骨组织工程中细胞因子基因修饰种子细胞来源研究:转染后骨形态发生蛋白-3成纤维细胞株的稳定表达

背景骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是诱导和促进种子细胞向骨细胞方向转化的最重要的细胞因子之一.天然BMP难溶解于培养基,对培养的种子细胞无法有效发挥作用;可溶性重组BMP虽可溶解于培养基,但价格昂贵,而且难于适时、适量的作用于种子细胞.基因治疗为上述问题的解决提供了新的思路.目的转染外源BMP-3基因入成纤维细胞,筛选获得稳定表达BMP-3的阳性成纤维细胞克隆.设计单一样本研究.单位解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所.材料成纤维细胞(NIH3T3细胞)由第四军医大学口腔医学院司徒镇强教授提供.方法2000-04/2003-11在全军重点实验室第四军医大学全军骨科研究所实验室完成.采用脂质体转染的方法将外源BMP-3基因转染入NIH3T3细胞,G418筛选后寻找细胞集落,分离、培养,免疫组织化学鉴定,BMP-3染色阳性者为阳性BMP-3表达细胞克隆.主要观察指标①NIH3T3细胞筛选浓度.②转染阳性细胞克隆的筛选.③筛选的细胞克隆内BMP-3的表达.结果成功将BMP-3基因转染入NIH3T3细胞,经免疫组化筛选出阳性BMP-3表达成纤维细胞的克隆,建立了BMP-3稳定表达成纤维细胞株.结论将BMP-3基因真核表达载体转染入成纤维细胞,并经筛选获得了可稳定表达BMP-3的成纤维细胞株,为将来骨组织工程研究中使用细胞因子基因修饰的种子细胞的研究奠定了一定基础.     

强力霉素调控小NEIA激活基因阻遏子表达NIH3T3细胞系的建立

背景：前期研究发现，E1A激活基因阻遏子蛋白调控人血管平滑肌细胞的增殖及表型转化，但其表达调控细胞增殖、分化、凋亡的量效关系有待深入探讨。目的：建立强力霉素调控小鼠E1A激活基因阻遏子表达的NIH3T3细胞系，拟为定量观察E1A激活基因阻遏子的生物学功能提供研究基础。设计、时间及地点：对比观察实验，于2006—05／2008—03在沈阳军区总医院全军心血管病研究所实验室完成。材料：强力霉素调控基因表达系统，3T3细胞系。方法：通过反转录一聚合酶链反应方法获得小鼠E1A激活基因阻遏子（mCREG）cDNA序列；将mCREGcDNA序列亚克隆入pRey—TRE载体中，构建强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达pRev—TRE—mCREG载体；分别经G418（新霉素）及潮霉素筛选表达pRev-Tet—On、pRev—TRE—mCREG的NIH3T3细胞克隆；反转录聚合酶链反应鉴定转染细胞克隆中抗性基因和插入基因的表达。主要观察指标：Western blotting检测不同浓度的强力霉素诱导后NIH3T3细胞中mCREG的表达。结果：成功构建了强力霉素可调控表达的pRev—TRE—mCREG重组载体；筛选出稳定表达双抗性基因的NIH3T3，mCREG细胞克隆；反转录-聚合酶链反应检测证实细胞克隆中G418及插入基因表达均为阳性；Western blotting检测发现随强力霉素诱导剂量的增加（O，O．01，0．1，1mg／L），NIH3T3．mCREG细胞中mCREG表达呈剂量依赖性增加。结论：成功建立强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达的小鼠NIH3T3细胞系。     

核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化

目的：观察细胞因子诱导成骨的共同信号分产核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞，其成骨表型转变的可能性。方法：实验于2003-10／2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成。采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞，成骨标志基因Ⅰ型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1 mRNA的表达采用反转录．聚合酶链反应检测，骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测，Cbfa蛋白的表达采用Western blot检测。结果：①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达，Ⅰ型胶原表达增强，说明在转录水平有成骨标志基因的表达。②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达，显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞。③Western blot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达，证实了成纤维细胞发生了表型的改变。结论：核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化，增加了成骨细胞数量，使成骨能力增强成为可能。     

