骨髓间充质干细胞旁分泌HGF体外调控肝星状细胞

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）与肝星状细胞（HSCs）体外共培养体系中,BMSCs旁分泌肝细 胞生长因子（HGF）对 HSCs 增殖、凋亡、活化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离、培养、纯化大鼠 BMSCs,另培养 HSCs。6 孔板半透膜建立上下两层细胞非直接接触共培养体系,实验设 H 组（HSCs 单独培养）、H-H 组（HSCs 与 HSCs共培养）、M-H组（BMSCs与HSCs共培养）、M-H-C组（BMSCs与HSCs共培养并加c-met抑制剂）,各组细胞培 养48 h后,流式细胞仪鉴定BMSCs,检测HSCs凋亡率,MTT法检测HSCs的增殖,免疫荧光共聚焦定量检测HSCs中 α-肌动蛋白（α-SMA）的表达量,ELISA法检测共培养体系上清液中HGF的浓度。结果 MSCs高表达阳性表面分子 CD29、CD90,低表达造血细胞表面标记CD45;BMSCs能明显抑制HSCs的增殖、活化并促进其凋亡,且M-H组上清液 中HGF的浓度明显高于其他组。结论 BMSCs与HSCs共培养过程中,BMSCs通过旁分泌HGF促进HSCs的凋亡,抑 制HSCs的增殖、活化。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性

目的探讨人骨髓来源MSCs的分离、培养和生物学特性,为骨组织工程提供种子细胞。方法从捐赠者髂骨穿刺收取骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化BMSCs,取生长良好的P3或P4代BMSCs进行检测：①MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析;②流式细胞仪检测BMSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期;③免疫荧光分析细胞骨架;④细胞染色体核型分析;⑤成骨细胞诱导分化及检测。结果①利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离人BMSCs,经传代后细胞形态呈梭形,均匀一致。②MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析结果显示BMSCs在传代后经历潜伏期、对数生长期和平台期。③流式细胞仪检测显示所获得的BMSCs表面抗原标记高度一致。④BMSCs细胞周期检测结果为G0＋G1期91.3%、G2期4.1%和S期4.6%。⑤微管微丝免疫荧光染色结果显示,培养的BMSCs具有良好的细胞骨架系统。⑥第7代的BMSCs染色体检测结果显示,被测标本有正常染色体数目（2n=46,XY）,且未见染色体异常。⑦成骨诱导后,Von kossa和茜素红染色均呈阳性。结论从人骨髓中能分离出高度一致的BMSCs,这些细胞具有正常细胞骨架结构以及正常的人类染色体数目和形态,具有向成骨细胞分化能力,可作为骨组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养

目的 建立体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞传代培养.倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第3代细胞分别加入成骨、成脂诱导剂并采用碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.传至第3代细胞纯度可达97%以上,其细胞表型CD29、CD44、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD80、CD86呈阴性表达.经成骨诱导后细胞碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色呈阳性,成脂诱导后细胞油红O染色呈现阳性.结论 应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠bMSCs,培养的细胞扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的：探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）方法以及通过形态学观察BMSCs在培养过程中是否存在自分化现象。方法应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs ,倒置显微镜下观察细胞形态,直接荧光抗体染色法鉴定培养的细胞,免疫细胞化学方法鉴定其向神经元的诱导分化。结果原代末期及传代的BMSCs呈均一长梭形生长,第三代荧光抗体染色CD29,CD90阳性表达,神经元特异性标记物Nse（神经元特异性烯醇化酶）表达阳性,BMSCs在未加任何诱导剂时培养30d时发生了自分化现象。结论贴壁培养法是一种有效的获得高纯度BMSCs的方法,在体外培养时BMSCs可发生自分化现象。     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞的生长特性。方法在无菌条件下,取大鼠骨髓,采用密度离心法和全骨髓贴壁法联合培养并结合传代获取、纯化细胞,倒置显微镜观察其形态,流式细胞术检测其表面抗原CD29、CD90及CD34的表达。CCK-8法测定第1、3代细胞的增殖情况,并绘制其生长曲线。结果经全骨髓贴壁法和密度梯度离心联合培养,所得到的原代细胞形态呈椭圆形、圆形、三角形,接近融合状态时可呈现均一的长梭形,排列规则。传至第8代时,细胞的增殖能力减弱,其形态宽大畸形,呈树枝状。经流式细胞仪检测,所分离的细胞CD29的表达率为94.97%,CD90的表达率为88.50%,CD34的表达率为2.23%。CCK-8法显示第3代细胞有较强的增殖能力。结论体外培养的大鼠BMSCs是骨组织工程的优良种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离增殖及分化潜能活性

