SARS冠状病毒的研究现状

0引言 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome，严重急性呼吸综合征)目前已在全世界33个国家和地区广泛流行．由于其病原体扩增较快，又是新发现的传染病，目前世界上还来不及制备疫苗，也尚未找到特效的治疗药物，迄今为止，临床暂时试用的方法，如：①使用抗病毒药；②使用糖皮质激素；③使用持续气道正压通气；④使用IgM；⑤使用中医药等，疗效均不显。     

SARS相关冠状病毒的研究进展

冠状病毒和与SARS相关的冠状病毒：第一个冠状病毒是1937年从鸡身上分离出来的。由于在电子显微镜下其形态呈现日冕状或皇冠状而得名。此后至少有15种不同的冠状病毒被发现。根据目前所知，冠状病毒科只感染脊椎动物，与人和动物许多疾病相关。引起人类疾病的冠状病毒主要表现为呼吸道和消化道感染。冠状病毒感染非常普遍，虽然人冠状病毒感染可解释30％的普通感冒，但它们极少导致下呼吸道疾病，也从未造成SARS这么严重的后果。     

SARS冠状病毒全基因组突变初步分析

截至2003年5月12日，世界各地向GenBank已经提交了12条SARS冠状病毒的全基因组序列(新加坡5条、香港3条，北京1条，美国1条，加拿大1条，台湾1条)。我们收集了相关的数据，并对这12条序列(表1)做了比对分析，试图考察SARS冠状病毒自SARS流行以来有无大规模的转型，是否出现比较有意义的突变。     

SARS冠状病毒可能编码蛋白质的三级结构预测

在本研究组稍早的工作中[1],我们已经基于基因组序列和蛋白质初步分析,完成了SARS冠状病毒(SARS Coronavirus, SARS CoV)所有推测蛋白质(putative protein)的二级结构分析 .     

2株SARS相关冠状病毒主要结构蛋白基因的多态性分析

目的:分析2株SARS相关冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus,SARS-CoV)HK21378和BJi04的主要结构蛋白基因序列的多态性以及蛋白质结构变化与功能的关系.方法:提取组织培养物中的SARS-CoV基因组RNA,对RT-PCR产物进行测序;以GZ02为参照序列,对蛋白质编码序列进行基因多态性分析和蛋白质结构与功能关系分析.结果:①与SARS-CoV GZ02株相比较,HK21378和BJi04主要结构蛋白编码序列共有14个变异位点,其中9个变异位点为两者共有,3个变异位点见于HK21378,2个变异位点见于BJ104;与GenBank数据库已发表的103株SARS-CoV基因组数据比较,变异位点22901(T→G)为BJ104特有,未见于已发表的其他SARS-CoV基因组中;在14个多态位点中,有5个多态位点为同义突变,其余9个为非同义突变.②14个变异位点中有11个变异发生在S蛋白编码区,其碱基变异频率为3.7/kb;2个见于M蛋白编码区,其碱基变异频率为3.0/kb;1个见于N蛋白编码区,碱基变异频率为0.8/kb;而E蛋白编码区未见变异位点.结论:SARS-CoV的主要结构蛋白编码区容易发生变异,尤其是膜表面S蛋白和M蛋白编码区.     

SARS 冠状病毒全基因组突变初步分析

截至 2 0 0 3年 5月 12日 ,世界各地向GenBank已经提交了 12条SARS冠状病毒的全基因组序列 (新加坡 5条、香港3条 ,北京 1条 ,美国 1条 ,加拿大 1条 ,台湾 1条 )。我们收集了相关的数据 ,并对这 12条序列 (表 1)做了比对分析 ,试图考察SARS冠状病毒自SARS流行以来有无大规模的转型 ,是否出现比较有意义的突变。表 1　SARS基因组序列Table 1　GenomesequenceofSARScoronavirusSequenceName AccessionNoPlaceSARScoronavirusTW 1AY2 914 5 1TaiwanSARScoronavirusCUHK W 1AY2 785 5 4HongKongSARScoronavirusisolateSI…     

SARS冠状病毒基因组、蛋白质与侵入宿主细胞过程的研究近况

世界卫生组织(WH0)在今年3月12日发出关于非典型肺炎(atypical pneumonia)的全球性警告之后，经过WH0的组织协调，于3月17日成立了一个由全球10个国家和地区11个顶级实验室组成的合作研究网络。中国的两个实验室(中国疾病预防控制中心病毒研究所和广东省疾病预防控制中心)于3月28日加入该研究网络。该网络启动     