具G418抗性NIH3T3细胞饲养层的制备

背景：建立具有抗药（新霉素或潮霉素）性的饲养层细胞是转染外源目的基因胚胎干细胞阳性克隆的筛选必备条件。建成的具有抗药性的NIH3T3细胞系可用于胚胎干细胞其他目的基因的筛选。 目的：建立具有G418抗性的NIH3T3细胞系，用于转染pTet—on基因的胚胎干细胞阳性细胞克隆筛选的饲养层。 设计：细胞培养观察及DNA检测。 单位：中国医科大学实验动物部。 材料：NIH3T3细胞由中国医科大学细胞生物教研室惠赠，pWL／neo质粒为美国哈佛大学医学院金壮教授惠赠。G418、白血病抑制因子（胚胎干细胞GRO 106U／mL）、DMEM为GIBCOBRL产品，丝裂霉素-C、DIG标记及检测试剂盒为Roche产品，脂质体为Invitrogen产品，均购自沈阳联星生物技术有限公司。 方法：①通过脂质体转染的方法，将含有neo基因的质粒pWL／neo导入NIH3T3细胞中。②将细胞传至25mL培养瓶中，加入梯度浓度的G418继续培养，通过观察细胞生长及死亡情况测定G418对NIH3T3细胞最小致死量。③将转染的细胞进行传代，挑取单个细胞的克隆至24孔培养板继续进行筛选扩增，选用正常的NIH3T3细胞加入相同剂量的G418的选择性培养基作为筛选的阴性对照。④采用较低的细胞密度铺板，加入含最小致死量G418的DMEM培养基进行再次筛选；同时选用正常的NIH3T3细胞为对照，使用含有最小致死量G418及未加G418的DMEM培养基进行培养，采用光学显微镜对G418抗性NIH3T3细胞进行观察。⑤选用具有G418抗性的NIH3T3细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分别作为饲养层细胞进行传代，采用光学显微镜对培养后胚胎干细胞-D3细胞进行观察，并制备细胞DNA，对其进行PCR和southern blot鉴定。 主要观察指标：①G418对NIH3T3细胞最小致死量的测定结果。②G418抗性NIH3T3细胞的筛选结果。③G418抗性NIH3T3细胞的生长观察结果。④胚胎干细胞-D3细胞生长观察结果及G418抗性NIH3T3细胞的鉴定。 结果：①G418对NIH3T3细胞最小致死量为500mg／L。②经过500mg/L G418压力筛选后，获得了抗G418细胞克隆。③抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异。④饲养层培养的胚胎干细胞呈集落形状生长，边缘光滑，保持未分化的状态。用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA，可以扩增出对应的核苷酸片段，Southern blot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗性NIH3T3细胞中。 结论：成功地培育了G418抗性NIH3T3细胞，生长在G418抗性NIH3T3细胞饲养层上胚胎干细胞细胞基本保持正常胚胎干细胞细胞特征：     

核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞成骨表型转化

目的:观察细胞因子诱导成骨的共同信号分子核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,其成骨表型转变的可能性。方法:实验于2003-10/2004-10在解放军第三军医大学新桥医院骨科中心实验室完成。采用脂质体转染技术行核心结合因子α1基因转染NIH3T3成纤维细胞,成骨标志基因I型胶原、骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶、核心结合因子α1mRNA的表达采用反转录-聚合酶链反应检测,骨钙素的表达采用免疫细胞化学染色检测,Cbfa蛋白的表达采用Westernblot检测。结果:①NIH3T3成纤维细胞经核心结合因子α1基因转染后出现骨钙素、骨唾液蛋白、碱性磷酸酶的表达,I型胶原表达增强,说明在转录水平有成骨标志基因的表达。②免疫细胞化学染色检测到了骨钙素的表达,显示NIH3T3细胞已发展为成骨细胞。③Westernblot检测到了核心结合因子α1蛋白的表达,证实了成纤维细胞发生了表型的改变。结论:核心结合因子α1基因转移NIH3T3成纤维细胞改变了成纤维细胞向成骨表型转化,增加了成骨细胞数量,使成骨能力增强成为可能。     