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、纯化、增殖的方法，并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性。方法：取SD大鼠的股骨及胫骨，冲取骨髓液，采用贴壁培养法分离纯化MSC，增殖，并测定其生长曲线。对第三代大鼠MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨矿化情况。对第三代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化，测定诱导后的细胞表型情况。结果：大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长，贴壁及增殖能力强。生长曲线呈S型。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后AIP活性显著提高。并出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌异染基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论：获得的SD大鼠MSC生长旺盛，增殖能力强。在特定诱导条件下。大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞。具有成骨及成软骨分化潜能。     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离培养方法并鉴定其生物学特性.方法 采用全骨髓贴壁细胞培养法进行BMSCs的分离培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特性,绘制细胞生长曲线,并检测细胞在不同诱导条件下向成脂肪细胞和成骨细胞分化的能力.结果 原代大鼠BMSCs培养24 h后镜下观察大部分细胞已经贴壁,传至第三代,细胞形态均一,呈梭形、螺旋样排列.经过约2 d的适应期,3～7 d进入对数生长期,7 d后进入平台期;成骨细胞诱导18 d,茜素红染色可见明显钙结节,成脂肪细胞诱导2周后油红O染色可见明显脂质沉淀.结论 全骨髓贴壁细胞培养法操作简单、快速,可以获取形态均一、纯度较高的BMSCs.     

萘哌地尔衍生物YMⅢ对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机理研究

目的：本实验旨在观察萘哌地尔衍生物YMⅢ对体外培养的自发性高血压大鼠（SHR）及Wistar大鼠胸主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响，为该药的开发研究提供基础资料。方法：（1）将SHR及Wistar大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行体外培养，以SHR胸主动脉平滑肌细胞为研究对象，以Wistar大鼠作对照。（2）应用四甲基偶氮唑盐（MTT）微量酶反应法检测细胞增殖活性；real-time PCR技术检测其对Agt、     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

不同年龄兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性分析

目的观察不同年龄兔骨髓间充质干细胞(BMSC)在体外分离、培养、扩增的过程,并对其生长特性进行初步比较分析,为BMSC的临床应用提供技术方法和依据。方法选取出生1月、18月、36月的健康中国白兔,分成新生、成年、老年3组,采用密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,分离培养BMSC,用噻唑蓝(MTT)法观察其增殖及生长特征,用流式细胞仪检测细胞表面标志。结果各组BMSC均贴壁生长,呈成纤维细胞样BMSC典型形态,贴壁率的观察和生长曲线显示,在相同的培养条件下,新生兔细胞增殖最快,细胞可扩增能力最强,而老年兔细胞增殖最慢,细胞可扩增能力最弱,成年兔细胞介于两者之间。结论利用密度梯度离心法结合贴壁培养法可以从不同年龄兔中获得高纯度的BMSC,干细胞的活性和增殖能力随着年龄的增加而降低。     

