一株埃可病毒16型510/YN/CHN/2010的全基因组分析北大核心CSCD

目的分析一株埃可病毒16型(Echovirus 16,E16)云南分离株510/YN/CHN/2010全基因组序列及其遗传特性。方法设计针对E16的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒目的基因并测序,利用BioEdit 7.2.3、MEGA 7.0和Simplot 3.5.1软件分析其全基因组。结果E16510/YN/CHN/2010全基因组核苷酸序列全长7432 nt,是编码含2196个氨基酸的多聚蛋白。其全VP1和全基因组与原型株Harrington的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.68%、49.33%和81.26%、97.26%。与其他埃可病毒原型株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为75.72%~88.44%和83.01%~87.65%。系统进化分析将E16分为3个基因型,分离株510/YN/CHN/2010和其他中国分离株均属于B基因型。重组分析显示,510/YN/CHN/2010株可能在非结构编码区的P2段重组。结论510/YN/CHN/2010分离株为E16 B基因型,可能为重组株。     

2010年福建省肠道病毒71型分离株的基因型特征研究

摘 要:目的 全面研究和了解肠道病毒71型在福建省的遗传背景,分析和探讨肠道病毒71型在我省的基因型地理分布特征及传播特征。方法 对2010年福建省9个设区市的 50株EV71分离株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 2010年福建省50株EV71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891个bp,核苷酸及氨基酸序列同源性比较,50株EV71型分离株之间的VP1区核苷酸序列同源性为95.4%-100%,编码蛋白氨基酸序列同源性为97.3%-100%,与08年阜阳流行株Fuyang17.08-2同源性最高,核苷酸序列同源性为97.1%-99.3%,氨基酸序列同源性为98.7%-100%;VP1区基因遗传进化分析,与Fuyang17.08-2株进化关系较为接近,同属于C4a基因亚型。结论 2010年福建省50株EV71型分离株均属于C4a基因亚型,未产生明显的抗原漂移及变异;福建省及各个地市均分布亲缘关系较近的C4a基因亚型的EV71多传播链病毒,应加强长期动态地监测和分析。关键词:肠道病毒71型;VP1区;基因型特征;     

福建省肠道病毒71型分离株（2010FJLY008）全基因组核苷酸序列分析

目的了解肠道病毒71型在福建省的遗传背景,追踪EV71流行过程中可能发生的变异。方法对2010年福建1例手足口病患儿标本中分离到的1株肠道病毒71型分离株（2010FJLY008）进行全基因组核苷酸序列测定,并对基因组序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果2010FJLY008株全长7 403bp,核苷酸及编码氨基酸序列同源性比较,均与08年阜阳流行株Fuyang17.08 2同源性最高,整个基因组核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为99.5%;全长基因组核苷酸序列遗传进化分析及VP1区基因遗传进化分析,与Fuyang17.08 2株进化关系较为接近,同属于C4a基因亚型。结论2010年福建省EV71型病毒流行株（2010FJLY008）在病毒基因组结构、基因组核苷酸同源性比较、编码氨基酸同源性比较、全长基因组核苷酸序列遗传进化分析及VP1区基因遗传进化分析等方面,均与2008年阜阳流行株（Fuyang17.08 2）关系密切,未产生明显的抗原漂移及变异。     

