人重组粒细胞集落刺激因子突变体的构建、表达和其体内外生物学活性研究

目的为提高人重组粒细胞集落刺激因子（ｈｕｍａｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ｒｈＧ－ＣＳＦ）的稳定性和活性,对ｒｈＧ－ＣＳＦ进行改造和体内、外活性研究。方法利用定向点突变技术,将人重组粒细胞集落刺激因子第１７位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列,ＤＮＡ序列分析证明后,在大肠杆菌中表达突变蛋白。利用Ｇ－ＣＳＦ依赖细胞株ＮＦＳ－６０,对在不同温度及在人血浆中保存的Ｇ－ＣＳＦ蛋白（Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７）和野生型的Ｇ－ＣＳＦ进行活性测定。腹腔注射后小鼠外周血白细胞计数检测其体内生物学活性。结果ＤＮＡ序列分析表明１７位半胱氨酸突变为丙氨酸,并在大肠杆菌中表达成功Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７。纯化的突变蛋白对ＮＦＳ－６０细胞具有刺激活性;与野生型Ｇ－ＣＳＦ相比,在各种温度储存的突变蛋白保留更高的活性,与人血浆孵育５０小时后突变蛋白仍保持活性;小鼠一次性体内注射突变蛋白后外周血白细胞数明显高于野生型Ｇ－ＣＳＦ。结论Ｇ－ＣＳＦ突变体（Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７）较野生型的Ｇ－ＣＳＦ具有更高的体外稳定性和体内造血刺激活性。     

测定重组人粒细胞集落刺激因子生物学活性的MTT比色法

用粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）的依赖细胞株（ＮＦＳ－６０细胞株）为靶细胞，以ＭＴＴ比色法测定重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）的生物学活性，确定了在ＭＴＴ比色法中ＮＦＳ－６０细胞浓度为３×１０４／孔以及ｒｈＧ－ＣＳＦ浓度与ＮＦＳ－６０细胞有量效关系的范围为２ｎｇ／ｍｌ～７．８ｐｇ／ｍｌ，对几种溶解液进行了比较，选定１０％ＳＤＳ－０．０１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ作为ＭＴＴ结晶的溶解液，对ＭＴＴ比色法的特异性、精密度和方法回收率进行了研究。     

G-CSF、GM-CSF的临床应用现状

粒细胞集落刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ, Ｇ－ＣＳＦ）、粒巨噬细胞集落刺激因子（ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ,ＧＭ－ＣＳＦ）分别是促粒系、粒－单系造血祖细胞增殖、分化及成熟,并增强其成熟细胞功能的特异造血调控生长因子。重组ＤＮＡ技术的发展,使得利用基因工程方法大量生产细胞因子成为可能。目前,Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ基因重组产品已广泛应用于临床。在血液病的治疗,造血干细胞移植及恶…     

人G—CSF新型高效表达克隆的构建与鉴定

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，自人的脾脏单核细胞ｍＲＮＡ扩增出人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）结构基因，ＤＮＡ序列分析表明与天然ｈＧ－ＣＳＦ一致，将其克隆于表达载体ｐＪＧＷ１中，在大肠杆菌中进行诱导表达研究。结果表明：ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率在２５％以上，并具有与天然ｈＧ－ＣＳＦ一致的生物学活性。     