强力霉素调控小鼠E1A激活基因阻遏子表达NIH3T3细胞系的建立

背景:前期研究发现,E1A激活基因阻遏子蛋白调控人血管平滑肌细胞的增殖及表型转化,但其表达调控细胞增殖、分化、凋亡的量效关系有待深入探讨。目的:建立强力霉素调控小鼠E1A激活基因阻遏子表达的NIH3T3细胞系,拟为定量观察E1A激活基因阻遏子的生物学功能提供研究基础。设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-05/2008-03在沈阳军区总医院全军心血管病研究所实验室完成。材料:强力霉素调控基因表达系统,3T3细胞系。方法:通过反转录-聚合酶链反应方法获得小鼠E1A激活基因阻遏子(mCREG)cDNA序列;将mCREGcDNA序列亚克隆入pRev-TRE载体中,构建强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达pRev-TRE-mCREG载体;分别经G418(新霉素)及潮霉素筛选表达pRev-Tet-On、pRev-TRE-mCREG的NIH3T3细胞克隆;反转录-聚合酶链反应鉴定转染细胞克隆中抗性基因和插入基因的表达。主要观察指标:Westernblotting检测不同浓度的强力霉素诱导后NIH3T3细胞中mCREG的表达。结果:成功构建了强力霉素可调控表达的pRev-TRE-mCREG重组载体;筛选出稳定表达双抗性基因的NIH3T3-mCREG细胞克隆;反转录-聚合酶链反应检测证实细胞克隆中G418及插入基因表达均为阳性;Western blotting检测发现随强力霉素诱导剂量的增加(0,0.01,0.1,1mg/L),NIH3T3-mCREG细胞中mCREG表达呈剂量依赖性增加。结论:成功建立强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达的小鼠NIH3T3细胞系。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的：用基因工程方法改造成纤维细胞，使其分泌血管内皮细胞生长因子，观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。 方法：实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后，将培养14d细胞融合约80％的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染，细胞随机分为3组，每组10孔，分别为PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组．空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的敏感性。 结果：①PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示：小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物，对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果：小鼠NIH3T3细胞转染14d后，PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346&;#177;23，0，0ng／L（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测结果：PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性（依次为0．96&;#177;0.11，0．91&;#177;0．10，0．98&;#177;0．16，P〉0．05）。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。 结论：小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞，用于基因治疗。     

具G418抗性NIH3T3细胞饲养层的制备

背景:建立具有抗药(新霉素或潮霉素)性的饲养层细胞是转染外源目的基因胚胎干细胞阳性克隆的筛选必备条件。建成的具有抗药性的NIH3T3细胞系可用于胚胎干细胞其他目的基因的筛选。目的:建立具有G418抗性的NIH3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的胚胎干细胞阳性细胞克隆筛选的饲养层。设计:细胞培养观察及DNA检测。单位:中国医科大学实验动物部。材料:NIH3T3细胞由中国医科大学细胞生物教研室惠赠,pWL/neo质粒为美国哈佛大学医学院金壮教授惠赠。G418、白血病抑制因子(胚胎干细胞GRO106U/mL)、DMEM为GIBCOBRL产品,丝裂霉素-C、DIG标记及检测试剂盒为Roche产品,脂质体为Invitrogen产品,均购自沈阳联星生物技术有限公司。方法:①通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入NIH3T3细胞中。②将细胞传至25mL培养瓶中,加入梯度浓度的G418继续培养,通过观察细胞生长及死亡情况测定G418对NIH3T3细胞最小致死量。③将转染的细胞进行传代,挑取单个细胞的克隆至24孔培养板继续进行筛选扩增,选用正常的NIH3T3细胞加入相同剂量的G418的选择性培养基作为筛选的阴性对照。④采用较低的细胞密度铺板,加入含最小致死量G418的DMEM培养基进行再次筛选;同时选用正常的NIH3T3细胞为对照,使用含有最小致死量G418及未加G418的DMEM培养基进行培养,采用光学显微镜对G418抗性NIH3T3细胞进行观察。⑤选用具有G418抗性的NIH3T3细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分别作为饲养层细胞进行传代,采用光学显微镜对培养后胚胎干细胞-D3细胞进行观察,并制备细胞DNA,对其进行PCR和southernblot鉴定。主要观察指标:①G418对NIH3T3细胞最小致死量的测定结果。②G418抗性NIH3T3细胞的筛选结果。③G418抗性NIH3T3细胞的生长观察结果。④胚胎干细胞-D3细胞生长观察结果及G418抗性NIH3T3细胞的鉴定。结果:①G418对NIH3T3细胞最小致死量为500mg/L。②经过500mg/LG418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆。③抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异。④饲养层培养的胚胎干细胞呈集落形状生长,边缘光滑,保持未分化的状态。用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗性NIH3T3细胞中。结论:成功地培育了G418抗性NIH3T3细胞,生长在G418抗性NIH3T3细胞饲养层上胚胎干细胞细胞基本保持正常胚胎干细胞细胞特征。     

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力，利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK）基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN，采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞，G418筛选出抗性克隆，收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞，在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明；重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后，含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论：逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞，可作为介导T细胞基因转移的重要工具。     