腺病毒41型感染致儿童腹泻一例临床表现及病毒基因组学特征分析

目的针对消化道疑似感染病例,采用高通量测序技术筛查病原体,并测定其全基因组序列,阐明其基因组及进化特征。方法通过对原因不明腹泻患儿的粪便进行病原体高通量基因测序,然后拼接其全基因组序列,采用最大似然法(选择bootstrap为1000)绘制主要抗原蛋白六邻体(hexon)、五邻体(penton)和纤维突蛋白(fiber)的进化树,分析进化特征;运用Recombination Detection Program version 4(RDP4)软件进行序列重组分析;使用软件CLC Genomics Workbench 9.0分析突变位点。结果患儿临床表现主要为发热、呕吐、腹泻伴抽搐,通过对腹泻患儿的粪便样品高通量测序,使用本实验室高通量测序数据分析程序检出41型腺病毒(HAdV-41)。进一步测序和拼接获得该病毒全基因组序列,其基因组全长34 138bp。序列比对显示该病毒核苷酸序列与已报道序列的最高同源性为99%(Human adenovirus 41isolate NIVD103),属于腺病毒F亚属。对该病毒六邻体、五邻体和纤维突蛋白进行进化分析,其六邻体与HAdV-41isolate NIVD103,HAdV-41isolate SH/2015/D16亲缘关系较近,五邻体与HAdV-41isolate NIVD103,HAdV-41isolate SH/2015/D16,HAdV41isolate SH/2015/D240,HAdV-41isolate SH/2015/D381亲缘关系较近,纤维突蛋白与五邻体相似;对全基因组序列进行重组分析,未发现明显的重组迹象,但突变分析显示引起此例腹泻的病毒株基因组有多处突变。结论从一例腹泻患儿粪便中检出的病原体为新的41型腺病毒,该病毒基因组与以往发现的41型腺病毒有较大差异,其流行态势、致病性及免疫原性值得关注。     

云南中缅边境登革1型病毒全基因组序列特征研究

目的阐明云南省中缅边境地区2013-2015年14株登革1型病毒(DENV-1)全基因组序列特征。方法采用C6/36细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-1的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸和推导氨基酸序列同源性及系统进化分析。结果从登革热患者血清中分离到14株DENV-1,其中瑞丽市9株,临沧市3株,昆明市2株。经RT-PCR和序列测定,获得这14株DENV-1的全基因组序列(10 735nt),其开放读码框(95-10 271)编码3 392个氨基酸。系统进化和同源性分析表明,13株为基因I型(G-I),其中瑞丽和临沧本地病例7株,缅甸输入性病例6株;1株为G-III(昆明的印度输入性病例)。云南13株G-I可分为2个进化群,但均与缅甸、泰国等东南亚流行株具有较近的亲缘关系。云南13株G-I的E基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.02%-100%和98.78%-100%,它们与6株东南亚G-I参考株的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.53%-99.53%和97.33%-100%,与DENV-1原型株US_Hawaii核苷酸和氨基酸同源性分别为93.76%-94.45%和95.86%-96.91%。所有云南株和东南亚参考株与US_Hawaii株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点分别存在44和150个位点差异。结论云南中缅边境地区2013-2015年流行的DENV-1均为G-I,并具有基因多样性特点但均为来自缅甸的多个传播来源。     

柯萨奇病毒A组4型分离株全基因序列分析

目的分析1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株的全基因组序列和系统进化特征。方法使用细胞培养法对肠道病毒阳性标本中的病毒进行分离。提取病毒RNA,通过RT-PCR法分段扩增全基因组,经测序、比对和组装后获得CV-A4分离株的全基因组序列。利用MEGA7.0软件分别基于全长VP1序列和全基因组序列构建系统发育树;使用Geneious Prime 2020.1.2软件对全基因组及编码区各区段的核苷酸和氨基酸序列同源性进行分析,并对编码区氨基酸变异情况进行比较分析。结果从人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma, RD)细胞上分离到1株CV-A4分离株,命名为R09220/YN/CHN/2009。基于全长VP1序列的系统进化分析显示,该分离株属于C2基因亚型。在全基因组核苷酸序列上与其同源性最高的是CV-A4毒株CVA4/SZ/CHN/09(核苷酸为95.4%,氨基酸为98.7%)。与C2基因亚型内16株CV-A4代表株的全序列核苷酸相似性为88.4%～95.4%,氨基酸序列相似性为97.5%～98.7%。通过比较C2基因亚型内的23株CV-A4分离株的全基因组氨基酸序列,R09220/YN/CHN/2009共存在23个氨基酸变异位点,其中10个为其独有的变异位点。结论 R09220/YN/CHN/2009为肠道病毒CV-A4,属于C2基因亚型,该亚型在中国大陆流行的CV-A4病毒中占据优势地位。     

