绿色荧光蛋白逆转录病毒及其介导的视网膜色素上皮细胞基因转移研究

目的 制备携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因的逆转录病毒,感染原代与建株的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE)细胞,评价逆转录病毒对人RPE细胞的感染能力,为视网膜病变的基因治疗奠定基础。方法 分离编码GFP的cDNA片段并插入逆转录病毒载体pLNCX,借助脂质体将重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转入单嗜性及双嗜性包装细胞,G418筛选抗性克隆,分离GFP表达水平最高的克隆;收集含病毒颗粒的上清液感染NIH3T3及体外培养的人原代与建株的RPE细胞。结果 重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染各种包装细胞后,可产生GFP逆转录病毒。由双嗜性包装细胞产生的GFP逆转病毒能够感染原代与建株的人RPE细胞,GFP基因可持续在RPE细胞内表达。结论 逆转录病毒能够简便、快速、稳定将目的基因转入RPE细胞,可作为眼底病变基因治疗介导目的基因转移的重要工具。     

人视网膜色素上皮细胞NF-kB的表达

目的探讨核因子闎(NF-кB)在体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞中的基础表达以及吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrollidi ne dithiocarbamate,PDTC)、IL-1β对NF-кB表达的影响. 方法体外培养的hRPE细胞经同步化后分2组分别加药(1)无PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在hRRE中的基础表达);(2)PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在PDTC预处理后hRPE中的表达).免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cytometry, FCM)测定上述2组标本中hRPE的NF-кB的表达率. 结果 NF-кB在hRPE中的基础表达率为8.05 %,IL-1β作用后表达率升高到30.26%; hRPE细胞经PDTC预处理后,NF-кB的表达率下降为3.74%,加入IL-1(10 υg·L-1)作用后表达率为3.66%. 结论 IL-1β可以显著提高NF-кB在hRPE细胞中的表达;PDTC可以显著降低体外培养的hRPE中的NF-кB表达率,PDTC亦可显著抑制由IL-1β诱导的NF-кB的活化过程.     

疱疹性口腔炎病毒G蛋白/胸苷激酶逆转录病毒载体转移人视网膜色素上皮细胞及其表达

目的　应用新型逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpessimplexvirus thymidinekinase ,HSV TK)基因转移 ,探讨丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对HSV TK基因修饰人视网膜色素上皮细胞 (retinalpigmentepithelialcells,RPE)的杀伤抑制作用。方法　生产制备高滴度疱疹性口腔炎病毒G蛋白 (vesicularstomatitisvirus Gprotein ,VSV G) /胸苷激酶 (thymidinekinase ,TK)和VSV G/LacZ病毒 ,对NIH3T3细胞进行VSV G/TK滴度测定 ;VSV G/LacZ感染CRL2 30 2细胞后 ,以X gal染色估计感染率 ;对CRL2 30 2细胞、分离培养的RPE细胞及NIH3T3细胞感染不同病毒滴度的VSV G/TK ,结合GCV作用 ,观察 3种细胞生长抑制率。结果　VSV G/TK滴度为 1 2× 10 8克隆形成单位 /ml;VSV G/LacZ感染CRL2 30 2细胞的X gal染色蓝染细胞率为 5 8% ;当感染复数为 2 0 0时可最大的抑制细胞生长 ,抑制率为 4 5 %。结论　VSV G逆转录病毒可以介导LacZ、HSV TK基因在离体NIH3T3细胞和人RPE细胞中高效转移和表达。被HSV TK基因修饰的细胞对GCV作用敏感 ,其生长受到抑制。     

细胞周期与视网膜色素上皮细胞的生长

目前玻璃体视网膜手术在治疗PVR方面取得了巨大成功但是手术并不能完全阻止甚至可能刺激RPE细胞的迁移和增殖,从而导致PVR的复发。RPE细胞是参与PVR形成的一种重要细胞,因此有关药物抑制RPE细胞增殖的研究受到重视,本文综述了近年来影响RPE细胞周期药物的研究进展.展望了通过调控RPE细胞周期来抑制细胞增殖以防治PVR的前景。     

生长因子与视网膜色素上皮细胞免疫调节

眼后节的免疫炎症反应是由多种趋化因子、炎前因子和抗炎因子相互作用的复杂过程。RPE(retinal pigment epithelium)细胞是眼后节细胞因子的主要来源,并在炎症中作为细胞因子的靶目标。通过调节RPE细胞分泌的细胞因子有望调节眼后节的免疫炎症反应,维持视网膜结构功能的完整及内环境的稳定,清除入侵病原体和异体抗原.维持良好的视功能。本文就参与RPE细胞免疫调节的细胞因子和细胞因子对眼后节免疫炎症反应的影响综述如下。     

