子宫内膜黏液抗菌肽的分离纯化及鉴定

目的从人子宫内膜黏液酸溶性提取物纯化及鉴定抗菌多肽,探讨子宫内膜的抗菌机制。方法采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖弥散法分析人子宫内膜黏液酸溶性提取物的抗菌活性,切下相应的抗菌条带进行洗脱电泳,并用反相高效液相色谱进一步分离纯化。用琼脂糖弥散法检测纯化分子抗菌活性;Trieine-SDS-PAGE电泳检测其相对分子质量。根据N端氨基酸序列和质谱分析的测序结果推导纯化分子的氨基酸序列,并进行生物信息学分析。结果从人子宫内膜酸溶性提取物中纯化出一种相对分子质量为6777的抗菌肽HUP-39,经鉴定为人血红蛋白α链N端第33-95的氨基酸残基片段。该片段富含碱性氨基酸,包含3个完整的α螺旋跨膜结构域,对大肠埃希菌氨苄西林耐药株ML-35p、标准株ATCC25922和临床分离株54080有较强的抑菌活性。结论本研究从人子宫内膜黏液酸溶性提取物中分离纯化出的抗革兰阴性菌多肽,为人血红蛋白α链片段。子宫内膜黏液中的抗菌分子不仅来源于上皮细胞和白细胞,也可来源于红细胞。     

人子宫颈粘液抗菌多肽的分离

用５％乙酸提取人子宫颈粘液可溶物，经电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现，子宫颈粘液酸溶性提取物有两条主带对致病性大肠杆菌２５９２２株和金葡球菌２５９２３株有强抗菌活性，并分别命名为Ｈｃｐ－１和Ｈｃｐ－２。经Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，Ｈｃｐ－１分子量为６．７ｋｄ、１０ｋｄ和１５．４ｋｄ，Ｈｃｐ－２分子量为４．４ｋｄ、６．７ｋｄ、９ｋｄ和１５．４ｋｄ，均为多肽混合物。实验结果提示子宫颈粘膜能合成一类抗菌多肽，在子宫颈抗菌机理中发挥重要作用。     

兔膀胱粘膜抗菌蛋白研究

作者以1％乙酸冲洗雌性新西兰白兔膀胱粘膜获得其酸溶性提取物。经AU-PAGE分析表明,膀胱粘膜酸溶性提取物有十余条主蛋白带,不含已知的内源性抗菌多肽溶菌酶和防御素。琼脂糖弥散法杀菌试验显示,膀胱粘膜酸溶性提取物对致病性大肠杆菌ML-35P耐药株具杀菌活性。电泳凝胶琼脂糖弥散法杀菌试验进一步分析表明,杀菌活性与两条主蛋白带相关,命名为Rab BP-1和Rab BP-2。它们分别占膀胱粘膜提取物蛋白质总量的2.5％和1.2％。本实验的研究结果首次提示,兔膀胱粘膜存在抗菌性蛋白,这可能是膀胱粘膜杀菌这一重要防御机理的分子基础。     

大鼠子宫内膜抗菌成分的初步分析

作者以１％乙酸冲洗ＳＤ大鼠子宫内膜，获得子宫内膜酸溶性提取物，利用琼脂糖弥散法和电泳凝胶琼脂糠弥散法抗菌试验发现，子宫内膜提取物有三条主蛋白带对致病性大肠杆菌ＭＬ３５Ｐ耐药株有强抗菌活性。本实验的结果提示子宫内膜合成一类抗菌多肽，可能在子宫抗菌机制中发挥重要作用。     

人膀胱粘膜抗菌蛋白研究

作者以１％乙酸冲洗正常成年男性膀胱，获得其粘膜酸溶性提取物。ＡＵ－ＰＡＧＥ电泳分析表明，该酸溶性提取物有十余条主蛋白带，但未出现常见的内源性抗菌多肽溶菌酶及防御素条带。以敏感的溶菌酶定量法例得溶菌酶仅占酸溶性提取物蛋白质总量的０．２２％。采用琼脂糖弥散法杀菌试验发现该酸溶性提取物对致病性大肠杆菌ＭＬ－３５Ｐ耐药株具杀菌活性；进一步以电泳凝胶琼脂糖弥散法杀菌试验分析，结果显示该酸溶性提取物中有一条主蛋白带有较强的杀菌活性，称之为人膀胱抗菌蛋白（ＨＢＰ），它约占酸溶性提取物蛋白质总量的４％。本文结果提示，人膀胱粘膜存在有抗菌性蛋白，这可能是正常泌尿道抗细菌感染的分子基础。     

大鼠子宫内膜抗菌成分的初步分析

作者以１％乙酸冲洗ＳＤ大鼠子宫内膜，获得子宫内膜酸溶性提取物。利用琼脂糖弥散法和电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现，子宫内膜提取物有三条主蛋白带对致病性大肠杆菌ＭＬ－３５Ｐ耐药株有强抗菌活性，这三条抗菌蛋白带命名为ＲａｔＵＰ－１，ＲａｔＵＰ－２和ＲａｔＵＰ－３，分别占子宫内膜提取物总蛋白量的４．５％，５．７％和６．６％。虽然提取物存在溶菌的活性，但其含量甚微，在ＡＵ一ＰＡＧＥ图谱上亦未能显现溶菌酶条带。本实验的结果提示子宫内膜合成一类抗菌多肽，可能在子宫抗菌机制中发挥重要作用。     

