多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

应用单管巢式多重PCR技术检测登革病毒及分型

目的建立一种单管巢式多重RT-PCR方法,以用于临床对于不同型别登革病毒混合感染的检测并分型。方法将1~4型登革病毒RNA混合,首先用1~4型病毒通用外引物进行一步法RT-PCR,然后以混合病毒RT-PCR产物为模板,在同一反应管内同时加入4对(5条)型特异性引物进行巢式多重PCR,结果用EB染色的3%琼脂糖凝胶电泳观察;并将其检测敏感性和特异性与该方法的单一病毒模板RNA扩增进行比较。结果经反应条件的优化,混合病毒模板单管巢式多重PCR可以在同一反应管内同时扩增出4条病毒特异性目的条带,分别为482、119、290、389 bp。其敏感性和特异性与单一病毒RNA的扩增相当,对模板RNA检测的敏感性可以达到66.068 copies/μl。结论该方法简便、快速、敏感、特异,可以根据扩增目的片段的大小进行诊断和分型,对于临床登革病毒混合感染病例的诊断和快速分型有应用价值。     

柯萨奇B组3型病毒SYBR Green Ⅰ RT-PCR 检测方法的建立

目的 建立一种灵敏、特异的柯萨奇B组3型(CV-B3)病原SYBR Green Ⅰ RT-PCR实时荧光定量检测方法,用于快速、准确地检测CV-B3。方法 设计柯萨奇B组病毒通用引物以及VP1基因的T7启动子特异性引物,以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立CV-B3的荧光定量PCR检测方法;对检测方法的敏感度、特异性、重复性进行评价。结果该检测方法在10～10⁹ 拷贝/微升范围内具有良好的扩增效率和线性关系,最低检测限为10拷贝/微升,标准曲线r2=0.999, 扩增效率为95.7%;且对柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)、柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)、肠道病毒71型(EV-71)均无交叉反应,重复性实验变异系数(CV%)<2%。结论 本实验建立的检测方法敏感度较高,同时具备良好的特异性及重复性,可用于CV-B3病原的临床及实验室样本的定性定量检测。     

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

Vero及Vero-dst细胞对犬瘟热病毒敏感性比较

目的 为了更好地分离犬瘟热病毒(CDV)并确诊犬瘟热,本实验比较了Vero及Vero-dst细胞对此病毒的敏感性.方法 将CDV标准毒株Snyder Hill株及临床犬瘟热阳性犬组织匀浆分别接种Vero及Vero-dst两种细胞,通过观察细胞病变、检测病毒滴度(TCID50),并通过RT-PCR法进行比较,分析两种细胞对CDV的敏感性.结果 接种病毒后Vero细胞盲传5代始终未见细胞病变,而Vero-dst细胞12 h出现了明显的合胞样细胞病变,且RT-PCR扩增出了CDV基因特异性片段.结论 Vero-dst细胞对CDV表现了良好的敏感性,是体外分离培养CDV的一个有效细胞系.而所本实验中使用的Vero细胞并不适于CDV的分离与培养.另外,本实验利用Vero-dst细胞从临床犬瘟热阳性病例中成功分离到了野毒株,并确定其毒力较标准毒株毒力强,可用于进一步的研究.     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立及应用

目的建立用于牛源样本中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法。方法选择已发表的BVDV 1型和BVDV 2型包含5’UTR区高保守区域基因作为靶基因,分别设计合成引物,建立双重BVDV RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价。同时用建立的RT-PCR方法检测了小牛血清、小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液等41批次牛源性样本和64份牛血浆样本。牛源样本和64份牛临床样本。结果建立的BVDV RT-PCR检测方法与牛副流感病毒III型(BPIV3)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)均无交叉反应;检测BVDV 1型和BVDV 2型DNA模板最低浓度分别为每微升8.87×10~2拷贝和6.31×10~2拷贝,BVDV 1型和2型c DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用建立的BVDV RT-PCR方法检测41批次牛源样本和64份牛血浆样本,核酸阳性率分别为14.6%和29.7%。结论建立的BVDV RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源样本携带BVDV核酸的检测。     

鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立鸡胚致死孤儿病毒(CELO)和鸡减蛋综合症病毒(EDS)的多重PCR检测方法并进行初步应用.方法 参照GenBank提供的基因序列,设计了2对特异性引物分别扩增CELO长纤突蛋白和EDS六邻体蛋白的基因序列,建立检测CELO和EDS的多重PCR方法,考察该方法的特异性和敏感性,并使用该方法检测流感疫苗主种子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染.结果 该多重PCR方法成功扩增得到了两条特异性目的条带,并经测序验证.该方法特异性好,灵敏度显示核酸最低检测量可达10^-4μg/mL.使用该方法检测12批次流感疫苗主种子批病毒,外源性禽腺病毒的检测结果均为阴性.结论 成功建立鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒的多重PCR检测方法,灵敏度高,特异性好.在流感疫苗主种子批病毒的外源性禽腺病毒的检测中具有很高的使用价值和应用前景.     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因片段的克隆和表达

