Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建

目的 为研究重组痘苗病毒通用载体,构建融合Zeocin和GFP双筛选标记质粒pCB-ZeoGFP.方法 质粒LeGo-G/Zeo含有Zeo-GFP融合基因片段,通过PCR反应、BamHI酶切后连接替换空白质粒pCB的筛选基因gpt,通过菌落PCR,酶切图谱分析及测序分析鉴定重组质粒,构建成功后将其与野生型痘苗病毒进行位点特异性同源重组,经Zeocin药物筛选2代后,用流式细胞仪观察重组痘苗病毒GFP表达.结果 经菌落PCR,1号、5号和10号菌落中扩增出426 bp 的目的条带,与预期的大小完全一致,经酶切分析和DNA测序进一步验证了重组质粒pCB-Zeo-GFP;该质粒与野生型痘苗病毒同源重组,得到了重组的痘苗病毒；Zeocin 筛选2代后,病毒上清感染细胞,流式细胞分析7.18％的细胞中有CFP的表达,而阴性对照仅有1.43％；Zeocin 药物筛选5代后,通过激光共聚焦可在80％以上的细胞中观察带GFP;提取的重组痘苗基因组DNA也扩增出预期大小目的条带.结论 含Zeocin和GFP双筛选标记的新型重组痘苗病毒不仅具有可观察性且具有药物抗性,非常容易进行筛选鉴定.     

TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的 TRPV1基因过表达逆转录病毒载体的构建和鉴定研究。方法 PCR法扩增TRPV1基因的编码序列,克隆到pBaBe-puro载体上。对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析。用磷酸钙法制备pBaBe-puro-TRPV1逆转录病毒,将其感染到U87-MG细胞,经嘌呤酶素筛选阳性克隆后用荧光定量PCR和Western blot法检测TRPV1表达。结果经DNA测序和酶切鉴定表明,pBaBe-puro-TRPV1表达载体构建成功。pBaBe-puroTRPV1逆转录病毒感染U87-MG细胞后,细胞中TRPV1表达量明显增高。结论成功构建了人TRPV1基因的pBaBe-puro-TRPV1表达载体。pBaBe-puro-TRPV1能有效上调TRPV1基因在U87-MG细胞中的表达,为应用其研究TRPV1在利多卡因致细胞损伤中的作用奠定了基础。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建

目的利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株。方法采用PCR方法合成GCLC基因全长,经Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株。采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSH)含量。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0×109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的m RNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P0.05)。结论成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株。     

人轮状病毒结构蛋白VP7基因毕赤酵母表达质粒的构建

[目的]构建人轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA. [方法]从VP7-pET32a质粒中PCR扩增轮状病毒VP7基因,EcoR I、Xba,I双酶切VP7基因产物和酵母表达载体pPICZαA,T4 DNA连接酶连接目的基因片段和pPICZαA,转化到大肠杆菌Top10中,Zeocin筛选转化子并进行PCR、酶切和测序鉴定. [结果]阳性克隆菌经酶切和PCR和测序鉴定,结果与预期相符,目的基因正确插入pPICZαA中. [结论]成功构建轮状病毒结构蛋白VP7基因重组酵母表达质粒VP7-pPICZαA,为轮状病毒结构蛋白VP7基因的酵母表达奠定了重要的实验基础.     

人SIK2重组质粒的构建和真核细胞转染

目的 构建人SIK2基因真核表达载体.方法 利用PCR扩增目的基因SIK2,PCR产物经纯化后与pC-MV-Tag 2B线性质粒进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂卡那抗性琼脂糖平板;菌落PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆后,抽提质粒,利用Lipofectamnie 2000TM试剂瞬转293T细胞,24 h后,Western Blot方法检测其在真核细胞内的表达.结果 成功构建pCMV Tag-2B-SIK2重组质粒,并在真核细胞内成功表达.结论 SIK2外源表达载体的构建成功,为进一步研究其功能奠定了实验基础.     