无瘢痕愈合中核糖体蛋白s29基因表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用

目的：探讨核糖体蛋白s29基因(RPs29 gene)表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用。方法：采用抑制性消减杂交(suppression subtraetive hybridization，SSH)方法筛选并克隆鼠胚皮肤特异表达的RPs29基因cDNA片段。应用PCR技术扩增RPs29基因ORF全长，构建真核重组表达载体pcDNA3．1／RPs29，体外转染成鼠皮肤成纤维细胞，观察细胞形态结构改变，免疫组织化学方法、RT-PCR分析外源基因表达情况。结果：RPs29基因在成纤维细胞中表达，细胞增生能力降低，凋亡加剧。结论：核糖体蛋白s29基因表达产物能抑制成纤维细胞增生，促进细胞凋亡，为无瘢痕愈合的研究提供实验材料及实验依据。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的：观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导人正常真皮成纤维细胞后，能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子，为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。 方法：实验于2001—06／2005—06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3．0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3．0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3．0-hVEGF165质粒大量制备（碱裂解法）-质粒纯化-质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EeoRⅠ和xbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只，无菌条件下取新生兔皮肤，尽量去除皮下组织，切成宽0．3cm小条块，Ⅰ型胶原酶消化，进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞，经G418筛选，获得阳性转染细胞克隆，并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平；原位杂交显示转基因细胞内VEGF165 mRNA的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。 结果：①质粒酶切鉴定结果：提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5．4kb和0．57kb两个片段，与原质粒图谱符合，表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3．0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况：共进行15次转染试验，35孔（皿）均有G418抗性集落形成，表明pcDNA3．0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达：pcDNA3．0-hVEGF165转染成纤维细胞后，24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋、白表达，高达（3280&;#177;2054）ng／L，并于48，72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果：转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGF mRNA。G418应用2-4周后，可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆，筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEG FmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测：转染后成纤维细胞S期细胞比例增加，G1和G2期细胞减少，表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高。转染前为1．26％，转染后2d为2．64％，至12代时高达17135％。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察：细胞表面有较多微绒毛，核呈不规则形，胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体，沿膜可见一些膜包被颗粒。 结论：真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165成功导人家兔皮肤成纤维细胞，在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子，在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景：将生物材料复合细胞因子基因，或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复。目的：观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性。设计：对照观察实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。对象：新生SD大鼠5只，雌雄不限。方法：实验于2000—02／09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导人大鼠成骨细胞，并以质粒pcDNA，转染细胞作为对照。转染24h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况。采用G418筛选转染细胞2周，获得阳性细胞克隆，用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况。主要观察指标：链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况。结果：①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果：24h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒，对照组空载体转染细胞腧浆中刚没有棕黄倘．颗粒．说明转基因细胞中转化毕长因子β1 mRNA明显增高。②G418筛选转基因细胞组化检测：G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β表达。结论：利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子，转染后瞬时和筛选2周后，均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达，说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的:用基因工程方法改造成纤维细胞,使其分泌血管内皮细胞生长因子,观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。方法:实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后,将培养14d细胞融合约80%的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染,细胞随机分为3组,每组10孔,分别为PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染的敏感性。结果:①PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示:小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物,对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果:小鼠NIH3T3细胞转染14d后,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346±23,0,0ng/L(P<0.05)。④四甲基偶氮唑盐法检测结果:PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性(依次为0.96±0.11,0.91±0.10,0.98±0.16,P>0.05)。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。结论:小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞,用于基因治疗。     

pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞的体外表达及体内成骨能力

背景：能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用？目的：观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达，同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织，利用X线观察其成骨情况。设计、时间及地点：观察对比实验。实验于2004—11／2005-04在辽宁医学院骨科研究室完成。材料：6只成年新西兰大白兔，雌雄不拘，体质量2．0～3．0kg。BMP2抗体为美国Sanaka公司产品，pcDNA3-hBMP2由解放军第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供，限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。方法：从大肠杆菌提取超纯质粒pcDNA3-hBMP2，从成年兔股骨抽取骨髓，密度梯度分离法分离培养骨髓基质干细胞，将细胞分成4组；A组：pcDNA3-hBMP2转染进行G418筛选；B组：pcDNA3-hBMP2转染未用G418筛选；C组：给予pcDNA3空载体转染；D组：仅加入脂质体转染试剂Fugene 6。主要观察指标：①应用免疫组织化学法检测转染后瞬时表达。②应用免疫组织化学法检测细胞骨钙素表达，分别应用原位杂交法检测细胞Ⅰ型胶原表达。③转染2周后将B组细胞自体回植入兔后腿肌组织中，移植4周后应用X射线观察成骨情况。结果：①pcDNA3-hBMP2成功转染入骨髓基质干细胞内并100％瞬间表达BMP2。②基因转染4周后，A组细胞骨钙素及Ⅰ型胶原表达高于C组及D组。③B组细胞回植肌组织4周后，X射线可显示新骨形成。结论：pcDNA3-hBMP2能安全有效转染兔骨髓基质干细胞，通过其分泌物BMP2来作用诱导细胞加速分化为成骨细胞。     

