应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1结合的肝细胞蛋白编码基因

目的:构建乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1(XBP1)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与XBP1相互作用的基因。方法:通过PCR扩增获得XBP1基因,构建真核表达载体pGBKT7-XBP1,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-XBP1共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果:筛选出20种与XBP1相互作用的蛋白,其中包括金属硫蛋白,平滑肌细胞相关蛋白,去唾液酸糖蛋白受体,丙酮酸脱氢酶激酶1,甜菜碱甲基转移酶,视黄醇结合蛋白,补体因子B、人补体C9,转化生长因子β1,丝氨酸蛋白酶抑制剂;cAMP应答元件结合蛋白,拓扑异构酶IIβ等已知功能基因及1个未知功能序列。结论:筛选到多种XBP1相互作用的基因,包括与细胞内结构、细胞生长相关蛋白基因,参与细胞内代谢的蛋白基因,参与信号转导途径、免疫及其他相关蛋白基因,参与DNA的复制、转录、重组、修复的基因。     

应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β（IFNp）结合蛋白。方法 用多聚酶链反应（PCR）技术扩增IFNB基因，连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109，与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）和X-α-半乳糖（X-α-gal列）上进行双重筛选阳性克隆，提取酵母质粒后转化大肠埃希菌（DH5α）并经氨苄西林抗性筛选，提取单克隆菌落质粒，进行酶切鉴定及序列测定，并进行生物信息学分析。结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到19个克隆基因，编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNB具有结合作用。结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNB具有结合作用的蛋白。     

应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子

目的蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚。因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢c DNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索。方法以小鼠卵巢组织c DNA为模板,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测p GBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系。结果酶切鉴定和Blast分析表明p GBKT7-Pkmyt1质粒构建成功。将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Western blotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达。PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白。结论通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCVNS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和Xα半乳糖(Xαgal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCVNS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xαgal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程。结论成功克隆出HCVNS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。     

HSPC238相互作用蛋白RPL5的初步筛选北大核心CSCD

目的:构建HSPC238诱饵载体,筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成HSPC238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-HSPC238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-HSPC238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-HSPC238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是HSPC238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-HSPC238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与HSPC238相互作用的目标蛋白之一。     

酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4A结合蛋白及CAML基因的克隆

目的应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)相互作用的蛋白。方法连接有HCV NS4A酵母表达的载体pGBKT7-NS4A,转化入单倍体酵母细胞AH109,与转化了人白细胞cDNA文库质粒的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-a-半乳糖(X-a-Gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠埃希细菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析。对克隆重复率较高的蛋白编码基因进行克隆和回交验证。结果筛选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-a-gal的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落45个,其中钙离子信号调节亲环素配体(CAML)29个。对CAML基因成功克隆,回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用。结论成功筛选出7种在人白细胞cDNA文库中与HCV NS4A特异性相互作用的蛋白,为进一步探讨HCV的致病机制提供了新的线索。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因。方法将重组诱饵质粒pGBKT7eAg转化酵母细胞AH109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析。结果配合后筛选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xα半乳糖(Xαgal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株。完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,最终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因。结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索。     

应用酵母双杂交系统研究与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白

目的用酵母双杂交系统筛选与血管紧张素-(1-7)相互作用的蛋白,为该7肽在体内如何发挥功能提供线索。方法构建Ang-(1-7)的真核表达载体pBD—Ang-(1—7),转化酵母菌YRG-2,进行毒性和自身非特异激活性检验。与大鼠心肌细胞文库质粒共同转化酵母细胞,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选,选择既能在3重营养缺陷培养基上生长,也能使X—gal变蓝的克隆为阳性,提取靶质粒后进行复交,将真阳性质粒测序,进行生物信息学分析。结果诱饵载体构建成功并转化酵母,对酵母无毒性,无自身激活现象。筛选出的蛋白主要参与细胞代谢和蛋白合成。结论Ang-(1-7)可能影响细胞内某些蛋白合成和细胞代谢,发挥对血管紧张素Ⅱ的结抗作用。酵母双杂交结果为Ang-(1—7)的作用途径的进一步研究提供了分子生物学线索。     

酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用的宿主因子,为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础.方法将诱饵质粒pGBKT7-M122转化酵母菌AH109,Western blot检测诱饵蛋白在酵母细胞中的表达.阳性重组AH109菌株与小鼠脑cDNA文库进行配合,在色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有Ⅹ-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上进行筛选,提取阳性酵母菌质粒,转化大肠杆菌后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.将阳性文库质粒与诱饵质粒共同转化酵母AH109感受态细胞,重新验证其在酵母中的相互作用,同时阳性文库质粒与空载体pGBKT7亦被用同样的方法转入AH109感受态细胞,以排除阳性文库质粒的自激活作用.结果筛选出与M122蛋白相互作用的21种已知基因编码的蛋白质和3种未知基因编码的蛋白,其中21种已知蛋白分别为:突触融合蛋白8(syntaxin 8,Stx8)、磷酸葡萄糖变位酶2(phosphoglucomutase 2,Pgm2)、Shaker型电压依赖性钾通道的β1亚单位(potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,beta member 1,Kcnab1)、19型胶原蛋白(collagen,type ⅪⅩ,alpha 1,Col19a1)、古蛋白1(archain 1,Arcn1)、胞嘧啶核苷酸激酶(cytidylate kinase,Cmpk)、热休克蛋白DnaJ同系物A亚家族成员1[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily A,member 1,Dnaja1]、Na+、K+ATP转运酶β3亚单位(ATPase,Na+/K+ transporting,beta 3 polypeptide,Atp1b3)、SH3结构域GRB2样相互作用蛋白1[SH3-domain GRB2-like(endophilin)interacting protein 1,Sgip1]、锚蛋白重复域17(ankyrin repeat domain 17,Ankrd17)、无义介导的mRNA 降解因子Smg-7同系物(Smg-7 homolog,nonsense mediated mRNA decay factor,Smg7)、精子相关抗原9(sperm associated antigen 9,Spag9)、FK506结合蛋白1A(FK506 binding protein 1a,Fkbp1a)、MYST组蛋白乙酰转移酶4[MYST histone acetyltransferase(monocytic leukemia)4,Myst4]、透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1,Hapln1)、自噬相关蛋白3(autophagy-related 3,Atg3)、精氨酸/色氨酸富集的剪切因子5(splicing factor,arginine/serine-rich 5,Sfrs5)、C3HC型锌指蛋白(zinc finger,C3HC-type containing 1,Zc3hc1)、硫氧还蛋白相关的跨膜蛋白1(thioredoxin-related transmembrane protein 1,Txndc1)、接头蛋白复合物AP-1亚单位(adaptor protein complex AP-1,gamma 1 subunit,Aplg1)和Cul1蛋白(cullin 1,Cul1).回返验证实验进一步证实这些蛋白与M122蛋白能够在酵母细胞AH109发生相互作用,但Aplg1和Cul1被证实具有自激活作用.结论 筛选到的其中19种已知基因编码的蛋白可能与巨细胞病毒的致病机制相关,但仍需进一步的验证.     

人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人Flt-1胞外区2-3loopcDNA在Pichia.pastoris酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt-1(2-3)。方法采用PCR扩增Flt-1(2-3)基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia.pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/Flt-1(2-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His     