转录因子Bach2的构建及表达

目的构建高效表达人Bach2基因的慢病毒重组质粒,并探索其在免疫疾病中的机制。方法取健康人外周血分离单个核细胞并提取总RNA逆转录为c DNA,扩增Bach2基因CDS序列,插入p LVX-IRES-Zs Green1慢病毒质粒。磷酸钙共转染法包装慢病毒,感染人HEK293T细胞。空白质粒感染HEK293T细胞作为对照。免疫印迹分析空白质粒和过表达质粒HEK293T细胞中Bach2基因表达。结果 PCR结果显示,Bach2成功插进p LVX-IRES-Zs Green1质粒中,real-time PCR以及Western blot证实,Bach2基因成功在HEK293T细胞中高效表达。结论成功构建高效表达Bach2基因的慢病毒穿梭质粒,并成功在HEK293T细胞表达。     

小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白基因真核表达载体的构建及其生物活性的鉴定

目的克隆小鼠无纤毛柱状上皮细胞分泌蛋白(CCSP)基因并构建其真核表达重组体,鉴定重组CCSP的生物学活性。方法采用TRIzol法提取小鼠肺组织总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对CCSP基因进行扩增,Bam H I和XhoⅠ双酶切扩增产物与真核表达载体p CDNA3.1(+),酶切产物连接并转化入感受态细胞Trans 5α,阳性重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过DNAfectin 2100 DNA转染试剂将重组质粒转染人胚肾(HEK293T)细胞,采用Western blot法检测表达产物。脂多糖分别刺激转染有p CDNA3.1(+)-m CCSP和p CDNA3.1(+)质粒DNA的HEK 293T细胞,利用磷脂酶A2的水解作用,以掺入大肠杆菌膜的[3H]标记的油酸为酶解底物,检测HEK 293T细胞内PLA2的活力。结果聚合酶链反应结果显示,从小鼠肺组织中扩增出约290 bp的片段。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒p CDNA3.1(+)-m CCSP构建成功且序列正确。Western blot结果显示,在转染p CDNA3.1(+)-m CCSP的HEK293T细胞中有CCSP蛋白的表达,蛋白质分子量约为10 k Da,而转染空质粒组未见表达。CCSP蛋白可以显著降低脂多糖诱导的HEK 293T细胞内PLA2的活力。结论成功构建了真核表达重组体p CDNA3.1(+)-m CCSP,且重组蛋白CCSP具有生物学活性,为进一步研究其功能奠定了基础。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2．为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA，以其为模板采用聚合酶链反应（PCR）法获取SAP2基因，将真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC和SAP2基因行EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶纯化，连接酶切产物，转化TOP10感受态细菌，筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同，并定向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）myc-HisC，电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3．1／SAP2重组质粒，该质粒能直接激活抗原提呈细胞，可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化

目的 克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性气道疾病的治疗作用奠定基础.方法 制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列(GenBank登录号:NM_013051)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli DH5α),阳性菌落经PCR和双酶切鉴定并测序.将重组质粒pET30a(+)-rCC16转化至E coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化.分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析并鉴定重组蛋白.结果 RT-PCR扩增产物约为290 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-rCC16构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 kDa的可溶性重组蛋白.Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,且能被山羊抗CC16抗体识别.结论 成功构建基因重组体pET30a(+)-rCC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白.     

人Notch受体胞内区基因N2ICD克隆及真核表达

目的 构建真核重组质粒N2ICD/pCMV-Tag4并转染HEK 293T细胞进行表达。方法 根据GenBank上Notch2的NICD序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从人宫颈癌细胞Hela细胞扩增人Notch2受体胞内区基因(N2ICD),酶切和测序鉴定后克隆至携带FLAG标签的真核表达载体pCMV-Tag4并进行瞬时和稳定转染HEK 293T细胞,荧光定量PCR(Q-PCR)和蛋白印迹(WB)检测目的蛋白的表达。结果 通过RT-PCR克隆获得人N2ICD基因并成功构建重组质粒N2ICD/pCMV-Tag4,目的蛋白N2ICD在HEK 293T细胞中获得表达。结论 成功构建稳定表达N2ICD的HEK 293T细胞株,为进一步探讨Notch2受体的功能奠定基础。     

表达肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒重组载体的构建

目的构建携带肺孢子菌p55多表位串联基因(p55TAG)的腺病毒重组载体,鉴定其在真核细胞HEK293中的表达情况。方法将人工合成的p55TAG目的片段与腺病毒载体(p HBAd-EF1-MCS-GFP)连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,经Amp抗性筛选得到重组载体p HBAd-p55TAG,将重组载体与腺病毒骨架质粒p BHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)验证转染结果,收集包装成功的病毒进行PCR扩增,扩增产物测序验证,用Western blot检测病毒在感染细胞后的目的蛋白表达情况。结果构建的p HBAd-p55TAG腺病毒重组载体转染HEK293细胞后检测到绿色荧光蛋白表达,包装好的病毒PCR扩增产物测序结果与原始序列一致,Western blot检测结果显示在60 k Da处有成功表达目的条带。结论本研究成功构建了表达肺孢子菌p55多表位串联基因的腺病毒重组载体,并验证其能在真核细胞中有效表达。构建的载体为进一步研究抗肺孢子菌感染疫苗奠定了基础。     

