AP-2α对大肠癌SW620细胞增生的影响及其作用机制

目的研究转录因子激活蛋白-2d（AP-2α）对大肠癌细胞株SW620增生能力的影响及可能的作用机制。方法构建pcDNA3．1（＋）-AP-2α重组质粒,采用脂质体介导质粒转染人SW620细胞,利用MTT法检测其对SW620细胞增生能力的影响;荧光定量PCR方法和Western印迹法检测转染前后各组细胞中雌激素受体-β（ER-β）表达水平的变化。结果转染AP-2α后SW620细胞内AP-2α mRNA含量及蛋白表达水平显著升高。MTT结果提示,转染AP-2α基因后SW620细胞增生速度受到抑制。转染AP-2α基因后ER-β mRNA和蛋白表达增加,且在转染48h增加最为明显,ER—β mRNA和蛋白质分别增加了94．47％和54．67％,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AP-2α可抑制SW620细胞的增生,其抑制机制很可能与增强ER-β的表达有关。     

两位点短发卡状RNA诱导AKT2基因沉默在卵巢癌细胞紫杉醇敏感性中的应用研究

目的：探讨AKT2基因在肿瘤细胞对紫杉醇敏感性中的作用。方法：分别构建2个针对同一AKT2基因不同位点的短发卡状RNA（shRNA）载体，转染人卵巢癌细胞A2780、SKOV3，荧光显微镜观察细胞内荧光蛋白的表达及转染效率，运用RT—PCR、蛋白质免疫印迹（western blotting）方法比较单独转染的抑制瘤和共转染对AKT2表达的沉默效率；抑制AKT2表达后，流式细胞仪（FACS）检测肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。结果：构建的2种shRNA表达载体均可抑制AKT2mRNA和蛋白的表达，共转染的抑制率明显高于分别单独转染的抑制率（P〈0．05）；FACS结果显示，共转染沉默AKT2基因后，细胞凋亡率明显增加（P〈0．05）。结论：共转染针对AKT2基因不同位点的2个shRNA真核表达载体，对AKT2基因的抑制效率高于单独转染1个载体；抑制卵巢癌细胞中AKT2基因表达，能增强其对紫杉醇的敏感性。     

siRNA沉默S100P基因对胰腺癌细胞的生长抑制作用

[目的]探讨小干扰RNA（siRNA）沉默S100P基因后对胰腺癌SW1990细胞株生长的影响。[方法]化学合成针对S100P基因的siRNA,用脂质体转染试剂将siRNA体外转染至人胰腺癌SW1990细胞中,48h后收集细胞,分别提取细胞总RNA和蛋白。用实时定量RT-PCR测定S100P基因mRNA水平的表达;免疫印迹测定S100P蛋白的表达;MTT法测定细胞的生长曲线。[结果]转染siRNA后,S100P基因在mRNA水平上表达减少了77%,蛋白表达降低了74%,均显著性低于对照组。siRNA-S100P明显抑制细胞生长。[结论]应用RNAi技术沉默S100P基因可以降低人胰腺癌SW1990细胞株中S100P表达,抑制细胞生长。     

siRNA抑制人高迁移率族蛋白1表达对前列腺癌PC-3增殖的影响

目的：研究小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制高迁移率族蛋白1（HMGB1）基因的表达对人前列腺癌细胞PC-3增殖的影响。方法：构建真核表达载体Pgenesil-1／HMGB1 siRNA，在脂质体Lipofectamina 2000的介导下转染前列腺癌PC-3细胞株，通过RT—PCR和Westerll Blot检测HMGB1的mRNA及蛋白质的变化；流式细胞仪检测细胞周期；噻唑蓝（MTT）检测细胞生长曲线观察转染后PC-3细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化。结果：成功构建siRNA表达载体Pgenesil-1／HMGB1 siRNA，所获表达载体转染可使PC-3细胞HMGB1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P〈0．05），并能有效抑制PC-3增殖活性（P〈0．05）。结论：应用siRNA干扰技术能有效的抑制HMGB1基因的表达，同时也可有效抑制癌细胞的体外增殖活性，为肿瘤的生物学治疗提供新思路。     

Survivin基因的shRNA 干扰对结肠癌SW480 细胞增殖和凋亡的影响*

目的：以携带shRNA 片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480 中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法：将构建好的携带Survivin-shRNA 片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数（MOI）下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR 和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V-FITC 和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝（MTT）法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果：腺病毒转染后MOI 值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI 值为50并进行后续实验;shRNA 干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义（P<0.01）。 流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G1/S 期细胞增多和G2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 MTT 和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用（P<0.05）。 结论：采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA 干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G1/S 期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。     