目的　构建pMal N重组表达载体 ,转化E .coliDH5α ,诱导表达犬瘟热病毒 (CDV)重组核衣壳 (N)蛋白。方法　采用RT PCR技术 ,从CDVRNA中扩增编码N蛋白的基因片段 ,通过连接反应 ,构建重组克隆载体和重组表达载体 ,转化感受态。E .coliDH5α细胞。通过IPTG诱导表达CDV重组N蛋白。结果　扩增出约 1 7kbCDV全长的主要结构蛋白N蛋白基因 ,通过PCR获得 5 36bpN蛋白基因片段。将N蛋白基因片段克隆入原核表达载体pMal C2 ,表达产物麦芽糖结合蛋白 (MAP)与N蛋白的融合蛋白的相对分子质量约 6 0× 10 3,与预期大小一致。结论　构建的pMal N重组载体所表达的CDVN蛋白为进一步研究CDV的特异、敏感的抗体检测方法打下基础     

鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS） 多重PCR检测方法的建立及初步应用

【摘要】目的 建立鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS）的多重PCR检测方法并进行初步应用。方法 参照GenBank提供的基因序列,设计了2对特异性引物分别扩增CELO长纤突蛋白和EDS六邻体蛋白的基因序列,建立检测CELO和EDS的多重PCR方法,考察该方法的特异性和敏感性,并使用该方法检测流感疫苗主种子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染。结果 该多重PCR方法成功扩增得到了两条特异性目的条带,并经测序验证。该方法特异性好,灵敏度显示核酸最低检测量可达10-4ug/ml。使用该方法检测12批次流感疫苗主种子批病毒,外源性禽腺病毒的检测结果均为阴性。结论 成功建立鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒的多重PCR检测方法,灵敏度高,特异性好。在流感疫苗主种子批病毒的外源性禽腺病毒的检测中具有很高的使用价值和应用前景。     

猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的初步建立

目的 建立猪伪狂犬病病毒(PrV)的PCR检测方法 .方法 根据PrV gB基因序列,应用primer 5.0软件自行设计、合成一对引物进行PCR反应,优化反应条件,建立检测 PrV的PCR方法 ,并应用于临床样品的检测.结果 以PrV上海株细胞培养物DNA为模板,扩增出263 bp的特异性条带,对扩增产物进行克隆测序和BLAST在线比对,与 GenBank中PrV的gB序列一致.对临床样品进行PCR检测,与病毒分离结果 一致.结论 所建立的PCR方法 敏感、特异,可用于实验用猪伪狂犬病病毒的快速检测.     

人细小病毒B19感染与再生障碍性贫血的关系

探讨人细小病毒Ｂ１９（Ｂ１９）感染与再生障碍性贫轿的关系。方法应用巢式聚合酶链反应技术检测６０例ＡＡ患者血清中Ｂ１９－ＤＮＡ。结果：Ｂ１９－ＤＮＡ阳性１６例，与正常对照组楷较有非常显著性差异；但儿童对照组比较有非常显著差异；但儿童与成人及急性与慢性ＡＡ间，无显著性差异。结论：Ｂ１９感染与ＡＡ的发生有关。可能是引起人类ＡＡ物的重要病因。     

犬细小病毒弱毒株的分离及疫苗应用

目的 从犬四联弱毒样品中分离获得一株细小病毒（ＣＰＶ）弱毒株,用于投疫苗制备。方法 根据犬副流感的血球吸附特性,细胞培养特性以及异种病, 清阻断法分离病毒,该病毒简称为ＣＰＶ－ＸＮ１株,并对犬细小病毒疫苗的免疫性和动物安全性进行了研究。结果病毒分离后共血疚效坐（ＨＶ）值为１：１０２４～、：４０９６或１０＾７．６ＴＣＩＤ６０;在电镜下可见较典型的犬细小病毒形态结构特征,免疫电镜下见到抗体分子已被吸     

细小病毒B19诊断芯片探针的制备

目的 制备细小病毒B19诊断芯片探针。方法 利用Primer Premier5．0软件针对细小病毒B19基因保守区域设计PCR引物，纯化扩增产物，克隆鉴定。结果 序列分析表明，扩增片段均为细小病毒B19特异基因。结论 利用PCR扩增产物可制备细小病毒B19诊断芯片探针。     

