乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗的构建与鉴定

目的采用基因重组技术,将乙肝病毒4段小基因与协同刺激分子CD80基因嵌合,构建成嵌合乙肝小基因DNA疫苗。方法①根据文献选择和设计HBV的一段pres2、三段core表位编码小基因,以人工合成DNA片段P1~P10,通过退火、连接成为含约170bp的嵌合基因,用HindⅢ酶切;②提取和纯化pcDNA3-CD80,用HindⅢ酶切和去磷酸化;③将酶切小基因定向插入pcDNA3-CD80载体的HindⅢ位点之间,构建成pcHBV-CD80小基因质粒;④pcHBV-CD80转入E.coli JM109扩增、提取质粒,测序鉴定。结果①各DNA小片段经退火、连接,成功嵌合为一大小约170bp之目的基因;②pcDNA3-CD80提取、酶切均成功;③170bp之目的基因定向克隆到载体上,构建了重组质粒pcHBV-CD80,经测序鉴定均构建正确。结论乙肝病毒小基因与协同刺激分子CD80嵌合DNA疫苗构建成功。     

人巨细胞病毒150kd磷蛋白主要DNA片段的克隆及其限制性酶切位点分析

作者以质粒pUC19为载体,从重组cos质粒pCM1015中分离编码人巨细胞病毒(HCMV)150kd磷蛋白(pp150)主要DNA片段—EcoRI—Y片段,构建了该片段的克隆,依据插入方向不同分别为重组质粒pHCY1和pHCY2,经限制性内切酶酶切分析及Southern印迹杂交鉴定,克隆构建成功,插入片段大小无改变。采用微机系统分析pp150抗原决定簇DNA编码区段的限制性酶切位点,表明该编码区段具有76种限制性内切酶位点,酶切片段大小在4bp～2667bp之间。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立HBV复制状态模型。方法 体外连接HBV（ayw亚型）DNA获得6.4kb的双拷贝DNA片段。然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点。结果 通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒。结论 成功构建了HBV全基因重组真核表达质粒。     

丙型肝炎病毒C，E2，NS3区基因嵌合重组载体的构建

目的：构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。方法：设计合成3对寡核苷酸引物，用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCV C区、E2和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp)，分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌XL1－Blue，分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致，证实符合表达框架。结论成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3.     

介导人血红素加氧酶-1基因的重组腺相关病毒载体的构建

目的:构建含人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定。方法:利用基因重组技术,采用限制性内切酶HindⅢ从质粒XM-6/hHO-1中将目的基因hHO-1基因片段切出,克隆到质粒PAAV-MCS的HindⅢ位点中,构建重组质粒pAAV-hHO-1,采用限制性内切酶酶切,PCR和DNA测序鉴定。结果:PCR扩增出1 317 bp大小的片段,酶切鉴定证实插入位点及方向与预期的完全一致;测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致。结论:成功构建了含hHO-1基因的重组腺相关病毒载体,为缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的：构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因——迟发超敏反应抗原基因(delayed-type hypersen-tivity antigen 1,DNA)与小鼠共刺激分子B7—1的嵌合重组质粒。方法：设计合成两对寡核苷酸引物，用PCR法分别从pUCmB7—ITM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3-DHA1中特异扩增出编码B7—1和DHA1的基因片段(921bp和984bp)，分别用HindⅢ，EcoRⅠ，XbaⅠ酶切后，逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌DH-5α，分别用上述内切酶酶切及DNA到序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致，证实符合表达框架。结论：该研究成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3-B7-1-DHA1，为进一步研究新型隐球菌DNA免疫奠定了基础。     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建

基因，构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）扩增hIL 26基因；目的片段与pMD18 T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆。用SalⅠ和EcoRⅠ将目的片段切下，插入pIRES2 EGFP的相应位点，构建表达载体pIRES2 EGFP/hIL 26并进行酶切鉴定。将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中。结果：重组克隆载体pMD18 T/hIL 26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL 26基因序列完全一致；pIRES2 EGFP/hIL 26经酶切鉴定与预期结果一致；荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Western blotting 鉴定证明hIL 26基因得到了有效表达。结论：成功构建了hIL 26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。     

抑制肿瘤细胞皮层肌动蛋白装配功能的重组质粒的构建和鉴定

目的:构建一个具有拮抗肌动蛋白装配功能的重组质粒EGFP-N2/CA,为观察该基因片段对于肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响。方法:通过PCR扩增获得目的片段N-WASP-CA,通过双酶切和连接将其插入荧光表达载体EGFP-N2获得重组质粒。结果:PCR扩增后获得和预期一致的特异性DNA片段,通过PCR、双酶切和测序证实该片段已正确插入表达载体。结论:成功获得重组质粒EGFP-N2/CA。     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