rhIL－6、rhGM－CSF和rhEPO对人骨髓造血干细胞的调节作用

重组人白细胞介素６（ｒｈＩＬ－６）和重组人粒—单细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）与正常人造血干细胞培养１周后，ｒｈＩＬ－６组干细胞数增至４．７±０．７倍；ｒｈＧＭ－ＣＳＦ组增至９．３±１．０倍；ｒｈＩＬ－６＋ＧＭ—ＣＳＦ组增至１３．４±３．３倍。与对照组比较，Ｐ均＜０．０１．造血干细胞ＣＦＵ－Ｅ集落分析：ｒｈＩＬ－６组未见ＣＦＵ－Ｅ集落形成；ｒｈＩＬ－６＋ＥＰＯ组则ＣＦＵ－Ｅ集落明显高于ｒｈＥＰＯ组，ｐ＜０．０１．造血干细胞ＣＦＵ－Ｍｉｘ集落分析：ｒｈＩＬ－６组和ｒｈＧＭ－ＣＳＦ组可见ＣＦＵ－ＧＭ浆落，无ＣＦＵ＋Ｍｉｘ集落形成；ｒｈＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ组有ＣＦＵ－Ｍｉｘ集落形成；ｒｂＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ＋ＥＰＯ联合应用，有ＣＦＵ－ｎ，ｍ，Ｍ，Ｅ混合集落数增多。实验结果提示ｒｈＩＬ－６对造血干细胞有直接的刺激作用，主要刺激粒—单系组细胞增殖。ｒｈＩＬ－６与ｒｈＥＰＯ有协同作用，能促进ｒｈＥＰＯ刺激红系祖细胞的作用。ｒｈＩＬ－６与ｒｈＧＭ－ＣＳＦ亦有协同作用，可以刺激多能干细胞形成混合集落。     

rhG-CSF导致乳腺癌患者化疗中CA-153升高

ＣＡ - 15 3是乳腺癌的一种特异肿瘤标志物 ,为临床诊疗工作提供宝贵的依据 ,但是我们在平时工作中也发现一些与临床不符的现象 ,特别是化疗中使用重组人粒细胞集落刺激因子注射液 (ｒｈＧ -ＣＳＦ :ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ -ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ)的患者 ,故据此作如下探讨。材料和方法一、对象 :(一 )Ｇ组为乳腺癌患者 6 0人 (Ⅱ期 31人 ,Ⅲ期 2 9人 ) ,平均年龄 5 2岁 (31～ 6 8岁 ) ,均为本院住院病人 ,皆经手术治疗 ,化疗中均采用ｒｈＧ -ＣＳＦ为辅助药物 ,使用方法为化疗…     

具有G—CSF抗原结合活性的三个重组噬菌体单链抗体基因？…

利用固相化Ｇ－ＣＳＦ亲和吸附法,从已构建的抗ｒｈＧ－ＣＳＦ全套单链抗体噬菌体表面展示文库中,筛选出含有特异抗体片段的噬菌体颗粒。结合直接感染法和酸性洗脱液洗脱法,进行４轮亲和富集筛选,并通过ＥＬＩＳＡ法结合双酶切鉴定,共筛选出９个具有Ｇ－ＣＳＦ结合活性的完整的重组噬菌粒克隆。对其中３个阳性克隆进行了ＳｃＦｖ基因全序列测定,获得６个抗体可变区基因的全序列。计算机分析表明,它们均为新发现的小鼠免疫球蛋     

国产重组人粒细胞集落刺激因子临床应用研究

利用基因技术生产的重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）能作用于中性粒细胞系，具有显著的刺激中性粒细胞生成，释放并增强成熟中性粒细胞的功能，且没有明显毒副作用．但其产品美国的生白能（ＧＭ－ＣＳＦ），价格昂贵，应用受到限制．在国内首家开发出中国 ｒｈＧ－ ＣＳＦ：“吉粒芬”得到卫生部批准试用．由于价格适中，临床已较普遍应用，现把我们近两年使用情况报告如下．１资料与方法１．１对象本组使用吉粒芬患者４２例次，均是本院的住院病人：男２６例次，女１６例次，年龄５～６５岁．其中急性白血病１２例次，慢粒１０…     