增生细胞核抗原在视网膜色素上皮细胞表达及其反义寡核苷酸的抑制作用

目的 研究视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及其反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AS ODN)对其表达和细胞增生的抑制作用，为增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)治疗探索基因治疗新途径。 方法 (1)体外培养兔眼RPE细胞，在不同时间采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(streptoavidin-biotin enzyme complex,SABC)免疫组织化学法检测PCNA的表达;(2)脂质体介导下不同浓度的PCNA AS-ODN和正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,S-ODN)分别作用于体外培养的RPE细胞，采用免疫组织化学方法检测PCNA的表达;(3)四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测在不同浓度的PCNA AS-ODN和S-ODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率。 结果 (1)体外培养兔眼RPE细胞表达PCNA，表达高峰为培养后48 h ;(2)在0.28、1.12 μmol/L AS-ODN 作用下，PCNA的表达明显受抑制;(3)0.28、1.12 μmol/L的PCNA AS-ODN 能明显抑制RPE细胞增生活性，并呈剂量依赖性，其生长抑制率分别达53%、81%。 结论 一定浓度PCNA AS-ODN能序列特异性地抑制RPE细胞PCNA表达和增生活性，有望进一步用于PVR的治疗实验研究。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 231-233)     

人视网膜色素上皮细胞NF-кB的表达

目的探讨核因子闎(NF-кB)在体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞中的基础表达以及吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrollidi ne dithiocarbamate,PDTC)、IL-1β对NF-кB表达的影响. 方法体外培养的hRPE细胞经同步化后分2组分别加药:(1)无PDTC组:分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在hRRE中的基础表达);(2)PDTC组:分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在PDTC预处理后hRPE中的表达).免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cytometry, FCM)测定上述2组标本中hRPE的NF-кB的表达率. 结果 NF-кB在hRPE中的基础表达率为8.05 %,IL-1β作用后表达率升高到30.26%; hRPE细胞经PDTC预处理后,NF-кB的表达率下降为3.74%,加入IL-1(10 υg·L-1)作用后表达率为3.66%. 结论 IL-1β可以显著提高NF-кB在hRPE细胞中的表达;PDTC可以显著降低体外培养的hRPE中的NF-кB表达率,PDTC亦可显著抑制由IL-1β诱导的NF-кB的活化过程.     

人视网膜色素上皮细胞NF-κB的表达

目的探讨核因子κB(NFκB)在体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞中的基础表达以及吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrolli dinedi thio carbamate,PDTC)、IL1β对NFκB表达的影响。方法体外培养的hRPE细胞经同步化后分2组分别加药:(1)无PDTC组:分别加入IL1β、生理盐水(用于检测NFκB在hRPE中的基础表达);(2)PDTC组:分别加入IL1β、生理盐水(用于检测NFκB在PDTC预处理后hRPE中的表达)。免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cyto metry,FCM)测定上述2组标本中hRPE的NFκB的表达率。结果NFκB在hRPE中的基础表达率为8.05%,IL1β作用后表达率升高到30.26%;hRPE细胞经PDTC预处理后,NFκB的表达率下降为3.74%,加入IL1β(10μg·L-1)作用后表达率为3.66%.结论IL1β可以显著提高NFκB在hRPE细胞中的表达;PDTC可以显著降低体外培养的hRPE中的NFκB表达率,PDTC亦可显著抑制由IL1β诱导的NFκB的活化过程。     

Peroxiredoxin6在氧化损伤人视网膜色素上皮细胞中的表达

目的 探讨Peroxiredoxin 6(Prx6)在体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的表达情况,以及在人RPE细胞受到不同浓度的H2O2攻击时Prx6表达量的变化.方法 复苏培养人RPE细胞传至第3代,实验分为正常对照组和不同浓度H2O2攻击组(0.125 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1),加入H2O2,后24 h收集细胞.通过免疫组织化学和RT-PCR法检测各组细胞Prx6的表达情况,同时应用MTT法检测各组细胞的存活率.结果 免疫组织化学和RT-PCR结果显示培养的正常RPE细胞中即有Prx6的表达.0.125 mmol·L-1.H2O2攻击组Prx6阳性表达量较正常组增多(4倍),0.25 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1H2O2,攻击组Prx6阳性表达量逐渐减少,1 mmol·L-1H2O2攻击组Prx6表达为阴性.MTT结果显示在H2O2浓度为0.125 mmol·L-1时,细胞的存活率仅轻微下降(91%),与正常组相比无统计学意义(P=0.086);在浓度为0.25 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1时,细胞的存活率明显下降,分别为83%、74%和52%,与正常组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 适量的氧化攻击可以诱导RPE细胞Prx6表达增高,进而保护细胞免受氧化损伤.     