小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建

背景：血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化及支架内再狭窄发生的重要机制，小鼠E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulatedgenes，CREG）可以抑制血管平滑肌的增殖，成为心血管领域新的治疗靶点。目的：构建小鼠CREG小分子RNA干扰真核表达载体，下调小鼠细胞中cREG基因的表达。设计、时间及地点：观察性实验，于2007-04／10在解放军沈阳军区总医院心血管研究所完成。材料：小鼠成纤维母细胞系（NIH3T3）由美国新泽西州Robert Wood Johnson医学院病理实验科李少华教授馈赠。方法：应用RNA干扰在线设计工具设计4对可与小鼠CREG基因cDNA结合的短发夹RNA。通过化学合成法合成并克隆至pEN_mHlc载体中，与目的载体pDS_hpEY进行LR重组得到4种表达不同shCREG片段的表达载体pDS_shCREGs。应用Lipofectamine^TM 2000将pDS_shCREGs转染至小鼠NIH3T3细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。主要观察指标：应用反转录聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分别检测cREG的沉默效率。结果：经酶切和DNA测序证实，4种重组pDS_shCREG载体中插入片段的序列正确。反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹证实，4种稳定转染细胞中的CREG表达水平均有不同程度的下降，稳定转染pDS-shCREGl的细胞克隆中CREG基因mRNA和蛋白表达分别降低了87％和70％。结论：成功构建小鼠CREG基因真核干扰表达载体，使体外培养NIH3T3细胞中CREG蛋白表达明显降低。     

可溶性肿瘤坏死因子受体对炎性牙周膜细胞的作用

目的：分析可溶性肿瘤坏死因子受体及T淋巴细胞对炎性牙周膜细胞的作用。 方法：实验于2005-03／09在解放军第四军医大学口腔医学院口内实验室完成。免疫磁珠分离CD3^＋T淋巴细胞于解放军第四军医大学唐都医院骨科实验室完成。CD3^＋T淋巴细胞取自正常人的外周血，牙周膜成纤维细胞和淋巴细胞培养液均购自美国Gbieo公司。大肠杆菌内毒素购自Sigma公司，质粒引物合成及目的基因检测均于Takara公司完成。正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T淋巴细胞共培养，加入大肠杆菌内毒素，实验组用PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养，对照组用转染空质粒的细胞培养液培养。空白组为正常牙周膜成纤维细胞加CD3^＋T淋巴细胞、正常牙周膜成纤维细胞加内毒素、正常牙周膜成纤维细胞。噻唑蓝法检测各组细胞24h和48h的活力变化；PeDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞后，免疫组化染色强阳性表达，转染培养液培养实验组细胞24h和48h后，噻唑蓝法检测实验组牙周膜细胞的活力变化。 结果：①正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T淋巴细胞共培养，内毒素刺激正常牙周膜成纤维细胞后，细胞活性降低；培养24h和48h后。噻唑蓝法检测各组的A值：正常牙周膜成纤维细胞和CD3^＋T淋巴细胞共培养组，加入内毒素刺激，24h为4．6&;#177;0．2，48h为3．7&;#177;0．1；用PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养，24h为7．8&;#177;0．3，48h为6．9&;#177;0．5；正常牙周膜成纤维细胞用内毒素刺激，24h为9．0&;#177;0．4；48h为8．7&;#177;0．3；单纯正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T细胞共培养，24h为10．1&;#177;0．2，48h为9．8&;#177;0．5；单纯培养牙周膜成纤维细胞，24h为10．0&;#177;0．5，48h为9．2&;#177;0．1。②转染空质粒PcDNA3．1（&;#177;）的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达不明显，而转染质粒PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达增强。 结论：内毒素与T淋巴细胞刺激正常牙周膜成纤维细胞可以引起肿瘤坏死因子α水平升高；可溶性肿瘤坏死因子受体对于炎症牙周膜成纤维细胞有抑制肿瘤坏死因子α作用的功能。     