人精浆小分子抗菌肽的分离鉴定

目的 从人精浆中分离小分子抗菌肽,探讨精浆的抗菌机制.方法 收集正常人精液,室温液化后10 000 r/min离心10 min去除精子得到精浆.采用琼脂糖弥散法检测抗菌活性,采用对大肠杆菌(ATCC25922)的抗菌活性作为检测指标,通过阳离子交换柱SP-Sepharose分离,将有抗菌活性的洗脱产物冻干后用去离子水溶解,经过AKTA Superdex 75柱分离,收集小分子部分,应用反相高效液相色谱技术分离纯化多肽(RP-HPLC分离),检测各峰抗菌活性,基质辅助激光解吸质谱法检测相对分子质量,并鉴定其抗菌活性.结果 从人精浆中初步分离出多个相对分子质量小于10×103的肽混合物, 其中部分与精液凝固蛋白Ⅰ片段相对分子质量大小一致,命名为HSLAMs(Human semen low-molecular-mass antibacterial mixtures),具有抗大肠杆菌的活性.结论 HSLAMs可能是人精浆天然免疫机制中重要的效应分子,精液凝固蛋白Ⅰ可能是其来源之一.     

人淋巴因子激活的杀伤细胞抗生素肽的分离纯化

目的　分离纯化人淋巴因子激活的杀伤细胞 (lym phokine activated killer,L AK)内源性抗生素肽。方法　采用密度梯度离心法分离人外周血单核细胞 ,并用 IL- 2和 PHA刺激培养。 5 %乙酸匀浆细胞获得其酸溶性提取物。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反相高效液相色谱技术分离纯化多肽 ,Tricine- SDS-PAGE鉴定其分子量 ,并运用琼脂糖弥散法鉴定其抗菌活性。结果　从人 L AK细胞酸溶性提取物中纯化出多个多肽 ,其中 HL P- 2 b、HL P- 3a完全纯化 ,分子量分别为 7.9× 10 3u和 4× 10 3u。HL P- 2 a、HL P- 2 c、HL P- 3b和 HL P- 3c基本纯化 ,主带分子量分别为 7.2× 10 3u、10 .4× 10 3u、6 .4× 10 3u、6 .4× 10 3u。 HL P- 3a具有抗金黄色葡萄球菌活性 ,HL P- 2 a、HL P- 2 b、HL P- 2 c、HL P- 3b、HL P- 3c具有抗金黄色葡萄球菌活性和抗白色念珠菌活性。结论　人 L AK细胞含多种内源性抗生素肽分子     

人大颗粒淋巴细胞抗生素肽的部分纯化

为探讨人大颗粒淋巴细胞抗菌分子的抗菌活性，采用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳对人大颗粒淋巴细胞胞浆颗粒酸溶性提取物的抗菌组分ＨＬＰ１、ＨＬＰ２、ＨＬＰ３进行分离纯化。结果：ＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳＰＡＧＥ分析显示，ＨＬＰ１、ＨＬＰ２均为多肽混合物，其分子量范围分别是５６～１３ｋｄ和５６～８８ｋｄ；ＨＬＰ３为一７ｋｄ的单一多肽。琼脂糖弥散法和电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验显示，ＨＬＰ１、ＨＬＰ２、ＨＬＰ３对致病性大肠杆菌ＭＬ３５Ｐ氨苄青霉素耐药株、金葡球菌ＡＴＣＣ２５９２３株、绿脓杆菌ＡＴＣＣ２７８５３株均有很强的杀菌作用。提示人大颗粒淋巴细胞存在的小分子抗菌多肽可能在人天然免疫的抗感染防御机制中发挥了重要作用     

人子宫颈黏液抗菌多肽的分离和鉴定

目的　从人的子宫颈黏液分离和鉴定新抗菌多肽,探讨子宫颈黏液抗菌机制。方法　用5%乙酸提取人子宫颈黏液可溶物,应用电泳凝胶抗菌蛋白分析法分析其抗菌蛋白,制备酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳及反相高效液相色谱分离纯化抗菌多肽。凝胶琼脂糖弥散法抗菌检测抗菌活性。纯化的抗菌多肽进行氮端氨基酸序列测定,根据其序列设计简并引物,利用简并聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA。通过BLAST硷基比对程序分析比较与已知蛋白的同源性。进一步应用常规基因重组技术构建其原核表达质和制备重组多肽。采用最小抑菌浓度和最小杀菌浓度检测重组多肽的抗菌效能。结果　从子宫颈黏液中分离纯化到一个具抗菌活性的多肽,通过蛋白测序、简并PCR及BLAST等方法鉴定该蛋白为HMGN2高游动性蛋白。制备获得重组HMGN2多肽,重组HMGN2抗大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度分别为10 .42μg/ml±3. 13μg/ml和27. 78μg/ml±8 .33μg/ml,与人中性粒细胞防御素相当;最小杀菌浓度分别为20 .83μg/ml±6 .25μg/ml和55 .56μg/ml±16 .67μg/ml。结论　除已知的抗菌肽外,HMGN2亦可能是宫颈黏液含有的抗感染效应分子之一。     

