多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。方法通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因,然后采用基因拼接法(geneSOEing)剪接EmⅡ/3和Em14-3-3,得到EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。结果PCR成功扩增出2554bp的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗构建成功。结论成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗,为该疫苗的开发和利用打下了坚实的实验基础。     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的检测多房棘球绦虫重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法用重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗分别通过皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接种以及口服接种免疫BALB/c小鼠12周后,用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后18周剖杀小鼠,检获泡球蚴组织,称取重量,计算减蚴率;分离脾细胞,用ConA刺激培养16~18h,然后用流式细胞仪检测脾细胞凋亡。结果疫苗免疫组小鼠检获泡球蚴质量均明显低于PBS对照组;小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于PBS对照组(P<0.05或P<0.01),每个ConA刺激组脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液组(P<0.05或P<0.01),皮下注射组脾细胞凋亡发生率最低。结论多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗可抑制感染小鼠脾细胞发生凋亡,增加CD4+T细胞亚群的数量,诱导宿主产生一定的保护力,对抗Em原头节攻击。     

多房棘球绦虫EmⅡ/3抗原编码基因在大肠杆菌和BCG中的表达

目的研究多房棘球绦虫EmⅡ／3外源基因在大肠杆菌和BCG中的表达。方法将重组质粒pBCG-EmⅡ／3转入感受态大肠杆菌Top10和用电穿孔法导入BCG构建rBCG，将含有重组子的细菌培养至对数生长期，然后45℃热诱导，分别对表达产物作SDS-PAGE及免疫印迹分析。结果多房棘球绦虫pBCCyEmⅡ／3在BCG中成功表达了EmⅡ／3重组蛋白，在相对分子量为65kDa处可见明显的表达蛋白带，其表达量占菌体总蛋白量的9％，且能与鼠血清抗体发生特异结合，而在大肠杆菌中没有外源蛋白表达。结论多房棘球绦虫pBCCyEmⅡ／3能在BCG中表达，Western blot结果提示rBCGEmⅡ／3表达的EmⅡ／3重组蛋白具有特异的抗原性。     

多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因研究进展

本文介绍了多房棘球绦虫Em14-3-3蛋白，并对Em14-3-3抗原编码基因的研究进展进行了综述。     

多房棘球绦虫pBCG-Em14-3-3重组质粒的构建及其在BCG中的表达

目的构建多房棘球绦虫重组质粒pBCG-Em14-3-3,并转化BCG进行表达。方法超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Em14-3-3抗原编码基因;将该扩增产物定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-Em14-3-3;电穿孔法转化BCG,构建多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3。免疫印迹分析pBCG-Em14-3-3的表达产物。结果RT-PCR成功扩增出779bp的Em14-3-3抗原编码基因;双酶切证实Em14-3-3抗原编码基因成功插入pBCG中;PCR证实rBCG-Em14-3-3构建成功;免疫印迹分析发现pBCG-Em14-3-3的表达产物在相对分子质量(Mr)约为27×103处有明显的目的蛋白表达条带,且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3。     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的动态观察

目的 动态观察多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的变化. 方法 将混合疫苗采用鼻腔内接种免疫BALB/c鼠,在免疫后0、2、4、6、8和10周各剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,用EmAg或ConA刺激培养,收集脾细胞培养上清液,测定IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平.试验设有PBS对照. 结果 疫苗接种组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4分别在免疫后2～10周、4～8周、6～10周和4～6周升高,分别在免疫后6、6、8和4周达最高水平,含量分别为10.0 pg/ml、(75.0±6.6) pg/ml、(245.0±83.0) pg/ml和(187.5±16.5) pg/ml. 结论 多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗在免疫早期(2～8周)即可诱导小鼠产生TH1和TH2混合型免疫反应.     