巢式PCR检测儿童血液病细小病毒B19感染的研究

目的 了解儿童血液病人细小病毒Ｂ１９（ＨＰＶＢ１９）感染的史及其关系。方法 应用巢式聚合酶链反应检测９０例儿童血液病患者「其中再生障碍性盆血（ＡＡ）４０例,特发性血小板减少性紫癜（ＩＴＰ）２４例,急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）１８例,难治性贫血（ＲＡ）８例」血清或骨 ＨＰＶ Ｂ１９－ＤＮＡ,并以３０例健康儿童为对照组。结果 病例组ＨＰＶ Ｂ１９－ＤＮＡ的总阳性检出率为２８．９％（２６／９０）,其中Ａ     

用PCR方法检测献血员的B_(19)病毒感染情况

目的：研究人微小病毒Ｂ１９在献血员中的感染情况。方法：采用ＰＣＲ技术对５００份献血员血清标本进行检测。结果：发现一例Ｂ１９病毒ＤＮＡ阳性，并用Ｋｏｃｈ设计的引物扩增标本和用ＨａｅⅢ，ＰｓｔⅠ和ＳｔｙⅠ酶切分析都证实为人微小病毒Ｂ１９。结论：国内献血者中有Ｂ１９病毒携带者。血液和血液制品有可能污染有Ｂ１９病毒。这个情况值得进一步研究。     

犬细小病毒核酸诊断方法的建立和应用

目的建立犬细小病毒的核酸诊断方法（PCR方法）并应用于临床诊断。方法根据犬细小病毒VP2基因序列设计引物，以犬细小病毒标准株、犬传染性肝炎病毒和正常增殖细胞DNA为模板，犬细小病毒扩增出221bp的特异带，将PCR产物连接到pMD18-T Vecter，转化大肠杆菌JM109菌株。重组质粒经测序并经blast比较，与GenBank中已登录的犬细小病毒VP2基因序列进行比较。同时将建立的PCR方法应用于30份犬粪便和病犬组织的检测，并测序。结果PCR产物测得的序列与GenBank的基因序列同源性为100％，粪便检测均无犬细小病毒的特异带，从病犬组织中有6份样品扩增出221bp的特异带，经测序比较，同源率为100％。结论建立了犬细小病毒的PCR检测方法，并能应用于临床诊断。     

国人细小病毒B19感染相关疾病谱

目的：探讨我国人细小病毒Ｂ１９感染引起的相关疾病谱。方法：用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术及原位杂交技术对６６例先天性心脏病（ＣＨＤ）心肌组织标本及１０８例血小板减少性紫癜（ＴＰ）、４７例急性再生障碍性贫血（ＡＡＡ）、５例传染性红斑（ＥＩ）及４０例缺铁性贫血（ＩＤＡ）患儿的外周血、骨髓标本进行了Ｂ１９－ＤＮＡ检测,并随机对其中２３例Ｂ１９－ＤＮＡ阳性标本作巨细胞病毒（ＣＭＶ）、单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）、     

人类微小病毒B19与小儿血液病的关系

目的 :探讨人类微小病毒B19与小儿血液病的关系。 方法 :采用酶联免疫吸附 (ELISA)法 ,对 37例血液病患儿的血清标本进行B19 IgM和B19 IgG检测 ,并与对照组进行比较。 结果 :在 37例患儿血清标本中 ,原发性血小板减少性紫癜 (ITP)B19 IgM的阳性检出率为 4 4 4 7% ,再生障碍性贫血 (AA)B19 IgM阳性检出率为4 1 2 % ,与对照组相比 ,差异均有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,急性白血病 (AL)与对照组相比差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。ITP、AA的B19 IgG的阳性检出率与对照组相比差异均无统计学意义 (P >0 .0 5 )。 结论 :人类微小病毒B19感染与ITP、AA有关     

急性特发性血小板减少性紫癜与人细小病毒B19感染的关系

[目的]探讨儿童急性特发性血小板减少性紫癜(ITP)与人细小病毒B 19(HPVB 19)感染的关系.[方法]采用PCR方法对41例急性ITP患儿及40名健康儿童进行HPVB 19-DNA检测.[结果]41例急性ITP患儿中HPVB 19-DNA阳性者为16例,40例健康儿童中HPVB 19-DNA阳性者为4例,急性ITP患儿中HPVB 19-DNA阳性者明显多见于健康儿童.[结论]儿童急性ITP可能与HPVB 19感染有相关性.     

人细小病毒B19与异位妊娠关系的初步研究

目的　探讨异位妊娠与人细小病毒B1 9(HPVB1 9)的关系。方法用聚合酶连反应 (PCR)检测异位妊娠和妊娠无异常妇女血清中的人细小病毒B1 9DNA。结果　病例组 :76例异位妊娠组的血清中HPVB1 9DNA有 1 8例阳性 ,阳性率为 2 3 .68% ;对照组 :40例妊娠无异常孕妇HPVB1 9DNA ,有 2例为阳性 ,阳性率为 5 .0 0 % ,P <0 .0 5 ,两组有显著性差异。结论　人细小病毒B1 9感染可能是异位妊娠的原因之一。