冠状病毒及其基因表达

冠状病毒是一类仅感染人和动物的病毒 ,具有非常典型的形态特征。由于SARS(severeacuterespiratorysyndrome)今春的暴发及病原的鉴定 ,使得原本不太受重视的冠状病毒引起世人的极大关注[1 ,2 ] 。本文就冠状病毒的概况和基因表达情况作一简述。1　冠状病毒概况冠状病毒最先是 1937年从鸡身上分离出来的 ,以后相继从牛、猫、狗、猪、鼠等动物身上分离到该病毒[1 ] 。 196 5年 ,Tyrrell和Bynoe等用人胚气管培养方法 ,从普通感冒病人鼻洗液中分离出 1株病毒 ,命名为B814病毒。随后 ,Hamre等用人胚肾细胞分离到类似病毒 ,代表株命名为 2 2 9…     

SARS冠状病毒基因组初步分析

世界卫生组织(WHO)在今年3月12日发出关于非典型肺炎(atypica l pneumonia)的全球性警告 ,经过WHO的组织协调,3月17日成立了一个全球性的合作研究网络,由10个国家和地区的11个顶级实验室组成[1].中国疾病预防控制中心病毒研究所和广东省疾病预防控制中心也于3月28日加入该研究网络[2].该网络启动后,取得了一系列的进展.香港大学最先于 3月22日宣布分离出了引起SARS的一种未知冠状病毒[3].     

SARS冠状病毒基因组进化与PCR检测引物的设计

目的：分析比较32株SARS冠状病毒基因组的同源性,研究SARS冠状病毒PCR检测引物对32株SARS冠状病毒的适用性。方法：运用互联网和生物信息学的方法、软件,分析32株SARS冠状病毒基因组之间的同源性,构建无根进化树,并对PCR检测引物进行了检索验证。结果：32株SARS冠状病毒的全基因组序列中共有488个位点的碱基发生突变,并且在所有32株SARS冠状病毒的基因组序列上,均存在PCR检测引物对应的序列片断。结论：所设计的SARS冠状病毒PCR检测引物在全部32株SARS冠状病毒的PCR检测分析中都是适用的。     

SARS冠状病毒PUMC01分离株的基因组序列分析

目的 对北京协和医院分离的SARS冠状病毒(SARS-CoV)PUMC01株的基因组序列进行变异及系统发育分析。方法 利用随机引物法构建SARS-CoV-PUMC01分离株的cDNA文库,随机挑选质粒克隆进行大规模测序,测序反应经过组装后获得全基因组序列(Genbank Accession No．,AY350750),对该序列与SARS-CoV的参考序列相比进行系统发育及变异分析。结果 与参考序列(SARS-CoV-Tor2及SARS-CoV-Urbani)相比较,在SARS-CoV-PUMC01上共发现10个变异位点;与其他的17株SARS-CoV进行系统发育分析后发现,18株SARS-CoV分为两类,两类之间及每一类的各株病毒间具有不同的分化时间。结论 了解不同地区SARS-CoV之间的系统发育关系,为系统了解不同SARS-CoV分离株之间的临床关系以及SARS-CoV的传播链提供了进化上的证据。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体在SARS尸检组织中的表达

目的观察SARS死者的尸检组织中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的存在与分布情况。方法应用免疫组化技术检测4例尸检标本肺、脾脏、淋巴结、脑、垂体、心、肝、肾、胰腺、气管、食道、胃肠道和骨髓等组织的SARS-CoV N蛋白。结果肺泡上皮、肺、脾、淋巴结内浸润的单核细胞/巨噬细胞、脑神经元、肝细胞、肾远曲小管上皮细胞、胰腺腺泡细胞、垂体嗜酸细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、肾上腺皮质细胞、气管及支气管浆液腺上皮细胞、食道粘膜鳞状上皮、胃肠道柱状上皮细胞及胃壁细胞、骨髓早幼粒细胞及小静脉内皮细胞等细胞质内SARS-CoV N蛋白单克隆抗体均为阳性。结论SARS-CoV可侵犯全身多种器官和组织。SARS-CoV N蛋白单克隆抗体在胃肠道、肾远曲小管及汗腺细胞内的阳性表达,对研究SARS-CoV传播途径具有重要意义。     

