in perfused lateral hippocampus by immunochemistry. Also, the hippocampus was removed, then mitochondria and cytoplasmic fragment were divided by low temperature centrifugation and the distribution of cytochrome C was assessed through Western blot. Real time fluorescence polymerase chain reaction was used to evaluate the relative amounts of caspase-3 and caspase-9 mRNA. In the treated group, CsA (40 mg/kg) was intravenously injected at 6 h after the microperfuse or cerebral ischemia. The glutamate–calcium solutions were perfused into the hippocampus and inspected the above-mentioned items at 24 h. Data were compared between the two groups (ischemia group vs. sham group, or ischemia group vs. CsA group). Results: Thrombotic cerebral ischemia led to significant increase in extracellular glutamate and Ca²⁺ level of hippocampus (P < 0.01). The cerebral ischemia group and the microperfusion group, which cytochrome C immunoreactivity increased and Western blot analysis demonstrated that the cytochrome C content in the mitochondria of hippocampal cells decreased (P < 0.01), but the cytochrome C in the cytosol increased (P < 0.01). When CsA was intravenously injected at 6 h after the microperfusion or cerebral ischemia, the cytochrome C expression weakened and its release was diminished to a lesser extent. By real time PCR, in relation to the control group, the caspase-3 and caspase-9 mRNA was higher in the glutamate–calcium chloride solution perfused group. CsA treatment cut down the contents of caspase-3 mRNA and caspase-9 mRNA (P < 0.01). Conclusions: It is a primary factor that glutamate and Ca²⁺ accumulate in hippocampal microenvironment, which results in proapoptotic protein cytochrome C release from mitochondria into cytoplasm and caspase cascade activation, and finally mitochondria stress and neuronal secondary injury appear. The neuroprotection of CsA is in relation to inhibiting glutamate receptor overactivation and reducing the Ca²⁺ influx, which can decrease cytochrome C release and caspase mRNA transition.     

线粒体凋亡路径参与创伤后应激障碍大鼠海马神经元凋亡的调控

目的观察Caspase-9、Caspase-3和细胞色素C(CytC)在创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元中的表达及相互关系,探讨PTSD大鼠海马神经元凋亡的信号转导机制。方法成年雄性Wistar大鼠60只,采用国际认定的无连续单一应激(SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型,取SPS刺激后1d、4d、7d、14d、28d组和正常对照组。应用免疫组织化学、免疫荧光和免疫印迹法检测Caspase-9、Caspase-3和CytC蛋白的表达。结果免疫组织化学和免疫荧光结果显示,CytC蛋白于SPS刺激后4d在海马神经元胞质内的表达达到高峰,并维持较高水平,SPS刺激后7d逐渐下降。SPS刺激后,Caspase-9和Caspase-3阳性表达增强,均于SPS刺激后7d达到高峰。免疫印迹结果显示,与正常对照组相比,模型组海马胞质内CytC蛋白水平明显上调,于SPS刺激后4d达到较高水平。而SPS刺激后线粒体中CytC蛋白水平则显著下降。在正常对照组,无Caspase-9和Caspase-3活性片段;在模型组,出现Caspase-9和Caspase-3活性片段,两者均于SPS刺激后7d达到高峰,14d开始下调。结论神经元凋亡可能是导致PTSD大鼠海马萎缩的重要机制之一;线粒体通路的激活参与了PTSD大鼠海马神经元凋亡的调控。     

Evidence for a Novel, Caspase-8-Independent, Fas Death Domain-Mediated Apoptotic Pathway

Certain caspase-8 null cell lines demonstrate resistance toFas-induced apoptosis, indicating that the Fas/FasL apoptoticpathway may be caspase-8-dependent. Some reports, however, haveshown that Fas induces cell death independent of caspase-8. Herewe provide evidence for an alternative, caspase-8-independent,Fas death domain-mediated apoptotic pathway. Murine 12B1-D1 cellsexpress procaspase-3, -8, and -9, which were activated upon thedimerization of Fas death domain. Bid was cleaved andmitochondrial transmembrane potential was disrupted in thisapoptotic process. All apoptotic events were completely blockedby the broad-spectrum caspase inhibitor Z-VAD-FMK, but not byother peptide caspase inhibitors. Cyclosporin A (CsA), whichinhibits mitochondrial transition pore permeability, blockedneither pore permeability disruption nor caspase activation.However, CsA plus caspase-8 inhibitor blocked all apoptoticevents of 12B1-D1 induced by Fas death domain dimerization. Ourdata therefore suggest that there is a novel,caspase-8-independent, Z-VAD-FMK-inhibitable, apoptotic pathway in12B1-D1 cells that targets mitochondria directly.     