Cyclophilin D在氧化应激下人视网膜色素上皮细胞中的表达

目的　检测氧化应激下人视网膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＲＰＥ）细胞内ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ的表达,初步探索ＲＰＥ细胞氧化损伤保护新靶点。方法　培养细胞系ＡＲＰＥ１９及人原代ＲＰＥ细胞,相差显微镜下观察细胞形态,应用激光共聚焦显微镜免疫荧光法鉴定细胞。不同浓度Ｈ２Ｏ２（０μｍｏｌ·Ｌ－１、１００μｍｏｌ·Ｌ－１、５００μｍｏｌ·Ｌ－１、１ｍｍｏｌ·Ｌ－１）处理细胞２４ｈ后,应用ＲＴ-ＰＣＲ检测ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ在细胞内的表达。随后预先在部分细胞中加入３μｍｏｌ·Ｌ－１环孢素Ａ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ,ＣｓＡ）处理３０ｍｉｎ后再加入不同浓度Ｈ２Ｏ２（８０μｍｏｌ·Ｌ－１、１６０μｍｏｌ·Ｌ－１、３２０μｍｏ·Ｌ－１）２ｈ,即ＣｓＡ＋Ｈ２Ｏ２组,应用乳酸脱氢酶（ｌａｃｔｉｃｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＬＤＨ）法检测细胞致死率,并与Ｈ２Ｏ２组的ＬＤＨ释放量相比较。结果　培养的ＡＲＰＥ１９和人原代ＲＰＥ细胞均表达ＲＰＥ细胞特异性抗体ＲＰＥ６５。１００μｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２处理细胞２４ｈ后ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ表达量明显升高,当Ｈ２Ｏ２浓度增加到５００μｍｏｌ·Ｌ－１时,ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ表达量降低,１ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２处理时,ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ表达水平未见增加。在各Ｈ２Ｏ２ 组组间,ＬＤＨ的释放量随着Ｈ２Ｏ２ 浓度的升高而增加;与Ｈ２Ｏ２ 组相比,ＣｓＡ＋Ｈ２Ｏ２组ＬＤＨ的释放水平明显降低（Ｐ＜０．０５）。结论　氧化应激下ＲＰＥ细胞内ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＤ的表达升高,该蛋白表达的增加可能进一步导致氧化应激下细胞的死亡,ＣｓＡ可能成为ＲＰＥ细胞保护的新策略。     

HTLV-1 Tax 基因真核表达载体的构建及对 RPE 细胞的影响

目的构建人T淋巴细胞白血病病毒-1(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)Tax基因真核表达载体,在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达Tax蛋白,观察其对细胞的影响。方法应用基因重组技术构建重组载体PIRES2-EGFP-Tax(PT),鉴定后将重组载体转染入RPE细胞,应用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测细胞内Tax基因和蛋白的表达;通过MTT和流式细胞仪检测质粒(空白载体、PT和Green-Tax)转染RPE细胞24h和48h后对RPE细胞生长活力及细胞周期的影响。结果经双酶切鉴定和测序分析证实成功地构建了HTLV-1Tax真核表达载体;通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测到转染Tax重组载体的RPE细胞中有Tax基因和蛋白的表达。质粒转染RPE细胞后,细胞生长活力受到抑制,G1期减少而S期增加。但转染Tax质粒和空白载体,对RPE细胞的生长活力和细胞周期产生相似影响。结论成功构建了HTLV-1Tax基因真核表达载体,并在RPE细胞中表达Tax蛋白;Tax质粒对RPE细胞的影响不排除是转染试剂所致。     