脐血清对培养人造血祖细胞集落生长的影响

目的：研究脐血清对培养人造血祖细胞集落生长的影响。方法：采用半固体细胞培养法。结果：在正常足月胎儿脐血清中有较高粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）和粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）活性，单用脐血清作刺激因子来源，在体外进行粒系造血祖细胞培养，可产生１４８１±８８７个粒系集落（ＣＦＵ－Ｇ），而植物血凝素刺激的单个核细胞条件培养液为５９０±２８８个ＣＦＵ－Ｇ，差别非常显著（Ｐ＜０００１）。脐血清组与３０ｎｇｒｈＧ－ＣＳＦ组所产生１５２０±３４５个ＣＦＵ－Ｇ相比，差别无显著（Ｐ＞００５）。并且我们还观察到脐血清组培养随时间延长有较多粒－巨噬细胞集落（ＣＦＵ－ＧＭ）生长，有些可出现混合爆式集落。结论：脐血清富含多种造血生长因子，并且Ｇ－ＣＳＦ水平较高     

一种N端缺失的rhGM-CSF(7～127)在大肠杆菌中的表达与调控

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端均缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明三种载体表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的水平分别为２１％，１８．８％和２５％。经过用ＰＣｇｅｎｅ软件和Ｚｕｌｃｅｒ算法分析ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）－３′ＵＴＲｍＲＮＡ的二级结构，表明３′ＵＴＲ在终止密码ＴＧＡ附近形成两个茎－环结构，它可能与ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ载体高表达ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）有关。表达产物ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）经弱阴离子ＤＥＡＥ交换层析纯化后，纯度达到９２％，比活性为８×１０７Ｕ／ｍｇ。     

家蚕表达的重组hM-CSF对化疗损伤小鼠造血功能的恢复

目的 研究重组人巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＭ－ＣＳＦ）和对化疗损伤小鼠骨髓造血功能恢复的作用。方法 用环磷酰胺１００ｍｇ／ｋｇ连续３天给予小鼠腹腔注射,造成化疗损伤模型。继以不同剂量（０．１￣２．０μｇ／天）的ｒｈＭ－ＣＳＦ连续７天给小鼠腹腔注射治疗。在化疗后第５,８,１１,１４天进行外周血白细胞总数及中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞计数;并在化疗后第７天进行骨髓ＣＦＵ－ＧＭ的集落培养。数据均采用＾     

抗rhG—CSF单克隆抗体的研制及初步鉴定

利用淋巴细胞杂交瘤技术，以ｒｈＧ－ＣＳＦ为免疫原，建立了６株稳定分泌抗Ｇ－ＣＳＦ单抗的杂交瘤细胞株，并研究了其分泌抗体的某些生物学特性。１材料与方法１．１抗原ｒｈＧ－ＣＳＦ，人用制剂，由北京医科大学免疫学系马大龙教授赠送。１．２细胞及动物Ｂａｌｂ／ｃ...     

直接从中国人胎肝染色体DNA中克隆粒细胞集落刺激因子（G－CSF）外显子及其在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，直接从正常人胎肝染色体ＤＮＡ库中分离克隆了中国人粒细胞集落刺激因子（ｃ－ＣＳＦ）外显子，全长５３７ｂｐ，它包括除信号肽氨基酸外的所有编码区，为了使克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子在大肠杆菌中高效表达，对其５’端进行了修饰，去除第１个编码Ｔｈｒ的密码子，在不改变氨基酸的前提下，变换为ＡＴ丰富的密码子；并将某些密码子换成大肠杆菌喜用的密码子。对于每段目的ＤＮＡ所进行的２次独立的ＰＣＲ反应所获得的产物分别进行了核苷酸序列测定。结果完全一致，证明所克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子的序列是可靠的，与国外发表的Ｇ－ＣＳＦ外显子序列相比，未发现变异。将上述人Ｇ－ＣＳＦ外显于基因插入ｐＢＶ２２０表达载休，构建了ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ质粒，将其转化入ＤＨ５ａ菌，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其表达量约占菌体总蛋白量的２０％，用依赖性细胞系ＮＦＳ－６０进行测定，活性为５ｘ１０ｖＩＵ／Ｌ。     