游泳池水引起的聚集性感染人腺病毒基因特征分析北大核心CSCD

目的了解淮安市一游泳池聚集性感染人腺病毒的hexon基因特征。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法对12例游泳后出现呼吸道感染患儿咽拭子标本和2份游泳池水样进行呼吸道多病原体的快速筛查,对核酸阳性的标本进行hexon基因的部分序列扩增、测序并构建系统发生树,分析hexon基因特征及人腺病毒遗传多样性确定腺病毒的型别。结果 12例患儿中有9份咽拭子标本和1份儿童池游泳水样扩增出人腺病毒hexon基因片段,测序分析该毒株(淮安株)与我国GZ01株、日本J1007、美国株(USA27440、USA 5497、USA NHR3)核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为99.9%。系统进化树分析显示,淮安株属于人腺病毒E亚属4基因型的进化谱系枝。结论该起聚集性呼吸道感染疫情可能由E亚属4基因型人腺病毒污染游泳池水引起。     

2017年南京市2株肠道病毒71型分离株全基因组序列测定分析

目的 对2017年南京市2株肠道病毒71型分离株进行全基因组序列测定,分析其进化及遗传变异特征,为手足口病疫情的监控与防治提供依据。方法 通过对临床检测EV71阳性的标本进行病毒分离,设计8对特异性引物对病毒全基因组进行PCR分段扩增,经序列测定及拼接获得EV71基因组序列,将其与其他代表毒株序列分别进行核苷酸和氨基酸同源性比对,并进行遗传进化分析。结果 基因组核苷酸同源性分析显示,2株分离株的同源性为94.0%。以EV71 NJ2017iso2作为参照,与2008年安徽流行株Fuyang 17.08-02的同源性最高(96.9%),而与原型株BrCr的同源性较低(79.8%)。同时基于VP1基因和全基因组序列构建的进化树均可以看出,2株分离株与C4亚型代表株聚为一簇,与国内各地既往的C4流行毒株相比,未发生大的变异。结论 2株EV71分离株均属于C4a型,虽病毒核苷酸序列之间差异显著,但大多为无明显的突变,其相应的氨基酸序列的遗传变化相对稳定。     

游泳池水引起的聚集性感染人腺病毒基因特征分析

目的了解淮安市一游泳池聚集性感染人腺病毒的hexon基因特征。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法对12例游泳后出现呼吸道感染患儿咽拭子标本和2份游泳池水样进行呼吸道多病原体的快速筛查,对核酸阳性的标本进行hexon基因的部分序列扩增、测序并构建系统发生树,分析hexon基因特征及人腺病毒遗传多样性确定腺病毒的型别。结果 12例患儿中有9份咽拭子标本和1份儿童池游泳水样扩增出人腺病毒hexon基因片段,测序分析该毒株(淮安株)与我国GZ01株、日本J1007、美国株(USA27440、USA 5497、USA NHR3)核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性均为99.9%。系统进化树分析显示,淮安株属于人腺病毒E亚属4基因型的进化谱系枝。结论该起聚集性呼吸道感染疫情可能由E亚属4基因型人腺病毒污染游泳池水引起。     

2019年云南省埃可病毒18型分离株的全基因组分析

目的对2019年云南省埃可病毒18型(E-18)的分离株K88R3-19进行全基因组序列测定及分析,了解其进化和变异特性。方法利用RD、Vero和KMB17细胞分离病毒,提取病毒RNA,RT-PCR扩增全基因,并测序拼接获得全基因组序列。利用Mega 5.05、Geneious Basic 5.4.1和SimPlot 3.5.1等软件分析全基因组序列。结果 K88R3-19株全基因组序列长度为7 422 bp,编码含2 190个氨基酸的多聚蛋白。K88R3-19与E18/LJ/0601/2019全基因组核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为97.6%和99.2%;与其他E-18毒株的核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为79.7%～86.1%和95.8%～97.7%;与其他E18毒株的各区段核苷酸一致性和氨基酸同源性分别为72.7%～98.5%和91.9%～100%,其中与中国株VP1-VP4区段核苷酸的一致性为89.8%～98.7%。基于E18全长VP1序列的种系进化分析可将E18分为1-6个基因型,其中5基因型可再分为5-1～5-3 3个基因亚型。中国E-18流行株主要聚集在5-3基因亚型。K88R3-19株较其他E-18株在VP1氨基酸序列上有2个独特突变:第2和28位点分别由D→V和V→A。结论 K88R3-19分离株为5-3基因亚型,为2019年中国大陆流行株。     