老年性白内障晶状体上皮细胞凋亡及相关基因蛋白的表达

目的 探讨老年性白内障与晶状体上皮细胞凋亡的关系。方法透射电镜下观察老年性白内障晶状体上皮细胞的超微结构；Tunel法检测凋亡细胞百分率；并对其晶状体上皮细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳；免疫组化法检测P53、bcl-2在老年性白内障晶状体上皮细胞中的蛋白表达。结果 透射电镜下发现老年性白内障晶状体上皮细胞中有凋亡细胞；凋亡细胞百分率为8．4％～37．8％，琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带；P53在老年白内障晶状体上皮细胞中蛋白表达率为16．9％～19．1％，bcl-2无蛋白表达。结论 老年性白内障的发生可能与其晶状体上皮细胞凋亡有关。     

超声微泡介导增强型绿色荧光蛋白基因转染视网膜神经节细胞的体内实验

目的 验证超声微泡介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因能否在体内成功转染视网膜神经节细胞(RGCs),是否比传统的转染方式效率高以及这种转染方式是否损伤RGCs.方法 将SD大鼠50只随机分为4组:正常对照组(n=5)、单纯质粒组(n=15)、质粒+超声组(n=15)、超声微泡组(n=15).采用玻璃体腔注射试剂的方法,正常对照组注射5 μl生理盐水;单纯质粒组,注射5μl质粒;质粒+超声组,注射5μl质粒后,立即用0.5 W/cm2超声波辐照大鼠眼球60 s,工作时间控制为1/3(即辐照5s,停10 s,共60 s);超声微泡组,注射质粒微泡混悬液5 μl后,立即用前述同等能量超声波辐照大鼠眼球.7d后,取大鼠眼球制作视网膜铺片、冰冻纵切片及视网膜EGFPmRNA的RT -PCR.用荧光显微镜观察铺片及切片中EGFP在RGCs的表达情况.用RGCs计数观察RGCs损伤情况[1-2].用RT-PCR对EGFPmRNA进行半定量检测.结果 超声微泡介导EGFP基因转染RGCs的效率明显高于正常对照组、单纯质粒组和质粒+超声组,且对RGCs无明显损伤.结论 在低频超声波的照射下,超声微泡能够在体内安全、有效地介导EGFP基因转染RGCs.     

慢病毒介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究

背景研究发现人羊膜上皮细胞（AECs）具有干细胞的某些特性,已有学者用其进行眼表重建,其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞。目的探讨经慢病毒载体（pLenti6／V5一DEST）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰的人AECs作为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。方法利用慢病毒载体携带标记基因EGFP转染人AECs,荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达,倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态,用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP的阳性表达率,然后应用EGFP基因修饰的人AECs构建复层上皮细胞一角膜基质移植材料。手术切除兔眼的全部角膜缘组织制备角膜缘干细胞缺损动物模型,随机分为2组,实验组兔眼移植EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料,对照组兔眼移植无上皮细胞的角膜基质移植材料,每天裂隙灯下观察2组兔眼角膜的混浊、结膜上皮化和新生血管化情况。1个月后处死动物摘除眼球,荧光显微镜下观察角膜植片中EGFP的表达,用免疫组织化学法检测其细胞角蛋白8（CK8）、CKl8和CKl2的表达,以鉴定移植细胞分化为角膜样的上皮细胞。结果大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人AECs形态相似,流式细胞仪检测显示瞬时转染48h的人AECs中EGFP阳性表达率最高,为61．50％,与12、24、96h转染组15．24％、38．27％、39．10％比较差异均有统计学意义（P〈0．05）,与72h转染组的58．36％比较差异无统计学意义（P〉0．05）。实验组10只兔眼中有6只眼角膜恢复透明,组织片在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光,免疫组织化学结果显示CK8、CKl8、CKl2表达均为细胞质棕色染色,细胞核蓝染。对照组兔眼角膜均混浊、水肿,荧光显微镜下未见荧光,且部分角膜组织有CK8、CKl8表达,无CKl2表达。结论EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞一角膜基质移植材料能较好地重建角膜缘干细胞缺乏的兔眼角膜表层,可能是组织工程角膜表层一种新的细胞来源。慢病毒载体是一种安全有效的基因转移工具。     

细胞周期依赖性激酶抑制剂P27、P21在人角膜上皮的表达研究

目的　探讨细胞周期依赖性激酶抑制剂 (CKI) P2 7、P2 1在角膜上皮细胞的表达情况。方法　应用 SP免疫组化法 ,检测 P2 7、P2 1等细胞周期依赖性激酶抑制剂和增殖细胞核抗原 (PCNA)在角膜上皮不同部位的表达情况。结果　角膜缘上皮区 PCNA呈阳性表达 ,主要位于基底细胞层 ,中央区角膜上皮内未见阳性表达 ,差异有显著意义 (P <0 .0 1) ;P2 7、P2 1在中央区角膜上皮内呈阳性表达 ,角膜缘上皮内未见阳性表达 ,差异均有显著意义(P <0 .0 1)。结论　细胞周期依赖性激酶抑制剂 P2 7、P2 1和 PCAN在角膜上皮不同部位的表达差异 ,提示在角膜缘上皮基底层内存在着一群有较高的增殖能力、处于 G1 期的细胞群 ,即干细胞     

