电压门控型钾通道蛋白Kv1.5抗血清的制备及特性鉴定

目的 制备电压门控型钾通道蛋白Kv 1.5的多克隆抗体,对其特性进行鉴定.方法 利用生物信息学方法分析Kv 1.5蛋白的序列,根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择一段8个氨基酸序列,据此合成Kv 1.5多肽片段,并将其与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为免疫抗原,免疫新西兰白兔制备抗Kv 1.5抗血清.辛酸-硫酸铵法纯化抗血清,对纯化后的抗血清进行 ELISA、Western blot鉴定.结果 成功获得抗Kv 1.5合成肽的抗血清,该抗血清效价为1∶ 64 000,可与Kv 1.5合成肽及天然Kv 1.5蛋白出现特异性反应,该抗血清识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为59 kD.同时,Western blot结果显示,所制备的抗血清能识别大鼠心脏天然Kv 1.5蛋白.结论 合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗血清,并且制备的抗血清经 ELISA、Western blot鉴定后特异性较好.     

小鼠IFIT1多克隆抗体的制备

目的 获取小鼠IFIT1(Interferon-induced protein with tetratricopetide repeats 1 )特异性多克隆抗体.方法 扩增培养高效表达IFIT1的重组子pMAL-C2X-IFIT1,超声破碎后的细胞上清过Amylose Pre-packed column亲和层析柱,将所得纯化的融合蛋白MBP-IFIT1作为抗原,添加福氏佐机剂后免疫兔,收集抗血清,用Western blot和ELISA方法测定抗血清特异性反应和效价.结果 纯化的MBP-IFIT1可诱导兔产生特异性免疫应答,所得抗体能够特异性识别融合蛋白中的IFIT1,ELISA结果显示其效价为1∶12 800.结论 MBP-IFIT1具有良好的抗原性,以该融合蛋白为抗原免疫兔成功制备出IFIT1特异性多克隆抗体.     

弓形虫CDPK5基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定

目的：筛选弓形虫（Tg）CDPK5基因序列的免疫多肽,将合成多肽免疫新西兰白兔制备多抗血清,并对其功能进行鉴定。方法利用生物信息学的方法分析确定Tg CDPK5序列免疫多肽,再用合成的多肽免疫新西兰白兔制备多抗。收集多抗血清,酶联免疫吸附测定（ELISA）测定多抗滴度,蛋白免疫印迹法（Western blot）鉴定免疫活性,免疫荧光实验分析Tg CDPK5的亚细胞定位。结果通过生物信息学分析,选择Tg CDPK5序列N端一段长17 bp的多肽序列作为免疫多肽;用合成的多肽免疫兔子,成功获得多抗血清。ELISA测定多抗血清效价为1∶640000;Western blot证明该多抗血清能特异性识别 Tg CDPK5（75．4×103）条带;免疫荧光实验结果表明,该多抗能特异性识别弓形虫内源Tg CDPK5蛋白。结论研究根据 Tg CDPK5序列信息的分析,获得Tg CDPK5序列免疫多肽,并制备兔源多克隆抗体。     

泡球蚴Em18多克隆抗血清的制备和鉴定

目的：制备和鉴定泡球蚴Em18抗原的多克隆抗血清.方法： 利用大肠杆菌BL21（DE3）表达重组质粒pET41a-Em18,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化rEm18-GST蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源抗Em18多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法鉴定其特异性.结果： （1）SDS-PAGE检测表明,rEm18-GST蛋白得到成功表达,在相对分子量为50 kDa处有表达条带.（2）纯化后获得高纯度的rEm18-GST蛋白.（3）ELISA结果表明,抗Em18抗血清的抗体滴度为1∶25 600;Western blot结果表明抗Em18抗血清能与rEm18-GST蛋白发生特异性结合.结论： 获得了特异性识别rEm18-GST蛋白的多克隆抗体,为进一步筛选Em18模拟抗原表位奠定基础.     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

小细胞肺癌抗独特型疫苗功能的试验研究

目的探讨小细胞肺癌(SLCL)抗独特型抗体3F6和其单链抗体(3F6SeFv)诱导体液和细胞免疫应答的能力,以证明其作为抗SCLC疫苗的可行性。方法3F6和3F6SeFv(Ab2)免疫BALB/c小鼠获得抗血清,以ELISA和Western blot方法分别检测抗血清中Ab3结合SCLC细胞膜表面特异抗原(NCI-H128抗原)的能力,用竞争Western blot检测Ab3与2F7竞争结合NCI-H128抗原的能力。以迟发型超敏反应(DTH反应)和小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验检测3F6及3F6SeFv诱发细胞免疫应答的潜能。结果ELISA和Western blot方法均证明,3F6和3F6SeFv免疫同系小鼠所产生的Ab3能特异的与NCI-H128抗原相结合,与对照血清相比,差异有统计学意义(P<0.001),且有很强的与2F7(Ab1)竞争结合靶抗原的能力。在DTH反应中,3F6和3F6SeFv所致小鼠足垫肿胀的程度均明显高于对照组(P<0.001)。小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应试验证明,用3F6和3F6SeFv免疫的小鼠脾脏淋巴细胞对靶细胞的再次刺激有明显的增殖反应,与阴性肿瘤细胞对照组和阴性抗体对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论抗独特型抗体3F6和3F6ScFv均有模拟SCLC细胞膜表面特异抗原的能力,成功诱导了相应的体液和细胞免疫应答,可作为抗SCLC疫苗进行深入研究。     