粒—巨噬细胞和粒细胞集落刺激因子作用的研究进展

粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）不仅具有刺激造血于细胞的作用，且可影响定向造血祖细胞的增殖和向成熟阶段分化，成熟细胞的功能激活和细胞的生存等功能。本文就ＧＭ－ＣＳＦ及Ｇ－ＣＳＦ的研究进展作一简要综述．     

rhGM—CSF／IL—3融合蛋白对人骨髓造血祖细胞体外培养的研究

研究了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白对人骨髓造血祖细胞（ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ、ＢＦＵ－Ｅ）集落形成的影响，结果表明ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３能显著促进ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ、ＢＦＵ－Ｅ集落的形成，分别与ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３单独或联合用药比较，差异有显著性（Ｐ〈０．００１），ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ＝ＧＥＭＭ、ＢＦＵ－Ｅ集落的形成对融合蛋白均有剂量依赖性，培养体系浓度在５￣１０ｎ     

血小板生成素的研究及临床应用

本世纪初化疗的应用，为恶性肿瘤的治疗增加了新的希望，但骨髓抑制是提高疗效的剂量限制性因素的关键问题。经几十年的探索，克隆技术的发展，先后发现了粒细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ， Ｇ－ＣＳＦ）及粒巨核细胞集落刺激因子（ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｆｌｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ， ＧＭ－ＣＳＦ），并应用于临床，取得了瞩目的成效，血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）的研究成功则晚…     

人参总皂甙对造血生长因子产生的影响

本文应用造血祖细胞体外培养术和白细胞介素（ＩＬ）生物活性检测术，观察经人参总皂甙（ＴＳＰＧ）刺激的小鼠脾细胞、腹腔巨噬细胞和成纤维细胞培养上清液的集落刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ－２和ＩＬ－６生物活性。结果表明：ＴＳＰＧ刺激组的ＣＳＦ和ＩＬ－６活性均显著高于对照组，ＴＳＰＧ刺激的脾细胞培养上清液的ＩＬ－２活性明显高于对照组，而ＴＳＰＧ刺激的巨噬细胞和成纤维细胞培养上清液的ＩＬ－２活性与对照组无显著性差     

人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定

目的 构建人胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）的真核细胞表达质粒。方法 用ＰＣＲ方法从人的肝细胞ｃＤＮＡ文库中克隆出ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ,然后定向插入真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３中,并用脂质体方法转染ＣＯＳ７细胞。用ＥＬＩＳＡ法和人胚肺纤维母细胞以及ＮＩＨ３Ｔ３纤维细胞增殖法分别测定转染细胞上清液中ＩＧＦ－１的含量和生物活性。结果 重组的真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１所含的ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ序列和插入方向均正确,其转染的ＣＯＳ７细胞分泌较高浓度的ＩＧＦ－１,并且具有明显促进纤维细胞增殖的能力。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１能够高效表达有活性的ＩＧＦ－１,对进一步研究ＩＧＦ－１体内表达的生理和病理作用有一定意义。     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表     

人参总皂甙对造血生长因子活性及其mRNA表达的影响

目的　探讨人参“补气生血”的现代生物学机理。　方法　采用核酸分子原位杂交和造血生长因子生物活性检测等技术,研究人参总皂甙（ＴＳＰＧ）对造血生长因子活性及其ｍ ＲＮＡ表达的影响。　结果　ＴＳＰＧ能显著促进小鼠骨髓基质细胞（ＢＭＳＣ）、腹腔巨噬细胞（ＰＭ）和脾细胞（ＳＰＣ）的粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）及白细胞介素－６（ＩＬ－６）ｍ ＲＮＡ的表达,经ＴＳＰＧ诱导制备的ＢＭＳＣ、ＰＭ和ＳＰＣ条件培养上清液含有较高的爆式红系集落刺激活性（ＢＰＡ）、粒－巨噬细胞集落刺激活性（ＧＭ－ＣＳＡ）和巨核细胞集落刺激活性（ＭＫ－ＣＳＡ）。　结论　ＴＳＰＧ促进血细胞生成的机理与其诱导造血生长因子的基因表达有密切关系。