应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1结合的肝细胞蛋白编码基因

目的:构建乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1(XBP1)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与XBP1相互作用的基因。方法:通过PCR扩增获得XBP1基因,构建真核表达载体pGBKT7-XBP1,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-XBP1共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果:筛选出20种与XBP1相互作用的蛋白,其中包括金属硫蛋白,平滑肌细胞相关蛋白,去唾液酸糖蛋白受体,丙酮酸脱氢酶激酶1,甜菜碱甲基转移酶,视黄醇结合蛋白,补体因子B、人补体C9,转化生长因子β1,丝氨酸蛋白酶抑制剂;cAMP应答元件结合蛋白,拓扑异构酶IIβ等已知功能基因及1个未知功能序列。结论:筛选到多种XBP1相互作用的基因,包括与细胞内结构、细胞生长相关蛋白基因,参与细胞内代谢的蛋白基因,参与信号转导途径、免疫及其他相关蛋白基因,参与DNA的复制、转录、重组、修复的基因。     

用聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

我们采用聚合酶链反应(ＰＣＲ)技术检测乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒(ＨＢＶ)ＤＮＡ,并用酶标法检测ＨＢＶＭ,从乙型肝炎临床分型和实验室ＨＢＶＭ分组两个角度时行回顾性比较与分析。1　材料和方法1.1　病例选择　168例乙型肝炎病例均来自嘉兴市第二医院和协作单位住院病人,全部检测过ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢＶＭ,男106例,女62例;年龄4～71岁,平均35.4岁。其中急性乙型肝炎26例,慢性乙型肝炎72例,重型肝炎9例,淤胆型肝炎24例,肝炎后肝硬化37例。诊断标准依据1995年北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。1.2　试剂和…     

聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒DNA及其临床意义分析

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染时,外周血中ＨＢＶＤＮＡ是病毒复制最直接和可靠的标志。自１９８５年以来,国外应用核酸分子杂交法、定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）法检测ＨＢＶＤＮＡ含量［１］,国内也有一些报道［２］。北京佑安医院自１９９６年１月至１９９７年８月采用...     

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的 建立检测HBV病毒DNA的荧光定量PCR法（FQ-PCR）,并与运用常规凝胶电泳技术观察特异扩增带检测的结果加以比较。方法 合成扩增HBV DNA314bp特异保守序列的1对引物及1条带2个荧光基团的寡核苷酸探针。用PE-5700型定量PCR仪完成PCR反应及产物的荧光定量检测。同是PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,EB染色,UVP（凝胶成像仪）检出有314bp带者为阳性或弱阳性。结果 建立了检测HBVDNA的荧光定量PCR技术,用已知HBV阳性模板不同拷贝数的标准溶液测得标准曲线Ct,原始拷贝数在10^5/ml以上者为阳性,用定量及定性PCR2种方法检测698例血清标本的结果表明：用FQ-PCR技术共检测出204例为阳性,阳性率29.2%;用定量及定性PCR2种方法检测698例血清标本的结果表明：用FQ-PCR技术共检测出204例为阳性,阳性率29.2%;用定性PCR观察到193例有阳性特异带,阳性检出率为27.65%。没有发现用定性PCR检测为阳性而用FQ-PCR检测为阴性者。结论 FQ-PCR检测HBVDNA较普通定性PCR技术具有操作简便,灵敏度更高、减少发生污染可导致假阳性结果的可能性及自动化程度高等优点,值得在临床检验中推广应用。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干扰素功能区域分析

目的 确定乙型肝炎病毒（HBV）DNA聚合酶末端蛋白（terminal protein，TP）抗α-干扰素（IFN-α）的功能区域。方法 PCR扩增IFN-α诱导人类6-16基因启动子并克隆入pCAT-Basic中，构建IFN—α反应报告载体p6-16CAT。以FuGENE6转染该报告载体至Huh7细胞并给予不同浓度IFN-α2a刺激，ELISA法检测细胞内氯霉素乙酰基转移酶（CAT）的表达，建立Huh7细胞对IFN-α反应强弱的定量判定标准。构建TP（包括Spacer区）基因缺失突变体重组真核表达载体，通过融合表达的多肽表位抗体，Westernblot法检测目的蛋白在Huh7细胞中的表达。重组表达载体分别与报告载体p6-16CAT共转染Huh7细胞，转染后48h给予终浓度为100IU／ml的IFN-α2a刺激，作用24h后裂解细胞，通过检测胞内CAT含量高低评价各缺失突变体抗IFN-α作用，并据此确定TP（包括Spacer区）抗IFN-α作用的功能区域。结果 获得6-16基因启动子并构建IFN-α反应报告载体p6-16CAT。转染p6-16CAT的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下CAT表达显著增强，且在IFN-α2a终浓度为100IU／ml时达到最大。Westem blot显示，IP（包括Spacer区）各基因缺失突变体在Huh7细胞中表达相应蛋白。共转染p6-16CAT及部分／全长1P的Huh7细胞在IFN-α2a刺激下，胞内CAT值和对照组相比无显著差别，相反，全长TP＋部分／全长Spacer使细胞内CAT值显著下降。结论 DNA聚合酶Spacer区与HBV抗IFN-α作用密切相关。     