日本血吸虫成虫分泌抗原的鉴定

目的制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原,对其免疫原性以及免疫反应性进行初步鉴定。方法日本血吸虫尾蚴感染家兔,42 d后剖杀获取成虫,将虫体置无血清DMEM培养基中,5%CO2孵箱37℃培养4 h,得到成虫分泌代谢抗原;用该抗原免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体反应;用该抗原包板,ELISA法检测血吸虫感染人血清抗体效价;采用十二烷基硫酸钠聚丙酰烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其组分进行分析,然后用Western blot分析其对抗成虫分泌代谢抗原单抗发生反应的蛋白条带。结果成功制备日本血吸虫成虫分泌代谢抗原;免疫小鼠可产生较高滴度(1∶16 000)抗体反应;急性血吸虫病患者、慢性血吸虫病患者、晚期血吸虫病患者和钩虫病患者血清抗该抗原的抗体效价分别为1∶800、1∶400、1∶800和1∶100,华支睾吸虫患者和正常人血清均为阴性;SDS-PAGE显示其具有4条蛋白条带,分子量分别是13、40、60和180 ku左右;Westernblot结果表明该抗原能够被抗成虫分泌代谢抗原单抗在5ku左右处识别。结论制备的日本血吸虫成虫分泌代谢抗原具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

gp120蛋白多肽抗体的设计、制备与鉴定

目的:设计多肽免疫原,制备针对中国流行株B’亚型人类免疫缺陷病毒一型(HIV-1)gp120蛋白的抗血清和相应单克隆抗体。方法:通过蛋白抗原设计,设计出免疫原多肽,将多肽欧联载体蛋白免疫小鼠,制备小鼠多克隆抗血清和单克隆抗体;用ELISA实验、蛋白免疫印迹鉴定其活性和表位。结果:成功制备了能结合gp120蛋白的小鼠多克隆抗血清,并且获得4株分泌特异性抗免疫原的IgG1亚型的单克隆细胞株。结论:蛋白抗原设计是成功的,该多肽能诱导结合蛋白的抗体,有可能成为针对艾滋病病毒中国流行株的多肽疫苗。     

抗腺病毒载体单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的 研制抗腺病毒载体(Adv)表面蛋白的单克隆抗体(McAb).方法 将Adv以Al(OH)3佐剂化,常规免疫BALB/c小鼠.采用细胞融合技术制备抗Adv McAb;采用ELISA、免疫细胞化学及Western blot法对McAb进行筛选与鉴定.结果 共获得6株可稳定分泌特异性McAb的细胞(A4H11、A8C7、F1H5、G1D2、G4E3、H2G8),其染色体数目为102～106条,所分泌McAb均属IgG1亚类,持续3个月适应培养仍能保持其稳定的抗体分泌能力.腹水抗体的ELISA效价在1∶106～1∶108之间;Western blot结果显示6株McAb均与来自腺病毒载体及野生3、5、7型腺病毒抗原提取物中分子量约为114 kD的多肽反应,据此推测它们均是抗ADV-TK六邻体蛋白的McAb.结论 成功制备出6株抗腺病毒载体六邻体单克隆抗体,为腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗的临床前研究提供物质基础.     

人C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-1高特异性抗体的制备

目的 制备人补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白1（hCTRP1）的特异性抗体.方法 合成了hCTRP1的C端抗原肽并免疫新西兰大白兔,利用亲合纯化色谱柱对抗体进行了纯化.结果 间接ELISA测定表明,抗血清效价达1∶64 000,Western印迹及ELISA验证表明纯化抗体具有很高的特异性.结论 人工合成的hCTRP1抗原肽免疫新西兰大白兔,制备了高效价的抗血清,并纯化制备了hCTRP1特性抗体.     

APP/PS1转基因小鼠大脑内锌转运蛋白3的表达

目的研究锌转运蛋白3(ZnT-3)在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质及海马内的分布和表达变化。方法应用免疫组织化学技术检测ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠脑内的分布,并应用Western blot方法分析ZnT-3在大脑皮质及海马的表达水平。结果ZnT-3主要分布于APP/PS1转基因小鼠脑内的老年斑中,且主要定位于老年斑周围变性的神经元及其突起内;ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马的表达均明显高于野生型小鼠。结论ZnT-3在APP/PS1转基因小鼠大脑内的高表达以及在老年斑内的定位,提示ZnT-3可能在老年斑内锌离子的聚集过程中起着重要的调节作用,进而参与了APP/PS1转基因小鼠大脑内Aβ老年斑的形成。     