GW112基因逆转录病毒载体的构建及在胃癌SGC-7901细胞的表达研究

目的 构建人GW112基因的逆转录病毒载体,并通过病毒介导其在人胃癌SGC-7901细胞的稳定表达.方法 采用DNA 重组技术构建并鉴定重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-GW112;以脂质体PT67细胞包装病毒,经病毒感染的SGC-7901细胞通过G418筛选及荧光定量 PCR 鉴定,建立GW112稳定过表达SGC-7901细胞株.结果 成功构建了pLEGFP-N1-GW112逆转录病毒表达载体,经病毒包装的重组转录病毒成功感染SGC-7901细胞,Real-Time PCR结果显示实验组中GW112基因是对照组细胞中的4.2倍.结论 逆转录病毒介导的GW112基因在胃癌SGC-7901细胞获得了稳定过表达,为进一步研究GW112在胃癌中的功能奠定了良好基础.     

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中，脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig-IRES2-EGFP转染PA317细胞，在G418选择压力下，通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA317细胞克隆，MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体，生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。结论 IRES序列调控CTLA4Ig与EGFP双基因在细胞中同时独立表达。     

HIV-1 gag-gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的 :构建含有 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法 :利用基因重组技术将 B亚型中国株 HIV- 1的结构基因 gag与 gp12 0嵌合后再通过大肠杆菌 /杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果 :酶切电泳显示基因重组正确 ,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论 :含有B亚型 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功 ,为进一步研究Gag- gp12 0嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

HPV16-E7H2P融合钙网蛋白基因重组腺病毒载体疫苗的构建与免疫学鉴定

目的 构建表达钙网蛋白(CRT)与乳头瘤病毒16型E7基因H2P突变型(HPV16-E7H2P)融合蛋白重组腺病毒载体(Ad-CRT/HPV16-E7 H2P),为研发新型乳头瘤病毒治疗性疫苗奠定基础.方法 首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HPV16-E7H2P基因融合重组的pJW4303表达载体,将目的基因加上特定的CACC接头后克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆.经过入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应获得表达克隆Ad-CRT/HPV16-E7 H2P.表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到重组腺病毒.结果 构建的Ad-CRT/HPV16-E7H2P经PCR和测序鉴定构建正确;转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.95 × 1011 pfu/mL,该重组病毒载体能正确表达CRT/HPV16-E7H2P融合蛋白.结论 成功构建了Ad-CRT/HPV16-E7H2P,为HPV慢性感染以及宫颈癌的防治奠定了基础     

CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA—Lentivector载体连接得到LV—CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV—CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×10^8ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

肝癌组织特异性PafpIRES2-EGFP表达载体的构建及表达

目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体，观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子（ECMV），利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列，将其克隆入pIRES2-EGFP载体，进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞，荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段，纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带，均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接，菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆，质粒经NdeⅠ＋NheIⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带，DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP，该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。     

Constructing retroviral vector carrying green fluorescent protein （GFP） and investigating the expression of GFP in primary rat myoblast

INTRODUCTION Green fluorescent protein ( G FP ) absorbs blue or ultraviolet light , and gives out bright green fluorescence.G FP has been expressed in a variety of species , and extentively used in tissue engineering [1]. M yoblast could fuse w ith host m yofibers , transform - ing the target gene into the host , and expressing corressponding gene product.M yoblast is com patible w ith collagen and could be induced to differentiate by collagen. N ow m yoblast has been used in studies on…     

人CD160基因转染细胞株的建立及其生物学特性的研究

目的克隆人CD160基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP重组质粒载体,获得稳定表达CD160分子的基因转染细胞。方法从人外周血cDNA文库中扩增CD160的基因,另以VSIG4基因的cDNA为模板扩增跨膜区基因片段,将它们一并装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染L929细胞,用G418筛选出能稳定表达CD160分子的L929细胞株。结果成功克隆出了CD160的基因,构建了pIRES2-EGFP/CD160TMV质粒载体,并建立了稳定表达人CD160分子的L929转基因细胞株,该转基因细胞能结合L929/HVEM转基因细胞,证明其功能性。结论构建了含人CD160基因的重组pIRES2-EGFP质粒载体和建立稳定表达人CD160分子的细胞株,为CD160分子的后续研究奠定基础。