手足口病病例及其密切接触者病原检测与基因特征分析

目的了解广东省手足口病病例及其密切接触者病原体基因型,为科学防控手足口病提供依据。方法采集手足口病病例及其密切接触者的粪便标本,采用荧光定量PCR检测病原体基因,采用RDa细胞进行病毒分离,对毒株进行VP1区全序列分析。结果EVT1或CA16感染病例密切接触者均分别检出EVT1或CA16,阳性率分别为25．64％和38．03％;EV71毒株与C4亚型的C4a群同源性最高（98．50～98．7％）;5株CA16毒株与B1亚型的B1b群同源性最高（94．9％～97．1％）;16株CA16毒株与B1亚型的B1a群同源性最高（97．4％～98．1％）;病例与其密切接触者的EV71或CA16毒株核苷酸同源性分别为99．9％～100．0％和99．8％～100．0％。结论2010年广东省手足口病病原体EV71属C4亚型C4a群;CA16属B1亚型,包括Bla和B1b两个群;病例与其密切接触者病毒分离株的VP1区核苷酸高度同源,但存在变异现象。     

新疆北疆地区猪Torque teno病毒的PCR检测和序列分析

目的为了解新疆北疆地区猪群中Torque teno virus（TTV）感染流行情况。方法以TTV非编码区保守序列设计引物,采用PCR方法对猪源TTV进行检测,挑选部分阳性样品进行序列分析。结果共检测了该地区109份猪血样,检测结果表明,TTV1的感染率为56．88％（62／109）;TTV2的感染率为22．01％（24／109）;TTV1和TTV2混合感染率为18．34％（20／109）。同时,获得TTV1序列3个,TTV2序列4个,与参考序列相互比对,新疆北疆地区猪TTV1同源性为89．4％～95．2％;TTV2同源性为81．1％～99．2％。结论TTV在新疆北疆猪群中广泛存在,说明猪TTV是一个不容忽视的病原。     

一起由诺如病毒和肠道腺病毒混合感染引起的急性胃肠炎聚集性疫情的病原鉴定及进化分析

目的?对一起儿童急性胃肠炎聚集性疫情的病原进行鉴定、分型及进化分析。 方法?收集本次疫情患儿粪便标本，提取核酸，采用实时荧光PCR初步进行病原鉴定。通过反转录-聚合酶链反应对诺如病毒阳性标本的聚合酶区和衣壳VP1区部分基因序列进行扩增；通过PCR对腺病毒阳性标本的六邻体区部分基因序列进行扩增。对扩增产物进行测序，利用生物信息学软件及网站对病毒进行型别鉴定及进化分析。结果?共收集到3例患儿粪便标本，诺如病毒和腺病毒均为阳性。3株诺如病毒毒株均为诺如病毒GII.P12-GII.3型，其聚合酶区部分基因序列（206 bp）与2015─2018年我国GII.P12-GII.3型诺如病毒参考序列的同源性为98%，且位于同一进化树分支上；3株腺病毒毒株均为腺病毒F亚属41型（F41型），其六邻体区部分基因序列（420 bp）与2015─2019年我国F41型腺病毒参考序列的同源性为100%，且位于同一进化树分支上。 结论?本次儿童急性胃肠炎聚集性疫情是由GII.P12-GII.3型诺如病毒和F41型腺病毒混合感染引起，毒株序列分别与近年来我国流行的GII.P12-GII.3型诺如病毒及F41型腺病毒序列高度同源。本研究为混合感染急性胃肠炎疫情病原的快速鉴定及溯源分析提供了参考。     