Et-DHA通过激活线粒体途径和T细胞granzyme B诱导HepG2细胞凋亡

 目的：本研究探讨了二十二碳六烯酸乙酯（Et-DHA）对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响。方法：HepG2细胞用于检测Et-DHA的抑癌活性,MTT法检测Et-DHA对HepG2细胞的直接抑制作用,Hoechst 33258荧光染色观察细胞的形态特征,ELISA法检测Et-DHA处理后HepG2细胞的活性氧簇（ROS）释放量、总超氧化物歧化酶（SOD）和caspase-9活性,Western blotting法检测胞质和线粒体中Bax、Bak、Bid、Bcl-2、Smac和细胞色素C(Cyt C),以及胞质中cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的水平;T细胞与HepG2细胞共培养,进一步观察Et-DHA处理后T细胞的增殖对HepG2细胞活性的影响,并检测了颗粒酶（granzyme）B的水平。结果：Et-DHA显著抑制HepG2细胞的生长（P＜0.05）,这种抑制作用具浓度效应和时程效应;Et-DHA处理后HepG2细胞的ROS释放量增加,但总SOD活性无明显变化,caspase-9活性显著上升（P＜0.05）;线粒体上的促凋亡蛋白Bax、Bak和Bid水平增加,而抑凋亡蛋白Bcl-2以及线粒体中Cyt C和Smac的水平降低,胞质中的Cyt C、Smac、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3以及cleaved Bid水平呈剂量性升高。另外 T细胞和HepG2细胞共培养组在Et-DHA的诱导下,HepG2细胞的凋亡程度与Et-DHA单独作用时相比进一步增加。在Et-DHA刺激下,T细胞内granzyme B上调,释放到HepG2 细胞内的granzyme B明显增多。结论:Et-DHA可能主要通过线粒体内源性途径以及caspase-8途径,激活caspase-3,诱导HepG2细胞凋亡,以及通过间接活化T细胞,促使 granzyme B增多,从而增强对HepG2细胞的毒性作用。     

大豆异黄酮对脑缺血/再灌注诱导的线粒体损伤和脑细胞凋亡的影响

 目的:研究大豆异黄酮（SI）对全脑缺血/再灌注大鼠脑组织线粒体超微结构、细胞凋亡和细胞色素C（Cyt-C）、caspase-3及caspase-9表达的影响,探讨大豆异黄酮对脑缺血/再灌注损伤的作用及机制。方法: 60只健康成年SD 大鼠随机分为假手术组（sham）、缺血再灌注组（I/R）和大豆异黄酮预处理组（SI）。SI组给予SI 120 mg·kg-1·d-1连续灌胃21 d,其余2组用等体积生理盐水灌胃,每天1次,第22天I/R组和SI组行手术阻断三血管制备全脑缺血/再灌注模型。缺血1 h,再灌1 h后处死,取大脑皮层,光镜观察脑细胞形态学变化,透射电镜观察线粒体超微结构变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR法和免疫组织化学法测定脑组织中Cyt-C、caspase-9及caspase-3的表达。结果: I/R组线粒体膜崩解、嵴消失,脑细胞大量凋亡。与I/R组相比,大豆异黄酮预处理能明显改善线粒体超微结构的损伤,减少脑细胞凋亡率（P<0.01）。I/R组Cyt-C、caspase-9和caspase-3 mRNA的表达和蛋白的含量高于sham 组（P<0.01）,与I/R组相比,SI组Cyt-C、 caspase-9及caspase-3 mRNA 和蛋白的表达显著降低（P<0.01）。结论: 大豆异黄酮可能通过稳定线粒体结构,减少线粒体释放Cyt-C,降低caspase-9和caspase-3的表达,抑制细胞凋亡,从而减轻脑缺血/再灌注损伤。     

硫化氢对肠缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡的影响

 目的: 探讨硫化氢(H₂S)对大鼠缺血再灌注(I/R)损伤回肠上皮细胞线粒体形态和功能及凋亡的影响。方法: 24只雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组、I/R组和I/R+NaHS组。建立大鼠肠I/R损伤模型。在灌注前10 min时经I/R+NaHS组大鼠尾静脉注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg^-1·h^-1输注直到再灌注2 h,实验结束后取回肠标本测定回肠上皮细胞形态和呼吸功能指标。敏感硫电极法测定血浆H₂S含量。RT-PCR检测回肠组织Bcl-2和Bax mRNA表达,Western blot 检测总caspase-3、活化型caspase-3、细胞色素C(Cyt C)、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果: I/R组线粒体的面积、体积密度、最大直径、最小直径、等效直径以及活化型caspase-3、Cyt C和Bax表达均显著大于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。I/R组线粒体数量、周长、比表面、面积密度和粒子数密度、血浆H₂S、R₃、R₄、RCR、P/O和Bcl-2表达均显著小于I/R+NaHS和sham组(P<0.01)。结论: 硫化氢下调活化型caspase-3、Cyt C和Bax的蛋白水平,上调Bcl-2表达,对I/R损伤大鼠回肠上皮细胞线粒体形态和功能均有保护作用。     