鸭乙型肝炎病毒DNA体内转染的研究

利用两种鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）ＤＮＡ双体质粒及环化的ＤＨＢＶＤＮＡ体内转染２ｄ龄鸭及４～２０ｄ龄鸭，大多数鸭产生了短暂病毒血症，少数鸭产持续病毒血症，转染鸭血清中检测得ＤＨＢｓ／ｐｒｅＳＡｇ，ＤＨＢＶＤＮＡ及ＤＨＢＶ病毒颗粒，转染鸭血清腹腔注射１ｄ龄鸭可感染成功，转染鸭肝组织检测到复制型ＤＨＢＶＤＮＡ，提示转染后既有抗原有的表达，又有病毒的复制。另外，用两种ＤＨＢＶＤＮＡ单体质粒体内转染２ｄｘ     

酵母双杂交筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的 筛选与单剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接特异性新蛋白相互作用的肝细胞蛋白.方法 PCR扩增单剪接型2.2 kb HBV剪接特异性新基因TPss并克隆于诱饵载体pGBKT7,在证实TPss蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与TPss蛋白相互作用的肝细胞蛋白,进而通过哺乳动物细胞双杂交实验验证候选肝细胞蛋白与TPss蛋白在Huh7和HepG2肝细胞中的相互作用.结果 构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TPss,Western blot显示其在酵母中表达TPss蛋白.酵母双杂交筛选及哺乳动物细胞双杂交证实TPss蛋白可与4种肝细胞蛋白相互作用,即组织蛋白酶B、微粒体环氧化物水解酶、组织蛋白酶D与纤维蛋白原γ链.结论 TPss可与多种肝细胞蛋白相互作用.     

HCV核心蛋白结合蛋白基因6的克隆

目的：克隆与丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因。方法：应用酶母双杂交系统，构建丙型肝炎病毒核心蛋白诱铒质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆，既能在四缺营养缺陷培养基上生长(SD/Trp-Leu-Ade-His）又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠埃希菌后进行测序，进行生物信息学分析。结果：分析结果显示，其中6号克隆的测序结果与Genbank中的2个未知功能序列有98％的同源性，初步证明了此基因与丙型肝炎病毒核心蛋白有结合性。结论：丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白肝基因克隆成功。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因。方法将重组诱饵质粒pGBKT7eAg转化酵母细胞AH109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析。结果配合后筛选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xα半乳糖(Xαgal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株。完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,最终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因。结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索。     

乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。     

Inhibition of human hepatitis B virus DNA polymerase and duck hepatitis B virus DNA polymerase by triphosphates of thymidine analogs and pharmacokinetic properties of the corresponding nucleosides

Replication of hepadnaviruses involves a viral DNA polymerase containing both a DNA-dependent and an RNA dependent activity. This polymerase is a potential target for chemotherapy against hepatitis B. We have used human hepatitis B virus DNA-dependent DNA polymerase from human serum and duck hepatitis B virus DNA-dependent DNA polymerase from duck serum as well as RNA-dependent DNA polymerase activity from duck hepatitis B-infected duck liver. Triphosphates of thymidine analogs have been synthesized and tested for their inhibitory activities against these enzymes with the intention both to explore differences between these enzymes and structural requirements for inhibitors. The results showed that with the inhibitors tested, hepatitis B virus DNA-dependent DNA polymerase was the most sensitive enzyme and the triphosphate of 5-propenyl-2'-deoxyuridine was the most active inhibitor. In addition, the 5'-triphosphate of 5-propenyl-arabinofuranosyluracil also inhibited the hepadnavirus DNA-dependent DNA polymerases, and was a competitive inhibitor with respect to 2'-deoxythymidine triphosphate as showed by kinetic studies with duck hepatitis B virus DNA-dependent DNA polymerase from serum. Pharmacokinetic analysis showed 5-propenyl-2'-deoxyuridine to be well absorbed orally, but rapidly cleared from plasma. The arabinofuranosyl analog was also well absorbed but cleared less rapidly. Hence, these results indicate the potential of 5-propenyl-2'-deoxyuridine and 5-propenyl-arabinofuransyluracil for chemotherapy of hepatitis B.     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎HBV DNA阴转疗效影响因素研究