pEGFP-smac重组质粒的构建及在sw-480结肠癌细胞中的表达

目的构建一种含凋亡激活因子(second mitochondrial activator of caspase,SMAC)的重组质粒pEGFP-smac,观察其在结肠癌细胞中的表达,为探讨SMAC在结肠癌中抗凋亡作用的分子机制,为结肠癌的治疗提供理论依据。方法从sw-480结肠癌细胞中提取总RNA,以RT-PCR技术扩增SMAC全长基因后,与绿色荧光表达质粒pEGFP-N1构建pEGFP-smac重组质粒,转染sw-480细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光的表达,并对表达产物进行Western blot鉴定。结果 RT-PCR产物及含有重组质粒的菌落PCR产物经琼脂糖电泳,在预期位置(720 bp)处均有目的条带出现;重组质粒成功转染sw-480细胞,在荧光显微镜下强绿色荧光蛋白表达,Western blot鉴定结果显示pEGFP-smac上的SMAC基因在sw-480细胞中正确表达。结论成功构建pEGFP-smac重组质粒,可为进一步研究SMAC蛋白的功能提供重要的分子工具。     

周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立

摘要:目的　将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Bm-CPI）基因的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞（Hela细胞）获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法　将成功构建的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果　重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞后,d 14可见G418抗性细胞株开始形成。G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带。结论　实验证实pcDNA3.1（+）-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。     

北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.     

重组CKB真核表达载体的构建及其稳定转染NCI—H520细胞系的建立

目的构建pEGFP—N1－CKB真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞NCI—H520中,建立稳定转染的NCI—H520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以人CKBcDNA文库为模板,用PCR扩增人CKBcDNA的编码区,并将扩增的cDNA片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系NCI—H520,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用Westernblot检测转染前后该细胞株CKB基因的表达。结果pEGFP—N1－CKB经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经Westernblot检测,重组质粒转染株中CKB基因的表达水平明显高于对照组,证实CKB基因已稳定转染到NCI-H520细胞中并得到表达。结论成功构建了pEGFP—N1－CKB真核表达质粒,建立了稳定表达CKB的NCI-H520细胞系,为进一步研究CKB的生物学功能奠定了基础。     

人肾系膜细胞Smad-7稳定表达细胞系的筛选及其拮抗TGF-β1作用

目的构建Smad-7基因真核表达载体并筛选获得其稳定表达细胞系，观察Smad-7拮抗TGF-β1对人肾系膜细胞（HMC）的影响。方法用PCR方法从胎肝cDNA文库扩增Smad-7编码序列，将其构入真核表达载体pcDNA3．1／myc-his-B（-），酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染HMC细胞，G418筛选获得Smad-7的稳定表达细胞克隆，运用Western Blotting验证目的基因表达。运用MTT和流式细胞术检测稳定表达Smad-7对TGF-β1诱导的拮抗作用。结果酶切和测序证实目的基因被克隆入表达载体，Western Blotting证实目的基因成功表达，获得稳定表达Smad-7的细胞克隆；Smad-7过表达可明显缓解TGF-β1对HMC细胞的生长抑制、细胞周期G1阻滞作用，并可降低TGF-β1对HMC细胞的凋亡诱导作用。结论成功构建Smad-7真核表达载体并获得其稳定表达细胞克隆，过表达Smad-7可拮抗TGF-β1对HMC细胞的影响。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A核酸疫苗的构建

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A (HspA)亚单位核酸疫苗,为进一步研制Hp核酸多价疫苗提供技术平台.方法 以PMD-HspA为模板,扩增、纯化Hp hspA基因,插入到真核表达载体PcDNA3中,转化大肠埃希菌DH5a,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,得到重组核酸疫苗pcDNA3-HspA,用特异性PCR方法和小提质粒酶切电泳鉴定重组质粒,同时将pcDNA3-HspA进行测序,进一步确定是否构建成功及鉴定构建过程中是否发生基因突变.结果 PCR鉴定结果显示,扩增产物为0.36 kb的目的基因;酶切鉴定结果显示,得到5.45 kb克隆载体片段和0.36 kb的目的基因片段;重组质粒pcDNA3-HspA测序,得到基因全长357 bp目的基因片段,与克隆质粒测序图比较,无基因变异.结论 成功构建了Hp单价核酸疫苗pcDNA3-HspA,为研制Hp核酸多价疫苗奠定基础.