联合转染PTEN与PINCH siRNA对结直肠癌细胞增殖、侵袭及凋亡影响的机制研究

目的:研究联合转染PTEN与PINCH siRNA对结直肠癌SW620细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法:在结直肠癌SW620细胞中转染pcDNA-PTEN或/和si-PINCH,qRT-PCR检测PINCH和PTEN mRNA的表达,Western blot检测PINCH、PTEN、CDK1、MMP-2、Bcl-2和 Bax蛋白表达, MTT法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭能力和凋亡率。结果:在结直肠癌SW620细胞中联合转染pcDNA-PTEN和si-PINCH后,PTEN的mRNA和蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,PINCH的mRNA和蛋白表达量显著降低（P＜0.05）;转染pcDNA-PTEN或/和si-PINCH均可抑制SW620细胞增殖和侵袭并促进细胞凋亡,抑制SW620细胞内增殖蛋白CDK1、侵袭蛋白MMP-2和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进凋亡蛋白Bax的表达;联合转染pcDNA-PTEN和si-PINCH比单独转染pcDNA-PTEN或si-PINCH效果更显著。结论:联合转染pcDNA-PTEN和si-PINCH可抑制结直肠癌SW620细胞增殖和侵袭并促进细胞凋亡,且比单独转染效果更显著。     

沉默胶质瘤相关癌基因同源物2基因对结肠癌细胞系SW620增殖和凋亡的影响

背景与目的：胶质瘤相关癌基因同源物2（glioma-associated oncogene homolog 2,Gli2）是Hedgehog 信号通路重要的转录因子,它不仅与正常细胞的生长密切相关,而且在多种肿瘤细胞中异常激活。探讨Gli2对结肠癌细胞系SW620增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法：以Gli2干扰慢病毒载体感染SW620细胞,实验设干扰组、空病毒载体组和对照组,采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）和蛋白［质］印迹法（Western blot）检测细胞中Gli2 mRNA表达和蛋白水平,采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）、集落形成实验和倍增时间检测细胞的增殖情况,流式细胞术（flow cytometry）检测各组细胞周期和凋亡情况,Western blot法检测细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax和cyclin D1蛋白水平。结果：SW620细胞转染慢病毒载体72 h后,可见明显的荧光表达;与空病毒载体组和对照组相比,干扰组细胞的Gli2基因表达被有效抑制（P<0.05）;细胞增殖能力明显降低（P<0.05）;细胞周期阻滞,G ₁ 期细胞比例增高（P<0.05）;细胞凋亡率明显增加（P<0.05）;p-ERK1/2、Bcl-2和cyclin D1的蛋白表达量降低（P<0.05）,Bax表达增加（P<0.05）。结论：沉默Gli2可以明显抑制结肠癌细胞系SW620的增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与p-ERK1/2 、Bcl-2和cyclin D1表达的下调和Bax表达上调相关。     

siRNA沉默PIM1基因表达对人胃癌MKN-45细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨PIM1 基因沉默对人胃癌 MKN-45 细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计2条针对PIM1 mRNA靶序列的干扰RNA正义链和反义链及阴性对照序列,构建重组pSIREN-retroQ质粒载体,并转染胃癌 MKN-45 细胞。应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测 PIM1在 mRNA水平及蛋白水平的表达。CCK-8 法检测胃癌 MKN-45 细胞的增殖,流式细胞分析胃癌细胞的凋亡,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3和Caspase 9的表达。结果:重组克隆通过 PCR 扩增及测序,证明干扰序列插入正确。与正常对照组和阴性对照组相比,两个RNA干扰组胃癌 MKN-45 细胞PIM1在 mRNA及蛋白水平的表达量都显著降低（P<0.05）,细胞增殖能力下降（P<0.05）。此外,干扰组细胞凋亡明显增多（P<0.01）,Caspase 3和Caspase 9蛋白表达上调（P<0.01）。 结论: PIM1 siRNA能有效下调靶基因表达,产生特异性基因沉默效应;PIM1基因沉默显著抑制胃癌MKN-45 细胞的增殖并促进其凋亡。     