家养野猪脑心肌炎病毒的分离、鉴定及全基因组序列分析

目的 分离家养野猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV),作全基因组序列测定及与相关物种同源性比较。方法 用改进的“细胞接种与RT-PCR方法相结合”技术,成功分离到国内首株家养野猪EMCV JZ1202株,并对其全基因组序列进行测定和分子特征分析。结果 分离毒的基因组全长为7 735 bp,与国内外不同动物源EMCV参考毒株的核苷酸同源性为81.2%～99.9%,与国内猪源EMCV分离毒的同源性高达99.4%以上。基于EMCV全基因组、ORF和VP1基因序列绘制的系统发育进化树显示,EMCV可分为 G1、G2和G3 3个群,JZ1202株与其他国内参考毒株同属于G1群。结论 结果证实,家养野猪可感染EMCV并引起发病,提醒作野生动物养殖要考虑EMCV的传播;EMCV存在较大的地域差异,在家养野猪和鼠之间可能存在着交叉感染;EMCV在感染家养野猪时可能发生个别氨基酸突变,以适应不同的猪种。     

Identification and Application of Neutralizing Epitopes of Human Adenovirus Type 55 Hexon Protein

Human adenovirus type 55 (HAdV55) is a newly identified re-emergent acute respiratory disease (ARD) pathogen with a proposed recombination of hexon gene between HAdV11 and HAdV14 strains. The identification of the neutralizing epitopes is important for the surveillance and vaccine development against HAdV55 infection. In this study, four type-specific epitope peptides of HAdV55 hexon protein, A55R1 (residues 138 to 152), A55R2 (residues 179 to 187), A55R4 (residues 247 to 259) and A55R7 (residues 429 to 443), were predicted by multiple sequence alignment and homology modeling methods, and then confirmed with synthetic peptides by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and neutralization tests (NT). Finally, the A55R2 was incorporated into human adenoviruses 3 (HAdV3) and a chimeric adenovirus rAd3A55R2 was successfully obtained. The chimeric rAd3A55R2 could induce neutralizing antibodies against both HAdV3 and HAdV55. This current study will contribute to the development of novel adenovirus vaccine candidate and adenovirus structural analysis.     

中国广西登革3型病毒分离株基因组序列特征分析

目的对我国广西登革3型病毒分离株桂登-1株(GD-1株)和桂登-11株(GD-11株)进行全基因组序列测定和分析,为了解其地理来源提供依据。方法根据GenBank提交的登革3型病毒基因序列设计9对引物,RT-PCR方法分段扩增GD-1和GD-11株基因序列,测序后进行拼接,得到其全基因组序列。结果两株病毒全长均为10 707nt,与国际参考株H87株核苷酸同源性为96.0%,氨基酸同源性为98.8%。GD-1株和GD-11株间仅有4个氨基酸差异,二者与H87株分别存在39和41个氨基酸差异。对3’UTR二级结构进行预测,二者与H87株存在较大差异。根据E蛋白基因序列对两株病毒进行进化分析,GD-1和GD-11均属于亚型Ⅱ,与分离自泰国的两毒株进化关系较近。结论 GD-1和GD-11均属于登革3型病毒亚型Ⅱ,二者可能是源自泰国的病原。     