P27基因转染对瘢痕成纤维细胞超微结构的影响

目的：观察P27基因转染对体外培养增生性瘢痕成纤维细胞超微结梅的影响，探讨P27基因抑制瘢痕的作用。 方法：实验于2001-06／2002-01在第四军医大学烧伤科实验室、第四军医大学电镜中心完成。pcDNA—p273真核表达质粒由第一作者构建，应用基因转染技术将所构建的pcDNA3-p27载体转染成纤维细胞，培养的增生性瘢痕成纤维细胞分为空白对照组（即未经转染的增生性瘢痕成纤维细胞）、转pcDNA3空载体组、转pcDNA3-P27组。获得稳定的P27表达后，用透射电镜观察成纤维细胞内细胞器形态和数量的变化。 结果：①空白对照组成纤维细胞核大而呈圆形，核仁明显，胞浆内具有较丰富的粗面内质网，较发达的高尔基复合体，较多的线粒体、微丝、微管，细胞表面微绒毛及突起较多。②转pcDNA3空载体组粗面内质网、线粒体较丰富。⑨转pcDNA3-P27组细胞胞浆内粗面内质网、线粒体、微丝、微管明显减少，大部分细胞出现染色体边聚，粗面内质网上的核糖体明显减少，部分细胞呈现凋亡，大部分细胞呈典型的生长抑制像。④P27明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的合成功能。 结论：P27可能通过抑制成纤维细胞的细胞合成、增殖功能来抑制瘢痕形成。     

小鼠Wnt-3a基因真核表达载体的构建及其在cos-7细胞中的表达

目的：克隆小鼠胚脑中Wnt-3a基因片段，构建pSecTag2／Hygrn B—Wnt3a真核表达载体，观察其在cos-7细胞中的表达，为基因治疗脊髓损伤提供实验依据。方法：实验于2004-09／2005-03在安徽医科大学分子生物学实验室完成。选取清洁级孕13．5d的KM小鼠1只，脱颈处死，冰冷条件下迅速取出胚鼠，解剖显微镜下剥离胚脑，在无RNA酶污染的条件下迅速提取胚脑总RNA。利用反转录聚合酶链方法扩增小鼠胚脑Wnt-3a基因片段，将该基因片段克隆入T载体，聚合酶链反应法筛选并测序，双酶切后构建重组真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a。转染并筛选稳定表达的COS-7细胞，Western blot鉴定重组Wnt-3a蛋白的表达。结果：①反转录聚合酶链反应获得目的基因小鼠Wnt-3a cDNA：自胚鼠脑组织总RNA经反转录聚合酶链反应扩增后，凝胶电泳可见约1．1kh的特异性扩增片段，与预期获得产物大小相符。②pMD18-T／Wnt3a克隆质粒聚合酶链反应初步筛选与测序：测序报告所克隆的Wnt-3a为1058bp．通过Blast同源性分析，与GeneBank收录的序列一致，克隆小鼠Wnt-3a基因获得成功。③真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a的双酶切及测序：随机挑选10个克隆，聚合酶链反应扩增筛选出阳性克隆5个。经XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。④Western Blot鉴定重组小鼠Wnt-3a蛋白在cos-7细胞中的表达：脂质体转染cos-7后48h，Western Blot鉴定出在细胞内存在Wnt-3a蛋白的表达，转染pSecTag2／Hygro B—Wnt3a的COS-7细胞裂解液在45KD处出现阳性条带，而培养上清中未能检测到蛋白的表达。结论：小鼠胚脑Wnt-3a基因的真核表达载体pSecTag2／Hygro B—Wnt3a构建成功，转染COS-7细胞后能够表达重组Wnt-3a蛋白。     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

无瘢痕愈合中核糖体蛋白s29基因表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用

目的探讨核糖体蛋白s29基因(RPs29gene)表达产物对皮肤成纤维细胞增生的作用。方法采用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)方法筛选并克隆鼠胚皮肤特异表达的RPs29基因cDNA片段。应用PCR技术扩增RPs29基因ORF全长,构建真核重组表达载体pcDNA3.1/RPs29,体外转染成鼠皮肤成纤维细胞,观察细胞形态结构改变,免疫组织化学方法、RT-PCR分析外源基因表达情况。结果RPs29基因在成纤维细胞中表达,细胞增生能力降低,凋亡加剧。结论核糖体蛋白s29基因表达产物能抑制成纤维细胞增生,促进细胞凋亡,为无瘢痕愈合的研究提供实验材料及实验依据。