Heparanase表达下调对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨乙酰肝素酶（Heparanase）对结肠癌细胞生物学功能的影响。方法 采用荧光定量PCR检测人结肠癌细胞株SW620、SW480、LoVo和CACO 2中Heparanase的表达水平;设计并合成3条Heparanase特异性的小分子干扰RNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）,用于转染4株结肠癌细胞中Heparanase表达水平最高者;荧光定量PCR和Western blotting检验3条siRNA的干扰效果;MTT法检测结肠癌细胞的增殖能力;Transwell小室法检测结肠癌细胞的侵袭能力。结果 SW480细胞中Heparanase的表达水平高于其他3株结肠癌细胞;3条特异性siRNA转染SW480细胞后,均能在蛋白和mRNA水平抑制Heparanase的表达,以siRNA3的效果最佳,且呈剂量依赖性。siRNA3介导的Heparanase基因沉默可呈剂量依赖地降低SW480细胞的增殖能力并减弱侵袭能力（P＜0.05）。结论 Heparanase表达下调可导致结肠癌细胞生物学恶性程度降低,提示Heparanase可作为结肠癌靶向治疗的一个重要靶点。     

生存素siRNA对结肠癌细胞凋亡增殖和侵袭性的影响

目的:研究siRNA表达质粒沉默Survivin基因的效率及其对大肠癌细胞株SW480凋亡、增殖和侵袭性的影响。方法:构建Survivin基因的siRNA表达质粒(pRNAT/sur-siRNA),用Westeron-blot和半定量RT-PCR研究该表达质粒转染SW480后Survivin蛋白和mRNA表达的变化,流式细胞仪检测Survivin基因沉默后SW480细胞凋亡的变化,MTT法检测SW480细胞体外增值的变化;细胞侵袭性实验研究SW480细胞的侵袭性变化。结果:针对Survivin的siRNA的表达质粒下调大肠癌SW480细胞株Survivin蛋白和mRNA的表达水平,分别为85.0%,80.0%;pRNAT/sur-siRNA转染SW480后,SW480细胞凋亡率为16.9%;细胞增殖抑制率为37.4%,与对照组相比有显著差异(P<0.01);细胞侵袭实验示pRNAT/sur-siRNA/SW480细胞、pRNAT/SW480、SW480细胞的细胞穿透数分别为153±66、505±65、578±98个,(P<0.01)。结论:针对Survivin的siRNA可以显著降低Survivin的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭,促进肿瘤细胞的凋亡。     

Study on inhibition of growth of ACHN cells via shRNA expression vector-mediated cyclinE1 gene silencing

OBJECTIVE To explore the inhibition of ACHN cells via shRNA expression vector mediated cyclinE1 gene silencing.METHODS The shRNA targeting at cyclinE1 gene was designed and synthesized. By ligation, the fragment was inserted into pGenesil-1-U6 to construct the recombinant plasmid pGenesil-1- U6-cyclinE1. The identified recombinant plasmid was introduced into ACHN cells with lipofectamine 2000. The inhibition of cyclinE1 mRNA and protein expression were analyzed by RT-PCR and western-blotting. MTT method was used for observing cell proliferation and drawing growth curve. The cell cycle and ratios of apoptotic cell were assessed by flow cytometric detection. The ability of invasion and speed of cell migration were detected by transwell chamber invasive models and cell scratch method.RESULTS The inhibition of expression of cyclinE1 in ACHN cells mediated by recombinant vector (0.0933 ± 0.05) was significantly lower than that in the group of transfected with empty vector (0.8827 ± 0.04) and the control group (0.9021 ± 0.03) (P < 0.05). Flow cytometry showed that recombinant cells were blocked in the G1 phase and the apoptotic ratio was increased significantly (11.15 ± 4.00)% (P < 0.05). The curves of cell growth indicated that the proliferation of cell transfected with recombinant plasmid was inhibited significantly compared with that in control group (P <0.05). The results of transwell and cell scratch suggested that the abilities of invasion and migration of the cells transfected with recombinant plasmid were decreased conspicuously (P < 0.05).CONCLUSION The expression of cyclinE1 could be inhibited successfully by RNA interference induced by shRNA expression vector. This consequently inhibits the cell growth and induces apoptosis. Our study provided a preliminary result in searching of RNA interference (RNAi) therapy for renal cell carcinoma.     