一种从人子宫颈粘液新分离的抗菌多肽的分子特性分析

目的对本室从人子宫颈粘液分离纯化的1个抗菌多肽HCP-1进行分子结构特性分析。方法分离HCP-1多肽,测定其氮端氨基酸序列,根据其氮端氨基酸序列密码子设计简并引物,采用3’-RACE-PCR技术扩增HCP-1编码基因,连接到T载体进行测序。用生物软件分析测序结果。结果以筒并引物结合RACE—PCR技术成功的克隆出HCP-1全长cDNA,BLAST分析证实其序列与HMG-17分子相同,OMIGA软件分析发现其含有一个α-螺旋结构(疏水结构区)可能是其抗菌功能的基础。结论HCP-1为HMG-17,是存在于宫颈粘液抗菌的一种抗菌多肽,其中的α-螺旋结构可能是其抗菌的结构基础。     

人子宫颈粘液抗菌多肽的分离

The acid-soluble extract of human cervical mucus was obtained by solving mucus with 5% acetic acid in the presence of protease inhibitor. The antibacterial activity of the acid-soluble extract was analyzed by gel overlay technique. The result showed that two protein bands which were designated human cervical protein-1 (Hcp-1), human cervical protein-2(Hcp-2) were potently antibacterial against E. coli 25922 and S. aureus 25923. Tricine-SDS-PAGE analysis indicated that Hcp-1, Hcp-2 actually contained three and four protein bands respectively. The molecular weights of Hcp-1 were 6.7 kd, 10 kd, 15.4 kd; these of Hcp-2 were 4.4 kd, 6.7 kd, 9 kd, 15.4 kd. Our studies suggested that human cervical mucosa might secrete some currently-unknown antibacterial polypeptides which play an important role in the cervical defense against infection.     

GST-颗粒溶解素融合蛋白的纯化及其抗菌活性分析

目的: 纯化大肠埃希菌表达的GST-颗粒溶解素融合蛋白,并分析其体外抗菌活性。方法: 将IPTG诱导处理后的细菌破碎,分离含有可溶性GST-颗粒溶解素融合蛋白的细菌裂解液,并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化。同时采用MTT法分析该纯化蛋白的抗菌活性。结果: GST-颗粒溶解素融合蛋白能以可溶性形式在大肠埃希菌中表达,采用亲和层析法可获得分子量为44kDa的单一蛋白条带。经抗菌活性分析,表明纯化产物对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌具有显著抑制作用,而对伤寒沙门菌和大肠埃希菌BL21的抗菌活性不明显。结论: 成功纯化GST-颗粒溶解素融合蛋白,该蛋白对革兰阳性菌具有高效抗菌活性。     

人抗菌肽FALL-39基因定点突变体的构建及其大肠杆菌表达产物的抗菌活性研究

目的：构建人抗菌肽FALL-39定点突变子及研究其抗菌活性。方法：采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM)，设计两对引物，引入一个突变点，通过重叠延伸法两次PCR扩增，使FALL-39第32位密码子由AAT突变为AAG，将扩增片段克隆入PGEXλ1T质粒中，转化大肠杆菌JM109，并用IPTG诱导，表达的FALL-39-lys32经纯化后与FALL-39进行抗菌活性比较。结果：DNA测序结果表明在预期位点发生突变，突变后的FALL-39-lys32蛋白对大肠杆菌ML-35p的抗菌活性明显增强，其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别由FALL-39蛋白的18．75和37．50μg／ml降低为FALL-39-Lys-32的10．94和21．88μg／ml，对绿脓杆菌ATCC27853的MIC和MBC值分别为FALL-39蛋白的31．25和37．50μg／ml降低为FALL-39-Lys-32的18．75和31．25μg／ml。两种蛋白均在含Medium E的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39-Lys-32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。结论：用两步PCR定点突变技术获得一个FALL-39-Lys-32突变子，其表达分子的抗菌活性明显增强，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。     

人大颗粒淋巴细胞抗生素肽的部分纯化

为探讨人大颗粒淋巴细胞抗菌分子的抗菌活性，采用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳对人大颗粒淋巴细胞浆颗粒酸溶性提取物的抗菌组分ＨＬＰ－１，ＨＬＰ－２，ＨＬＰ－３进行分离纯化。结果：Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，ＨＬＰ－２，ＨＬＰ－２均多肽混合物，其分子量范围分别是５．６－１３ｋｄ和５．６－８．８ＫＤ；ｈｌｐ－３Ｏ －７ｋｄ的单一多肽。