小檗碱抑制脓毒症诱导的肠上皮细胞凋亡

目的:观察小檗碱对脓毒症小鼠肠上皮细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:8~10周雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组(sham组)、脓毒症模型组(CLP组)、小檗碱治疗组(CLP+Ber组)、小檗碱对照组(sham+Ber组)。CLP组行盲肠结扎穿孔术复制小鼠脓毒症模型,其余组除不结扎盲肠外,其它操作同CLP组。各组小鼠术后2 h内分别予双蒸水、小檗碱(50 mg/kg)灌胃。术后20 h,小鼠腹腔注射过量的戊巴比妥钠处以安乐死后开腹取回肠组织,HE染色观察各组小鼠肠组织形态学改变;Western blot法观察各组肠组织凋亡相关蛋白caspase-3降解片段、胞浆组织细胞色素C(Cyt C)、线粒体蛋白Bax及细胞总蛋白Bcl-2、Fas、Fas L、Fas相关死亡域结构蛋白(FADD)的含量变化;real-time PCR法检测各组肠组织酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺β-羟化酶(DBH)的mRNA表达水平。结果:小鼠CLP术后20 h,可见脓毒症模型组小鼠肠绒毛坏死并伴有大量炎症细胞浸润;模型组肠组织caspase-3降解片段显著增多,线粒体Bax、胞浆Cyt C及总蛋白Fas、Fas L含量显著增高,而总蛋白Bcl-2含量明显降低,FADD未见明显改变;脓毒症模型组肠组织TH、DBH的mRNA表达明显增高。术后给予小檗碱治疗后可显著减轻肠组织炎症,逆转caspase-3降解片段、Bax、Cyt C、Fas、Fas L、Bcl-2蛋白和TH、DBH mRNA的表达。结论:小檗碱可显著抑制脓毒症小鼠肠上皮细胞凋亡,其机制可能与抑制内、外源性凋亡途径有关。     

Long-term depression of the human masseter inhibitory reflex

Transient global ischemia reportedly results in glutamate receptor stimulation and harmful Ca(2+)-overloading, then activates some proteins involved in cell apoptosis in vivo and in vitro, but underlying mechanisms remain to be elucidated. Here we evaluated the role of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist and L-type voltage-gated Ca(2+) channel (L-VGCC) antagonist in mediating the release of cytochrome c and the expression of caspase-3 precursor protein (procaspase-3). Cytochrome c release from mitochondria is a critical step in the cell apoptotic process. We examined whether cytochrome c was translocated from mitochondria to the cytosol by Western blot in rat hippocampus after 15 min global ischemia. Released cytochrome c interacts with apoptotic protease activating factor-1 and caspase-9, both of which play important roles in the cytochrome c-dependent mitochondrial pathway of apoptosis by activating caspase-3. Our studies demonstrated that the inactive precursor and active cleaved subunits of caspase-3 protease increased dramatically with the extent of reperfusion time. Following pretreatment with ketamine (a non-competitive NMDA receptor antagonist) and nifedipine (L-VGCC antagonist), cytosolic cytochrome c and the expression of procaspase-3 dramatically decreased, which might result in less neuron damage after ischemia.     

高糖应激促脂肪变性肝细胞凋亡的线粒体机制

目的:探讨高糖应激对脂肪变性肝细胞凋亡的作用及其可能机制。方法:C57BL/6J小鼠饲喂高脂饲料6周后,采用肝脏原位灌注技术分离得到脂肪变性原代肝细胞,在含有35 mmol/L葡萄糖的高糖DMEM培养基中孵育12 h,以正常DMEM培养基(添加30 mmol/L甘露醇)孵育的细胞作为对照,观察高糖处理对脂肪变性肝细胞活力、线粒体膜电位、凋亡蛋白酶caspase活性及凋亡相关信号通路的影响。结果:高糖应激使脂肪变性肝细胞活力下降,凋亡显著增加,而等渗甘露醇处理的对照细胞没有明显变化。高糖组细胞出现较为严重的线粒体去极化,导致线粒体膜电位降低,细胞色素C释放增多。线粒体介导凋亡关键酶caspase-9和caspase-3活性在高糖组有显著升高,抑制凋亡因子Bcl-2和Bcl-x L表达量明显降低,促凋亡蛋白Bax水平显著升高,而感受外源性凋亡信号的caspase-8的活性没有明显变化。结论:高糖应激会导致脂肪变性肝细胞线粒体膜电位下降,启动线粒体介导的内源性凋亡途径,引起肝细胞凋亡。这可能是高血糖加速非酒精性脂肪性肝病病程进展的一个重要原因。