SARS病毒蛋白保守性分析

目的：寻找和确定SARS病毒中高保守的蛋白,以指导针对这些高保守蛋白为药物靶的药物分子设计。方法：采用比较基因组的方法和PSI-Blast搜索方法分别探讨SARS病毒不同蛋白在冠状病毒属内部及在正链RNA病毒内的保守情况。结果：确定了SARS非结构蛋白,特别是RdRp、Hel、nsP12、nsP13等蛋白在冠状病毒属内部表现很高的序列相似性,同时它们在正链RNA病毒范围内呈现不同程度的保守性。结论：主要参与病毒的复制、转录及后处理过程的非结构蛋白RdRp、Hel、nsP12、nsP13的高保守性,表明与病毒扩增相关的基因调控机制的保守是病毒进化的重要特征;同时这些非结构蛋白的高保守性及功能重要性表明它们更适合作为有效的药物靶分子。     

SARS冠状病毒主要蛋白酶构象运动性分析

SARS冠状病毒3CL蛋白酶的单体结构由3个结构域构成,其中第1、2个结构域紧密堆积成糜胰蛋白酶折叠类型,第3个结构域由5个α螺旋构成,较为独立.有实验证明3CL蛋白酶的α螺旋结构域的缺失会影响酶的催化活性.另外3CL蛋白酶还有可能具有RNA结合功能.因此研究α螺旋结构域的作用有助于认识SARS冠状病毒3CL蛋白酶的生物功能.我们对于SARS冠状病毒 3CL蛋白酶的单体分子进行了分子动力学模拟,采取全原子模型,加入溶剂水分子,进行了3 次1 ns的模拟.同时我们还利用弹性网络模型对于SARS冠状病毒3CL蛋白酶进行了正则振动分析.分子动力学模拟及正则振动分析表明α螺旋结构域相对于糜胰蛋白酶结构部份有整体的大运动,在两个垂直的方向上有方向相反的振动模式(图1).原子热运动分析表明酶催化活性附近的两个表面环区有较大的构象运动性.     

重组SARS冠状病毒N蛋白纯化与鉴定

目的分析重组SARS-CoVN蛋白的表达,并予以纯化。方法SDS-PAGE分析N蛋白的表达,于自动蛋白层析系统上,用His·BindTM柱亲和层析纯化。结果重组表达的N蛋白存在于裂解细菌上清中,分子量大小约49000u,N蛋白经亲和层析获得纯化,纯化蛋白能与病人血清反应。结论表明自动层析获得了纯化良好抗原性的N蛋白。     

SARS冠状病毒E蛋白的表达与纯化

目的研究SARS冠状病毒E蛋白对SARS诊断和预防的价值，利用原核表达系统克隆和表达E蛋白并纯化。方法采用RT—PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因；经克隆和测序分析后，亚克隆至表达载体DGEX-4T-2，转化大肠杆菌BL21（DE3），PCR和双酶切鉴定；阳性菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE分析，进一步以SARS病人血清进行免疫印迹分析；大量诱导表达N蛋白，亲和层析予以纯化。结果RT—PCR扩增出E蛋白基因的特异片段，获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的SARS冠状病毒的E蛋白基因序列同源性为100％；E蛋白基因被亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，在BL21中获得表达，表达产物能被SARS病人血清识别。表达的E蛋白经亲和层析获得纯化。结论成功构建了SARS冠状病毒E蛋白的重组表达质粒，在大肠杆菌中表达的E蛋白的融合蛋白具免疫活性。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

SARS冠状病毒Orf3和Orf4的克隆和分析

目的:克隆SARS冠状病毒的Orf3和Orf4两个开放性读框,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析.方法:通过RT-PCR,从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段,利用TA克隆将PCR产物克隆入PUCm-T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析.结果:RT-PCR扩增出的特异产物与预期长度相符,序列分析表明,其核苷酸序列与已发表的SARS病毒的Orf3和Orf4同源性在99%以上.结论:成功克隆SARS冠状病毒Orf3和Orf4两个开放性读框,为表达及功能研究奠定了基础.     

SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的 原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法 用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E．coli BL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果 实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论 用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。