多房棘球绦虫EmⅡ/3抗原研究进展

本文综述了多房棘球绦虫EmⅡ／3基因及表达蛋白EmⅡ／3的抗原性和免疫性，为多房棘球蚴病的疫苗研究和免疫诊断研究提供参考。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定多房棘球绦虫重组BCGEm14—3—3疫苗。方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA，通过RT—PCR扩增获得Em14—3-3的cDNA，将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG的人结核分枝杆菌热休克蛋白（HSP）70启动子下游构建重组质粒pBCG—Em14-3—3，用电穿孔法将该质粒导入BCG构建多房棘球绦虫重组BCG-Em14—3—3疫苗。将该疫苗接种到含12μg／ml、HgCl2的罗氏培养基筛选培养3周。结果 重组pBCG—Em14—3-3质粒经酶切证实构建成功，rBCG—Em14-3-3疫苗能在含12μg／ml HgCl2的罗氏培养基上生长繁殖。结论 成功构建多房棘球绦虫重组BCGEm14-3-3疫苗，为泡球蚴病的防治提供了一种新方法。     

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗构建及其表达效率

目的构建多房棘球绦虫(Em)重组卡介苗(BCG-EmⅡ/3)疫苗,分析EmⅡ/3分子在该疫苗中的表达效率。方法超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增EmⅡ/3的抗原编码基因；将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-EmⅡ/3；电穿孔法转化BCG,构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗。免疫印迹分析重组BCG-EmⅡ/3疫苗的表达产物。结果RT-PCR成功扩增出1 680 bp的EmⅡ/3抗原编码基因；双酶切证实EmⅡ/3抗原编码基因成功插入pBCG中；PCR证实rBCG-EmⅡ/3疫苗构建成功：免疫印迹分析发现重组BCG-EmⅡ/3疫苗的表达产物在相对分子质量(Mr)约为65×10~3处有明显的目的蛋白表达条带,且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论成功构建了多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗,为疫苗的开发和利用打下了坚实的理论基础。     

弓形虫关键粘附蛋白在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的通过cDNA文库筛选出弓形虫关键粘附蛋白基因一棒状体ROP2基因,在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,以获得重组蛋白。方法根据弓形虫棒状体ROP2基因开放阅读框设计引物,以弓形虫cDNA为模板进行PCR,纯化扩增产物经双酶切,进行TA克隆,再克隆到pET-30a中。重组质粒pET-30a—top2经PCR鉴定后,转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,用SDS—PAGE电泳鉴定表达产物。结果获得的1223bp的基因片段经PCR和酶切鉴定后与预期大小一致;SDS—PAGE电泳分析显示诱导菌在52ku处出现一条明显的蛋白带,与预期分子量相符。结论成功构建PET30a—ROP2,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达,为进一步研究弓形虫粘附关键蛋白基因与肠上皮细胞的关系奠定基础。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导BALB/c小鼠的保护力观察

目的 探讨多房棘球绦虫(Em)重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫后对受攻击感染BALB/c小鼠的囊重和抗体及其亚类的影响. 方法 将5×106克隆形成单位(CFU)和5×105CFU疫苗分别采用皮下注射和鼻腔内接种免疫BALB/c鼠1次,免疫后8周每鼠用50个Em原头节攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,分离泡球蚴并称重,计算囊重抑制率;收集鼻腔内接种组鼠血清,测定IgG及其亚类和IgE水平.试验设有空载体、卡介苗(BCG)和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组. 结果 疫苗皮下注射和鼻腔内接种组小鼠的囊重抑制率分别为82.35%和59.41%;疫苗鼻腔内接种组攻击后18周的鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgE水平均较接种前高(P＜0.05或P＜0.01),吸光度(A490)值分别为0.090±0.006、0.026±0.002、0.024±0.003和0.031±0.019,IgG1和IgG3水平低于接种前(P＜0.05或P＜0.01),A490值分别为0.042±0.011和0.156±0.004. 结论 多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗可诱导小鼠产生较强的保护力,表现为血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgE水平升高和棘球蚴生长受抑制.     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ／3和BCG-Era14-3—-疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的动态观察

目的动态观察多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ／3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的变化。方法将混合疫苗采用鼻腔内接种免疫BALB／c鼠，在免疫后0、2、4、6、8和10周各剖杀4只小鼠，取脾，分离脾细胞，用EmAg或ConA刺激培养，收集脾细胞培养上清液，测定IL-2、IFN-7、TNF-α和IL-4水平。试验设有PBS对照。结果疫苗接种组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4分别在免疫后2～10周、4～8周、6～10周和4～6周升高，分别在免疫后6、6、8和4周达最高水平，含量分别为10．0pg／ml、（75．0&#177;6．6）pg／ml、（245．0&#177;83．0）pg／ml和（187．5&#177;16．5）pg／ml。结论多房棘球绦虫混合重组BCG-EmII／3和BCG-Em14—3—3疫苗在免疫早期（2～8周）即可诱导小鼠产生TH1和TH2混合型免疫反应。     