生存素siRNA表达质粒对结肠癌细胞侵袭和增殖能力的抑制作用

 目的 构建针对生存素的小分子RNA干扰表达质粒，研究siRNA表达质粒沉默生存素基因后对大肠癌细胞株SW480侵袭性和增殖性的影响。方法 用pRNAT U6.1/Neo载体构建生存素 siRNA表达质粒（pRNAT/sur siRNA），该质粒转染SW480细胞株48小时后，用Westeron blot和半定量 RT PCR分析生存素蛋白和mRNA表达的变化。G418 400μg/L筛选阳性克隆细胞株（sur siRNA/SW480），MTT法检测SW480细胞体外增殖的变化；细胞侵袭性实验研究SW480细胞的侵袭性变化。结果 成功地构建了pRNAT/sur siRNA表达质粒，并且该质粒明显下调SW480细胞生存素蛋白和mRNA的表达水平，分别下调85%，80%。G418 400μg/L筛选出转染pRNAT/sur siRNA的SW480细胞株（sur siRNA/SW480）；sur siRNA/SW480细胞增殖受到显著抑制，抑制率为37.4% (P<0.01)；细胞侵袭实验示sur siRNA/SW480细胞的穿透数为(153±66)个，而对照组pRNAT/SW480、SW480细胞的穿透数为(505±65)，(578±98)个细胞，sur siRNA/SW480细胞的穿透数与对照组相比显著减少(P<0.01)。结论 针对生存素siRNA可以显著降低生存素的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭，该生存素siRNA序列可能成为治疗结肠癌的一种有效手段。     

APE1shRNA重组质粒的构建及对人乳腺癌细胞生长的影响

目的设计构建靶向脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1（APE1/ref-1）特异性短发卡RNA的真核表达载体,并转染人乳腺癌T47D细胞。方法设计、合成针对APE1的特异性的短链寡核苷酸,构建APE1特异性shRNA的重组质粒,稳定转染人乳腺癌T47D细胞;采用聚合酶链反应和免疫印迹法检测转染前后T47D细胞中APE1的表达。采用四甲基偶氮唑盐法观察T47D细胞的生长情况。结果经酶切和测序鉴定,成功构建APE1特异性shRNA的重组质粒,并能够转染T47D细胞。转染后,APE1在mRNA和蛋白水平表达分别下降约53.1%和60.5%,T47D细胞增殖活性受到抑制。结论运用pGenesil-1.1质粒载体构建的靶向APE1特异性shRNA的重组质粒可以成功转染T47D细胞,有效抑制APE1的表达,并抑制肿瘤细胞的生长。     

Stathmin siRNA表达载体的构建及对LM8细胞生物学行为的影响

背景与目的:Stathmin在多种恶性肿瘤细胞中都有高水平表达,通过抑制其表达可以干扰恶性肿瘤细胞的分裂,影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。本研究构建并观察stathmin基因RNA干扰表达载体转染LM8细胞系后对stathmin表达及细胞生物学行为的影响。方法:构建靶向stathmin干扰质粒pGenesil-1-Stathmin和通用对照质粒pGenesil-1-HK,以脂质体法将2个重组质粒分别转染骨肉瘤LM8细胞系。实时荧光定量PCR和Western印迹技术检测各组LM8细胞系stathmin在mRNA和蛋白水平的表达,MTT(噻唑蓝)法比色分析检测细胞体外生长抑制率,软琼脂集落形成实验观察单个细胞体外增殖活力,细胞HE染色观察细胞形态学的变化,Hoechst染色观察细胞凋亡特征并计算凋亡率,流式细胞术定量分析细胞周期变化,C3H小鼠移植瘤实验显示肿瘤细胞成瘤能力。结果:DNA测序证实成功构建pGenesil-1-Stathmin重组质粒。转染LM8细胞后,明显抑制stathmin基因表达;细胞体外生长抑制率显著增加;单个细胞体外增殖活力显著下降;细胞HE染色部分细胞呈典型的凋亡细胞形态学改变;Hoechst染色显示细胞凋亡特征,细胞凋亡率明显高于对照组;流式细胞术检测显示细胞周期阻滞于G2/M期,明显高于对照组;C3H小鼠移植瘤实验显示特异转染组致瘤率下降,肿瘤生长减缓。结论:成功构建的靶向干扰质粒pGenesil-1-Stathmin能有效抑制stathmin基因在骨肉瘤LM8细胞的表达并影响其相关生物学行为,其抑制骨肉瘤细胞的增殖与生长,为stathmin基因应用于骨肉瘤的基因治疗研究奠定了理论基础。