胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-酌基因治疗大肠癌的实验研究

目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC鄄CD)联合干扰素-酌(INF鄄酌)基因对大肠癌的治疗作用。方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC鄄CD基因;AdCMVINF鄄γ转导鼠INF鄄γ基因。采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用。结果:AdCMVIFN鄄γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用。AdCMVCD/5鄄FC联合AdCMVINF鄄γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P<0.01),肿瘤生长明显抑制(P<0.01)。组织学检查显示,EC鄄CD基因与INF鄄γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。结论:EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用。     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因应用于基因治疗。构建，包装含ＣＤ基因的假型逆转录病毒。构建含ＣＤ基因的逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ基础上，以重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ转染包装细胞ＰＡ３１７，ＰＬＣＤＳＮ整合人ＰＡ３１７染色 。结果：ＣＤ基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞，逆转录病毒重组表达载体ＰＬＣＤＳＮ整合入ＮＩＨ／３Ｔ３细胞染色体     

CD基因修饰的神经干细胞对C6胶质瘤细胞的作用

目的研究CD基因修饰神经干细胞(NSCs)对脑胶质瘤细胞的抑制作用、效果及机制,为NSCs在脑胶质瘤治疗中的应用提供理论依据。方法以胎脑作为供体,采用神经球形成法培养NSCs,脂质体介导CD基因转染NSCs,G418筛选。NSCs/CD与C6胶质瘤细胞分组共培养,MTT检测细胞存活情况。结果成功构建CD基因转染NSCs,NSCs/CD对C6细胞生长有明显抑制作用。结论 NSCs是良好的载体,NSCs/CD-5-FC自杀基因治疗系统具有很强的抗肿瘤效果。     

胞嘧啶脱氨酶基因对移植静脉平滑肌增生的抑制作用

目的　研究胞嘧啶脱氨酶基因 / 5 -氟胞嘧啶自杀基因系统对移植静脉平滑肌增生的抑制作用 .方法　将含 Ad-CMVCD(CMV为启动子、含胞嘧啶脱氨酶基因的腺病毒载体 )的病毒上清加压注入兔颈外静脉管腔 (两端及分支结扎 ) ,半小时后剪下该静脉并用 Cuff技术移植于兔颈动脉上 ,以单纯移植组和 Ad CMVL acz(含 β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒载体 )为对照 ,4 wk后取静脉桥行 RT- PCR以确定转染效率 .通过光镜和电镜观察平滑肌细胞的形态变化 ,并对血管桥外径、管腔、内膜、中膜面积和外弹力膜周长及管腔相对丧失率进行定量分析 ,统计学处理以观察抑制内膜增生、防治血管再狭窄的效果 .结果　治疗组的内膜平滑肌增生明显 <两个对照组 .管腔丧失率亦明显减少 ,Ad CMVCD组为 (3.6 8±0 .4 2 ) % ,单纯移植组为 (9.6 8± 0 .4 1) % ,(P<0 .0 1) .结论　Ad CMVCD自杀基因系统对移植静脉平滑肌的增生有抑制作用 .     

人胚神经干细胞的培养与基因修饰后体内的表达

目的 分离培养人胚神经干细胞(human neural stem cells, hNSCs),建立人胚神经干细胞株;体外通过逆转录病毒转染人胚神经干细胞,观察其生物学特性及在脊髓损伤(spinal cord Injury,SCI)模型体内的表达.方法 分离孕10～20周(平均13周)人胚脑皮层来源的神经干细胞并连续传代培养,通过克隆试验、免疫组织化学等方法检测其生长特性与增殖能力;用构建了增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的逆转录病毒转染神经干细胞并检测其生物学特性;制备兔T9全横断脊髓损伤模型,观察携带EGFP基因的人胚神经干细胞在体内的表达情况.结果 从胎龄10～20周的人胚脑皮层中成功分离出人胚神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力及多分化潜能,能表达干细胞及分化细胞的特异性抗原;逆转录病毒转染后,仍然保持未分化状态并能自我更新形成新的神经球;移植入兔脊髓损伤模型后,可在体内存活较长时间,高效表达转基因蛋白.结论 人胚脑皮层中存在能连续传代培养的神经干细胞,转基因及移植入体内后能高效表达目的基因蛋白并保留干细胞的基本属性,发挥治疗作用.     

Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

目的 探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果.方法 利用Survivin启动子替换pEGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体pSurP-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在pSurP-EGFP中,构建成重组载体pSurP-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡.结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果.结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果.     

胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-γ基因治疗大肠癌的实验研究

目的研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD)联合干扰素-γ(INF-γ)基因对大肠癌的治疗作用.方法以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC-CD基因;AdCMV INF-γ转导鼠INF-γ基因.采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC-CD基因联合INF-γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用.结果AdCMV IFN-γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用.AdCMVCD/5-FC联合AdCMV INF-γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P＜0.01),肿瘤生长明显抑制(P＜0.01).组织学检查显示,EC-CD基因与INF-γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润.结论EC-CD基因联合INF-γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用.     

腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS,在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况,同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16 h后NSCS发出绿色荧光,在第7天左右荧光强度达高峰并可持续稳定表达20天左右,Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光,部分细胞β-Ⅲtubu lin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P〉0.05）。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS,且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。     

胞嘧啶脱氨酶的原核表达和多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD)，制备鼠抗大肠杆菌CD多克隆抗体，方法：亚克隆CD基因到原核表达载体pMAL-c2和pBV222中，并转化入大肠杆菌DH5α内，诱导表达并纯化MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果：通过重组质粒的酶切筛选出重组阳性克隆，成功地表达和纯化出MBP-CD和6his-CD融合蛋白，用纯化的MBP-CD成功制备了鼠抗CD多克隆抗体，并用6his-CD和GST-CD重组蛋白进行Western印迹分析，证实了抗体的正确性，结论：应用多克隆抗体可以检测体内外CD基因的表达，为临床前和临床上深入开展CD基因的生物治疗研究提供重要的实验材料。     

神经干细胞体外研究的现状

神经干细胞(NSCs)是一种存在于中枢神经系统内,能自我更新、具有多向分经潜能的未分化细胞,在一定条件下可分化为神经元,是形胶质细胞和少突胶质细胞。随着神经干细胞概念的提出,其良好的生物学特性和广阔的临床应用前景,使其成为了近年来生命科学领域中一大研究热点。目前,对它的研究已经单纯的生物学特性拓展到了分子和基因水平。通过基因工程技术将不同的目的基因转染到NSCs中,促进神经干细胞的增殖或诱导其分化,从而将神经干细胞优良的生物学特性和先进的基因工程技术相结合,形成转基因的神经干细胞,为神经系统疾病的临床治疗提供了崭新的策略。     

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的 构建人微小抗肌萎缩蛋白基因（microdystrophin）的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）,研究其体外表达情况。方法 限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒poD-NA3．1（＋）的Notl位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3．1（＋）／microdystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染人rMSCs中,经过G418筛选后。用RT—PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果 pcDNA3．1（＋）／microdystrophin经过Notl、HindⅢ酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录：对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光．说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论 成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染人rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达．为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。     

含CD基因的腺病毒载体制备及体外抑瘤效果观察

目的：制备含胞嘧啶转氨酶（CD）基因的重组腺病毒（Ad-CD)并进行体外肿瘤的自杀基因治疗。方法：构建含CD或LacZ基因的重组腺病毒载体。在293细胞内重组包装后,体外感染小鼠结肠癌细胞株C26,并给予不同浓度的前药氟胞嘧啶（5-FC）进行肿瘤杀伤效果观察。结果：重组腺病毒载体构建成功。用制备的Ad-CD液感染C26细胞,并予以不同浓度5-FC后,肿瘤细胞生长受不同程度抑制,而对照组细胞和原位转LacZ基因的C26细胞的生长未出现明显的变化。结论：应用腺病毒载体转CD基因进行体外肿瘤治疗效果明显,为自杀基因应用于体内结肠癌的基因治疗研究奠定基础。     

CD基因对大肠癌杀伤作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ基因对大肠癌靶向治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动ＣＤ基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡＣＤＮa,脂质体裹 法将重组组织特异性载体pＣＤ２在逆转录病毒包装细胞ＰＡ３１７细胞中进行包装,收获病毒上清后分别转染入高分泌ＣＥＡ的大肠癌细胞ＬoＶo中,经Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后进行体外前药敏感实验及观察旁观者交应,然后再将转基因ＬoＶo细胞接种对裸鼠皮下成     

Killing effect of adenoviral mediated cytosine deaminase gene on human pancreatic cancer cell line PaTu8988

Pancreaticadenocarcinomarankssixthofcancer-relateddeathinChina,andittendstobeadvancedatthetimeofpresentation,70%－90%patientsatthetimeofdiagnosishadinoperabledisease.5-Fluorouracil(5FU)iscommonlyusedaloneorwithradiotherapyinthetreatmentofresectablepancreaticcancerandinthepalliationofunresectablepancreaticcancer.Butthecurativeeffectof5FUislimitedbyitssideeffects.Suicidegenetherapyisanewexperimentalformofcancerchemotherapybeingevaluatedinhumantrials.Cytosinedeaminase(CD)isanenzymefoundinava-r…     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

酪氨酸酶启动子调控的CD基因治疗恶性黑色素瘤

目的：克隆酪氨酸酶（Ｔｙｒ）启动子并探索其调控细菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）在黑色素瘤基因治疗中的应用价值。方法：用ＰＣＲ法从小鼠恶性黑色素瘤细胞Ｂ１６基因组中克隆Ｔｙｒ启动子片段并与正常序列比较，并于逆转录病毒载体ＧｌＮａ中调控ＣＤ基因（ＴｙｒＣＤ）。测体外表达和体内抗肿瘤作用。结果：来源于Ｂ１６基因组的Ｔｙｒ启动子重要反式作用位点未见突变。该Ｔｙｒ启动子可使ＣＤ基因在Ｂ１６中特异表达。转ＴｙｒＣＤ的     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。