小细胞肺癌细胞株H446肿瘤细胞球培养方法的优化

摘要 目的：优化体外培养小细胞肺癌细胞株H446肿瘤细胞球的方法。方法：利用干细胞无血清培养技术,观察H446细胞在下述不同培养条件下肿瘤细胞球的生长情况：接种于超低吸附及非超低吸附培养板,调整细胞密度至1×104/ mL、1×105/ mL、1×106/ mL 和1×107/ mL,采用针头吹打法和移液器吹打法将肿瘤细胞球制成单细胞悬液用以进一步传代。结果：（1）超低吸附培养板第二天形成明显肿瘤细胞球,非超低吸附培养板第十天出现肿瘤细胞球。（2）1×106/ mL组每个高倍视野下约有7个肿瘤细胞球,每个细胞球约由几十个甚至上百个细胞组成。（3）针头吹打法传代后肿瘤细胞球活性和增殖能力明显优于移液器吹打法。结论：选择超低吸附培养板、1×106/ mL密度接种和针头吹打法可有效分离肿瘤细胞球     

MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究

目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞（MSCs）的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液（比重1．077g／m1）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），在含10％胎牛血清L—DMEM培养基中培养，并传代扩增MSCs；选取状态较稳定的第4代细胞，分别用含10％胎牛血清和2％胎牛血清的诱导液（终浓度为10ng／mlVEGF、2ng／mlbFGF的DMEM培养液）继续培养，于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况，免疫组化法观察FVⅢ的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs，细胞呈均一的成纤维细胞样，流式细胞术分析MSCs结果显示，CD34阳性率为1．01％、CD29阳性率为97．32％；诱导14d后免疫组织化学法检测FVⅢ的表达，10％和2％胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12．21％和91．43％。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs；就诱导效果而言，2％胎牛血清诱导体系明显好于10％胎牛血清诱导体系，说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。     

骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠肝细胞增殖影响的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的机制。方法全骨髓贴壁法培养扩增原代SD大鼠骨髓干细胞,传代培养,形态学、生长曲线及免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞,移植治疗D-氨基半乳糖联合脂多糖致肝衰竭大鼠,观察干预治疗后1d、3d、5d、7d肝组织病理学改变、肝组织PCNA蛋白、CyclinDlmRNA表达量。结果原代培养大鼠骨髓间充质干细胞传代后,形态较均一,为梭形或纺锤形,高表达CD90（94．3％）,CD29（99．4％）,不表达CD11b／c（5．7％）,CD45（3．2％）。骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏组织病理损伤（P〈0．05）。BMSCs治疗组PCNA的蛋白表达高于对照组（P〈0．01）。干预后不同时间点治疗组细胞周期蛋白D1的mRNA表达高于对照组（1．182±0．248VS0．468±0．053、0．858±0．114vs0．218±0．178）,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏病理损伤,上调细胞周期蛋白DlmRNA的表达,促进肝再生,对急性肝衰竭有治疗作用。     

不同培养基对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察不同培养基对人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）生物学特性的影响,优化培养方法。方法采用贴壁法从正常足月胎儿脐带中分离出间充质干细胞,细胞贴壁后利用DMEM/F12,Mesen PRORSTM Medium这两种培养体系进行体外扩增,绘制生长曲线,流式细胞仪检测其表面标志。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45和HLA-DR。结论加入Mesen PRORSTM Medium培养的细胞增殖速度快,更适合于脐带间充质干细胞的体外扩增。     

Fractalkine/CX3CR1参与骨髓间充质干细胞向缺血脑组织定向迁移的实验研究

目的 观察fractalkine及其受体CX3CR1是否参与介导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向缺血脑组织的定向迁移.方法 密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化BMSCs.利用RT-PCR和免疫组化方法检测BMSCs对CX3CR1的表达.建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型.使用Transwell小室建立体外趋化迁移模型,观察fractalkine和缺血脑组织萃取液是否诱导BMSCs定向迁移,以及阻断CX3CR1对BMSCs向缺血脑组织萃取液迁移的影响.结果 获得了纯化的BMSCs;BMSCs均一地表达CD44、CD90和CD71,在重组fractalkine浓度为200 ng/ml和500 ng/ml实现迁移的BMSCs与对照组相比有显著差异（P＜0.05）;以CX3CR1抗体阻断BMSCs向缺血脑组织迁移组与正常对照组比较有显著差异（P＜0.05）.结论 fractalkine及其特异性受体CX3CR1参与介导BMSCs向缺血脑组织的定向迁移.