目的探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者疗效的影响因素。方法对拉米夫定治疗的慢乙肝202例和乙型肝炎肝硬化（简称乙肝肝硬化）55例患者，采用聚合酶链反应及错配聚合酶链反应限制性片段长度多态性分析的方法检测HBV DNA及乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶YMDD变异，应用SPSS统计软件对基线ALT、AST、TBIL、白蛋白、球蛋白、HBeAg（高、中、低）、HBV DNA等共10个变量作为处理因素进行统计学检验。结果随治疗时间的延长，慢乙肝和肝硬化者HBV DNA的阴转率于3、6、12、18、24、30个月分另1为87．62％、95．04％、86．63％、82．65％、75．43％、77．27％和94．54％、98．18％、81-81％、74．35％、73．91％、63．63％，时序检验及Cox回归分析结果表明：联合干扰素、基线ALT水平较高、HBV DNA水平较低和基线白蛋白水平较低，与HBV DNA转阴率高相关。结论联合干扰素、基线ALT水平较高、HBV DNA水平较低和基线白蛋白水平较低可作为HBV DNA转阴的预测因素。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCVNS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和Xα半乳糖(Xαgal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCVNS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xαgal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程。结论成功克隆出HCVNS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。     

DNA芯片检测乙型肝炎病毒基因多态性

目的　建立DNA芯片检测乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus,HBV)基因多态性的研究方法并对实验条件进行优化。方法　设计多条寡核苷酸探针 ,在硅烷化芯片的特定位置上 ,用点样仪将探针固定 ,并与PCR扩增的HBV基因相应区段杂交 ,杂交结果影印至硝酸纤维素膜 ,经BCIP NBT避光显色 ,用放大镜观察杂交信号呈暗紫色圆点 ,根据特定位置上杂交信号的有无和与之相应的探针序列来判定基因突变的类型。结果　通过 1次杂交反应可检测HBV前C C区 (nt 1896 1814 )、BCP区 (nt1762 1764)和P区 (nt 52 8 552 )等多个位点的变异 ,与测序分析结果完全一致 ,具有较好的检测灵敏度和重复性。结论　DNA芯片检测HBV基因常见突变位点多态性 ,操作简便易行 ,技术要求不高 ,具有临床推广应用价值 ,而且可以方便地通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应探针 ,扩大基因芯片的检测应用范围 ,为临床检测提供了新的方法     

丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达

目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。     

血清乙型肝炎病毒前S1抗原检测及其与病毒复制的关系

用抗Ｓ和抗前Ｓ１单抗的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测１５０例慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）携带者和健康人血清中的ＨＢＶ前Ｓ１抗原，其结果和ＨＢＶＤＮＡ聚合酶链反应（ＰＣＲ）、乙型肝炎血清标志的检测结果进行比较。结果表明：前Ｓ１抗原在乙型肝炎病毒ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）阳性组中的检出率和相对滴度显著高于ＨＢｅＡｇ阴性组（Ｐ＜０．０１）；在ＨＢｅＡｇ阴性组中，抗－ＨＢｅ阴性人群前Ｓ１抗原的检出率和相对滴度也显著高于抗－ＨＢｅ阳性人群（Ｐ＜０．０１）。前Ｓ１抗原和ＨＢＶＤＮＡ检测结果的符合率达８０％，两者检出率的相关系数ｒ＝０．９８２６（Ｐ＜０．０１）。结论：血清前Ｓ１抗原和乙型肝炎病毒的存在关系密切。     

不同慢性肝病患者血清中乙型肝炎病毒DNA定量检测及其临床意义

目的探讨乙型肝炎病毒ＤＮＡ含量的临床意义。了解乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫标志不同状态的慢性肝病患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度及其临床意义。方法应用建立的竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法定量检测慢性肝炎（ＣＨ）５１例、肝硬化（ＬＣ）３６例、原发性肝癌（ＰＨＣ）３８例的血清ＨＢＶＤＮＡ浓度。结果ＨＢＶＤＮＡ阳性的ＣＨ患者血清ＨＢＶＤＮＡ浓度为４．３６ｌｏｇ１０ＨＢＶＤＮＡ拷贝５０μｌ（下同），ＬＣ为４．５５，ＰＨＣ为４．４３，三组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）；血清ＨＢＶ五项免疫标志均阴性或抗－ＨＢｓ阳性的慢性肝病患者中，有３７．５％患者存在低水平ＨＢＶ复制；ＨＢｅＡｇ阳性患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度总体上明显高于抗－ＨＢｅ阳性组，但其中部分患者的ＨＢＶＤＮＡ浓度也很高。结论提示ＨＢＶ的复制状态与慢性肝病的病期无明显关系；在抗－ＨＢｅ阳性的患者中存在个体差异，故不能仅依据抗－ＨＢｅ阳转来判断ＨＢＶ复制减少或停止。