三种基因导入系统对视网膜色素上皮细胞转染效率的研究

目的：以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green flu—oreacent protein，EGFP)为报告基因，研究lipofectamine2000、Fu—GENF6和逆转录病毒载体介导的基因导入系统对视网膜色素上皮细胞的基因转染效率，为视网膜及视网膜相关疾病的基因治疗奠定基础。方法：在体外分离培养人视网膜色素上皮细胞，构建含有EGFP基因的表达载体，分别应用阳离子脂质体lipofectamine2000、FuGENE6和逆转录病毒三种方法将EGFP基因转染到人视网膜色素上皮细胞中，转染后于48h在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。结果：三种方法介导EGFP基因在人视网膜色素上皮细胞中表达的阳性比例平均分别为52％、10％和72％。结论：在体外可通过逆转录病毒系统或阳离子脂质体lipofectamine2000有效地将外源基因导入到人视网膜色素上皮细胞中，其中以逆转录病毒系统转染效率为最高。     

p42/p44MAPK通路在高糖诱导的hRPE细胞VEGF表达中的作用

目的：探讨p42/p44丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号转导通路在高糖诱导的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达中的作用。

方法：采用hRPE细胞株,将细胞分为正常对照组(5.6mmol/L葡萄糖)、高糖对照组(15,20,30mmol/L葡萄糖)、PD98059处理组(20μmol/L p42/p44MAPK高效选择性抑制剂PD98059处理hRPE细胞)和溶剂二甲基亚砜对照组(dimethyl sulfoxide,DMSO组)。应用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测VEGF及色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor, PEDF)mRNA的表达。应用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术检测细胞上清液中VEGF蛋白的表达

结果：高糖作用下VEGF mRNA和蛋白表达显著增高,PD98059处理组VEGF mRNA和蛋白表达受到抑制,且VEGF mRNA/PEDF mRNA比值较高糖组显著降低。

结论：p42/p44MAPK信号转导通路可能参与了高糖引起的hRPE细胞VEGF的表达。     

癌钙调蛋白／鱼精蛋白截短体融合基因在原核表达载体中的构建及鉴定

目的在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）／鱼精蛋白截短体（tp）融合基因,进行基因测序鉴定。方法提取SD大鼠腹腔巨噬细胞,并进行细胞计数,经巨噬细胞特异性抗体CD68鉴定。设计引物扩增OM基因,并在其3’端引入印的编码基因,经PCR扩增获得OM／tp融合基因,通过中间载体PUC57进行目的基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体PET32a连接,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,小量提取质粒,送样经公司测序鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳获得OM／tp目的基因,与预期的目的基因大小一致,回收目的基因与中间载体PUC57连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PUC57-OM／tp,经测序鉴定后与预期的序列一致。质粒PUC57-OM／tp酶切后与载体PET32a连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PET32a—OM／tp经测序后与预期的序列一致。结论OM／tp融合基因的成功构建,为该融合蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础。     

细胞周期依赖性激酶抑制剂P27,P21在人角膜上皮的表达研究

目的:探讨细胞周期依赖性激酶抑制剂(CKI)P27,P21 在角膜上皮细胞的表达情况。方法:应用 SP 免疫组化法,检测 P21,P27 等细胞周期依赖性激酶抑制剂和增殖细胞核抗原(PCNA)在角膜上皮不同部位的表达情况。结果:角膜缘上皮区 PCNA 呈阳性表达,主要位于基底细胞层,中央区角膜上皮内未见阳性表达,差异有显著意义(P <0.01);P27,P21 在中央区角膜上皮内呈阳性表达,角膜缘上皮内未见阳性表达,差异均有显著意义(P <0.01)。结论:细胞周期依赖性激酶抑制剂 P27,P21 和 PCNA 在角膜上皮不同部位的表达差异,提示在角膜缘上皮基底层内存在着一群有较高的增殖能力,处于 G1 期的细胞群,即干细胞。