结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究

目的构建结核分枝杆菌（MTB）重组质粒pGEX-ESAT-6，分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达效率。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因；将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因的高效原核表达载体pGEX-1λT，经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6／GST融合蛋白；SDS—PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出288bp的ESAT-6基因；双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中，构建了pGEX—ESAT-6穿梭表达载体。SDS—PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35ku，表达效率为20％，Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别。结论结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达，表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获Sj26GST和Sj32抗原编码基因;采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因;将融合基因克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32并转化大肠埃希菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1 991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pQE30中,SDS-PAGE显示表达产物为分子质量单位约为61 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的18%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾T细胞亚群的动态观察

目的动态观察多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾T细胞亚群的变化。方法将疫苗采用鼻腔内接种方法免疫BALB/c鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周各剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比,同时设PBS对照。结果疫苗接种组小鼠脾CD4+和CD8+T细胞亚群分别在免疫后2～12周和2～18周开始升高,分别在免疫后6和10周达最高水平,百分比分别为32.0%±1.6%和8.4%±0.8%。结论CD4+和CD8+T细胞亚群在多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导的小鼠抗Em原头节攻击感染的保护性免疫机制中起关键作用。     

多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究

目的探讨多房棘球绦虫重组BCG-Em14—3—3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群数量和比值的变化。方法将疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB／c鼠．免疫后8w用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染，感染后18w杀鼠取脾，分离脾细胞。流式细胞仪检测脾CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞亚群的百分比．同时设有空载体、BCG和PBS对照。结果疫苗接种组的脾CD8^＋T细胞亚群显著增加．CD8^＋T细胞亚群无明显变化．CD4^＋／CD8^＋亚群比值明显升高；鼻腔内接种组的CD4^＋和CD4^＋／CD8^＋亚群比值显著高于皮下注射组。结论CD8^＋T细胞亚群在多房棘球绦虫重组BCG-Em14—3—3疫苗诱导的小鼠抗Em原头节攻击感染的保护性免疫机制中起关键作用，疫苗鼻腔内接种是一种较好的免疫途径。     

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和IgE的动态观察

目的动态观察多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和IgE的变化。方法将疫苗采用鼻腔内接种方法免疫BALB/c鼠,免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周各剖杀4只小鼠,眼球取血,常规ELISA测定血清IgG及其亚类和IgE水平,同时设有PBS对照。结果疫苗免疫组的血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均在免疫后2~18周升高,分别在免疫后10、4和4周达最高水平,ELISA A值分别为0.097±0.030、0.024±0.003和0.022±0.003;血清IgG1和IgE水平均在免疫后2~18周显著降低,分别在免疫后4周和18周达最低水平,A值分别为0.022±0.005和0.181±0.011;血清IgG3水平在免疫后10~12周增加,在免疫后12周达最高水平,A值为0.212±0.008。结论多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗在免疫早期即可诱导小鼠产生一个TH1型保护性免疫反应。     

蛔虫抗菌肽Cecropin P1基因在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的设计合成蛔虫抗菌肽基因序列,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,以获得重组蛋白。方法根据大肠埃希菌对编码同种氨基酸不同密码子的偏嗜性,对蛔虫抗菌肽Cecropin P1编码基因进行改造,人工合成目的基因,克隆到原核载体PMD-18T,并转化DH5α感受态菌株;构建重组质粒PET-30a-Cecropin P1,并转化BL21感受态菌株;用双酶切鉴定阳性克隆;含有正确重组质粒的阳性菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果PCR扩增及构建的两个重组质粒双酶切鉴定,均获得113bp的基因片段,与预期大小一致;SDS-PAGE电泳分析显示,含有重组质粒PET-30a-Cecropin P1的阳性菌株在IPTG诱导下高效表达了分子质量单位为3.4ku的蛋白质。结论成功构建了重组质粒PET-30a-Cecropin P1,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中以包涵体形式高效表达,为进一步研究蛔虫抗菌肽的生物学活性奠定了基础。