2006-2008年安庆地区散发性戊型肝炎病毒血症检测与序列分析

目的了解安庆地区散发性戊型肝炎病毒血症的检出率与基因型的分布。方法收集2006-2008年间安庆市立医院血清戊肝IgM抗体阳性患者的血清(包括单份血清和系列血清)共145份,采用巢式RT-PCR方法检测HEVRNA,并扩增494-nt核苷酸片段,进行基因分型和同源性比对。结果在57名血清戊肝IgM抗体阳性的患者血清中,HEVRNA总检出率为47.37%;男性与女性分别为50.00%、40.00%,两者间无显著性差别(χ2=0.44,P=0.51)。其中,单份/首份血清的检出率最高(26/57,45.61%),第2份血清较低(8/35,22.86%),第3份及以后的血清几乎未检出阳性(1/53,1.89%)。所有35条HEV核苷酸序列均为基因Ⅳ型,与2007-2008年间获得的27株安庆地区猪基因Ⅳ型HEV共同比对后发现,人序列之间、猪序列之间、人与猪序列之间的同源性都约为86%;不同年份、不同宿主(人与猪)的HEV核苷酸序列间的同源性均在84%～88%之间。结论基因Ⅳ型HEV是安庆地区散发型戊肝的主要病毒株。当地人与猪HEV序列的同源性较高,提示HEV在人与猪之间存在相互传播的可能。     

猪源戊型肝炎病毒上海株全基因组序列分析

目的分析猪源戊型肝炎病毒(HEV)上海株swChinash与已知其它HEV基因型的差异和人源HEV的关系。方法设计22对PCR引物,分片段进行扩增,两末端采用快速扩增方法(RACE)扩增,扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序,用DNASTAR软件与53株人源和猪源HEV的基因组进行同源性分析,用Clustalx和Mega3.0软件绘制基因进化树。结果swChinash全序列除去poly(A)尾,由7235个核苷酸组成,ORF1～3分别编码1707,660,122个氨基酸。全基因序列与Ⅳ型的核苷酸同源性为83.4%～84.7%,与其他三型为73.3%～76.3%,其中与中国人源长春株最高,为84.7%。结论基于ORF1～3和全长基因组的进化树,猪源HEV上海株swChinash属于基因Ⅳ型,与其他Ⅳ型HEV亲缘关系较远,单独在一个进化分支上。     

2012年天津市手足口病病原与分子流行病学分析

目的对天津市2012年的手足口病病例进行病原学检测,并对引起HFMD流行的肠道EV71型（EV71）和柯萨奇A组16型（CVA16）病毒进行分子生物学特征分析。方法利用Real—time PCR检测HFMD疑似病例标本,用人横纹肌肉瘤（RD）细胞对Real—time PCR检测阳性的部分病例标本进行病毒分离。随机挑取9株EV71病毒分离株和8株CVA16病毒分离株,采用PCR扩增VPl全基因,并进行核苷酸序列和遗传进化分析。结果共检测HFMD疑似病例1829例,肠道病毒总阳性率为81．30％（1487／1829）,其中EV71占39．88％,CVA16占38．33％,其他EV占21．79％。9株EV71分离株与C4亚型的C4a分支代表株的核苷酸序列同源性为97．3％～98．5％,均归属于C4a分支;8株CVA16分离株与B1亚型代表株的核苷酸序列同源性为92．9％～97．1％,其中7株属于B1b分支,1株属于B1a分支。结论导致天津市2012年HFMD流行的EV71为C4亚型中的C4a病毒株,CVA16为B1亚型的B1b病毒株。     

2009-2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒基因变异分析

目的了解2009～2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的基因变异情况。方法选取2009～2013年哨点医院分离的新甲型H1N1流感病毒，进行HA和NA核苷酸序列测定，用Bioedit和MEGA version4．0分析软件进行基因种系进化特性分析。结果无锡地区2009～2013年种型H1N1流感病毒HA基因序列的同源性为98．9％～99．5％；氨基酸序列分析显示，无锡地区分离株第203位与国内、国际代表株比较发生氨基酸替换：S→T；第83位和321位与国内代表株相同，而与国际代表株不同，分别为S→P、V→I。NA基因序列与国内、国际代表株同源性为99．2％～99．8％；第87位和349位与国内代表株相同，而与国际代表株不同，分别为R→Q、D→G。结论通过对HA和NA基因序列的比对分析，2009-2013年无锡地区新甲型H1N1流感病毒流行株基因序列与国内、国际代表株高度同源。表明该地区近期不会发生新甲型H1N1流感大流行。