半胱氨酰白三烯受体2多克隆抗体制备及其鉴定

目的:制备半胱氨酰白三烯受体2(CysLT_2)多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性及应用.方法:以KLH偶联的CysLT_2受体多肽免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法测定抗体效价,以抗原阻断法测定抗体敏感性及特异性;同时,以新制备的抗体进行Western blot和免疫组化,检测CysLT_2受体的组织表达.结果:ELISA测定显示,获得的家兔抗CysLT_2受体抗体的效价大于1/1 047 296,对CysLT_2受体的特异性强,对CysLT_1受体和GPR17基本无交叉反应.Western blot结果显示,CysLT_2受体在大鼠、小鼠肾、脑和肺中有较高的表达,其分子量在40 kD左右.免疫组化结果表明,CysLT_2受体主要表达在大鼠神经元,也表达在部分星形胶质细胞.结论:制备的CysLT_2受体多克隆抗体具有高效价和高特异性,能满足Western blot和免疫组化检测的要求.     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

柯萨奇病毒B3的多克隆抗体制备

目的制备柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)的多克隆抗体。方法针对CVB3基因的VP1区设计特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中,经IPTG诱导表达后,以GST-VP1融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blot以及间接免疫荧光检测多克隆抗体的效价和特异性。结果 ELISA检测血清的效价不低于1∶64 000,Western blot和间接免疫荧光显示该抗体具有良好的特异性。结论成功制备了效价较高的CVB3多克隆抗体,可应用于CVB3蛋白的检测。     

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化

目的制备肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化。方法生物信息学方法分析EHECO157:H7EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白(KLH),免疫新西兰大白兔制备抗血清。ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度。结果选择EspF蛋白抗原指数最高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA-86(0.506)为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78%,经质谱分析其分子量为1563.76Mr,与目的多肽分子量一致;加强免疫3次后,EHECO157:H7EspF蛋白的抗血清效价达1:2048000;该血清对EHECO157:H7野生株和espF突变株(△espF)的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体。结论成功地制备了效价高、特异性强的EHECO157:H7EspF蛋白多克隆抗体。     

多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

LRRC4多抗制备及在构建不同级别脑胶质瘤差异表达中的应用

目的:制备兔抗脑瘤候选抑瘤基因LRRC4(leucine-rich repeats containing 4)的多克隆抗体,应用该抗体检测LRRC4表达与脑胶质瘤病理分级的相关性.方法:应用DS Gene1.1软件分析LRRC4全长蛋白,避开跨膜结构域,选取亲水性及抗原性均好的蛋白序列.构建相应的融合表达载体pGEX-4 T-2/276 bp,转入E.coli JM109中IPTG诱导表达.融合蛋白经纯化后免疫新西兰兔,收集并纯化抗血清,获得兔抗人LRRC4多抗,应用该抗体通过Western印迹和免疫组织化学检测LRRC4在正常人胚胎各器官组织中的表达及其在正常脑组织与各级脑胶质瘤中的表达差异.结果:制备了效价高、特异性好的兔抗人LRRC4多抗,进一步证实了LRRC4在正常人脑组织中相对特异高表达,在脑胶质瘤中表达下调(22例/37例)或缺失(15例/37例),其表达水平与脑胶质瘤的病理分级相关.结论:兔抗人LRRC4多抗效价高、特异性好,应用该抗体检测到LRRC4的表达水平与脑胶质瘤病理分级密切相关,为LRRC4后续的研究工作奠定了基础.     

Specific humoral immune responses in rhesus monkeys vaccinated with the Alzheimer’s disease-associated β-amyloid 1-15 peptide vaccine

Background Alzheimer‘ s disease(AD) is a neurodegenerative disorder characterized by overproduction of β-amyloid (Aβ) , with the subsequent pathologic deposition of Aβ which is important for memory and cognition. Recent studies showed murine models of AD and AD patients inoculated with Aβ1-42 peptide vaccine had a halted or delayed pathological progression of AD. Unfortunately, the clinical phase Ⅱ a trial of Aβ1-42 peptide vaccine (AN1792) was halted prematurely because of episodes of menigoencephalitis in 18 of the vaccinated patients. The vaccination of BALB/c or Tg2576 transgenic mouse with Aβ1-15 peptide vaccine is safe and the immune effects are satisfactory. This study further characterizes the specific humoral immune responses in adult rhesus monkeys induced by Aβ1-15 peptide vaccine. Methods Five male adult rhesus monkeys were injected intramuscularly with Aβ1-15 peptide vaccine at baseline and at weeks 2, 6, 10, 14, 18 and 22. The titers and IgG isotypes of the antibody against Aβ1-42 in serum was measured by Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). The specificity of the antibody against Aβ1-42 was determined by Western blot. The Aβ plaques in Tg2576 transgenic mouse brain were stained with the antiserum using immunohistochemistry method. Results At the eighth week after the vaccination, antibody against Aβ1-42 began to develop significantly in serum. The titers of the antibody increased following vaccine boosted and reached 1 : 3840 at the twenty-fourth week, then decreased after the termination of inoculation. The IgG1 was accounted for the highest level in the antiserum pool. The antibody against Aβ1-42 showed high specificity. The Aβ plaques in Tg2576 transgenic mouse brain were labeled with the antiserum. Conclusion Aβ1-15 vaccine can induce vigorously specific humoral immune resoonses in adult rhesus monkey.     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.