应用酵母双杂交技术筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白

目的: 应用酵母双杂交技术筛选小鼠巨噬细胞中与核因子κB受体激活因子(RANK)蛋白上新基序IVVY相互作用的蛋白,以探寻RANKL/RANK系统中介导破骨细胞形成的RANK下游新信号转导蛋白。方法: 应用GAL4酵母双杂交系统3,构建仅包含编码新基序⁵³⁵IVVY⁵³⁸ 的一小段RANK的cDNA片段为诱饵质粒pGBKT7-IVVY,并与巨噬细胞cDNA文库质粒pGADT7-library共转化AH109酵母,筛选与RANK蛋白新基序IVVY相互作用的蛋白,通过回复性杂交实验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和基因同源性分析。结果: 筛选出4个可能与IVVY基序有相互作用的蛋白,包括Ring1和YY1结合蛋白(RYBP)、ATP结合盒、E2F转录因子和热休克蛋白8,其中表达RYBP的阳性克隆出现频率高、速度快。结论: 应用酵母双杂交技术成功地筛选出4个可能与IVVY基序相互作用的候选蛋白,其中RYBP可能性最大。     

应用酵母双杂交系统发现hALR与Na,K-ATPase间的相互作用

目的:采用酵母双杂交系统寻找与人肝再生增强因子(hALR)相互作用的蛋白质, 探讨ALR的作用机理。方法: 构建hALR诱饵质粒pGBKT7-hALR, 醋酸锂法转化AH109酵母菌, 转化菌在SD/-Trp-His培养基上培养及滤纸法β一半乳糖苷酶活性检测排除自身激活作用后, 与人肝cDNA文库质粒预转化的酵母菌Y187进行接合试验, 接合产物在QDO培养基上筛选, 阳性克隆进一步在含X-α-Gal的QDO平板上鉴定, X-α-Gal活性呈阳性的克隆, 进行PCR及酶切鉴定排除完全相同克隆, 进一步进行回交试验排除假阳性, 对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果:得到数个阳性克隆, 序列分析结果表明其中1个阳性克隆是Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基部分基因, 长669bp, 3'端非编码区224bp, 编码区长445bp, 编码Na⁺, K⁺-ATPaseβ亚基C端的147个氨基酸残基。结论:应用酵母双杂交系统筛选出Na⁺, K⁺-ATPase与hALR具有相互作用。     

利用酵母双杂交技术筛选鉴定STCH与RanBP9的相互作用

以人应激和分子伴侣蛋白(STCH)为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术在高严格条件下筛选人脑cDNA文库。在SD/-4培养基上共获得156个阳性克隆,将酵母菌扩增后抽提质粒,转化大肠杆菌,进行序列分析,并经过回复杂交验证,潜在的与STCH相互作用的蛋白有:VDAC、MBP2、ZNF251、RanBP9、Phosophate glycolase、β-tubulin、up1、up2和WW adaptor蛋白。基于各候选蛋白与神经系统疾病的关系,选择RanBP9作进一步验证实验。经体外GST-Pulldown和体内免疫共沉淀实验证实RanBP9和STCH能够相互作用,明确RanBP9的羧基端为相互作用的最小功能域。此结果为我们进一步揭示STCH作用的分子机制提供了线索。     

与人巨细胞病毒UL128两种不同结构蛋白相互作用蛋白的筛选与分析

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与两种不同转录结构的人巨细胞病毒(HCMV)UL128编码蛋白相互作用的蛋白,比较两者相互作用蛋白之间的异同点.方法 通过3'RACE和5'RACE技术扩增出两种HCMV UL128片段,其大小分别为519 bp和642 bp,并将其成功构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7中.将以上两种酵母表达载体分别转化到酵母菌AH109中,再将文库DNA转化到已含有酵母表达载体的AH109中,筛选与两种片段大小不同的UL128编码蛋白相互作用的人胎脑蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 筛出EFEMP2与UL128-519 bp编码蛋白相互作用,THY-1与UL128-642 bp编码蛋白相互作用.结论 成功构建pGBKT7 UL128-519 bp和pGBKT7 UL128-642 bp,并应用酵母双杂交系统分别筛选出EFEMP2和THY-1与UL128-519 bp和UL128-642 bp编码蛋白相互作用,在所筛选得到的相互作用蛋白之间未发现有相同的蛋白,UL128-519 bp和UL128-642 bp所编码的蛋白在HCMV感染致病过程中可能发挥不同的作用.