优化甲硫氨酸补料策略提高重组毕赤酵母G12-CBS合成S-腺苷甲硫氨酸

重组毕赤酵母G12CBS经代谢工程改造,可高效表达重组S腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶,并弱化了SAM转化途径的关键酶β胱硫醚合成酶,是一株优良的SAM高产菌。为了利用G12CBS高效合成SAM,需对前体（甲硫氨酸）的补料策略进行优化。首先在摇瓶中考察了不同甲硫氨酸（LMethionine,LMet）添加量对于G12CBS的影响,发现每24 h LMet补加量超过3 mg/mL时,会影响重组菌生长和SAM合成。在15 L发酵罐中优化LMet的补料速率,当外源补料速率为0.4 g/(L·h)时SAM产量最高,分别比补料速率为0.2 g/(L·h)和0.6 g/(L·h)时提高22.2%和31.8%,达到13.01 g/L,比出发菌最高产量提高54%。代谢物及酶活测定的结果表明,较低的LMet补料速率（0.2 g/(L·h)）导致前体供应不足而影响SAM合成,过高的补料速率（0.6 g/(L·h)）可能会抑制三羧酸循环,并且影响氮源的摄取和利用,从而导致菌体生长和产物合成受到抑制。     

甲醇浓度和VHb蛋白表达对重组毕赤酵母生产SAM的影响

以插入AOX1启动子调控S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶/VHb表达单元的重组毕赤酵母为对象,研究了甲醇浓度及vgb表达对茵体生长、SAM产量及SAM合成酶活力的影响,同时也考察了vgb表达对胞内ATP含量及细胞活性的影响.结果表明:甲醇浓度(?(CH3OH))由0.008提高至0.016后,可提高菌体浓度、SAM产量及单位菌体SAM含量;当?(CH3OH)=0.024时,SAM产量及单位菌体SAM含量与?(CH3OH)=0.016时相当,而菌体浓度稍低于?(CH3OH)=0.016时,高于?(CH3OH)=0.008时的菌体浓度.提高甲醇浓度导致SAM合成酶活力降低,细胞死亡率增加,说明在所考察的重组菌中SAM合成酶的活性并不是SAM合成的限制因素.在上述3种甲醇浓度时,透明颤菌血红蛋白VHb表达都改善了细胞活性,并在较高甲醇浓度(0.016和0.024)时提高了胞内ATP含量.     

重组精氨酸脱亚胺酶原核表达与纯化的初步研究

目的:探讨重组精氨酸脱亚胺酶高效可溶性表达方法。方法:将恶臭假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ACR)和乳酸链球菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)基因(acr和adi)分别克隆至表达载体pET24a和pET28b,转化至大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导重组蛋白表达,镍柱纯化后SDS-PAGE法检测蛋白纯度。结果:pET28b-adi重组子在Rosetta菌株中表达大量的可溶性目的蛋白,分子量约46kDa。结论:以pET28b为表达载体,在大肠杆菌Rosetta菌株中高效表达了可溶性的乳酸链球菌来源的精氨酸脱亚胺酶。     

枯草芽孢杆菌ATCC21216腺苷磷酸化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增枯草芽孢杆菌ATCC21216(His-)编码腺苷磷酸化酶的基因deoD(0.7 kb),测序表明与枯草芽孢杆菌168的deoD同源性为98.7%。将此基因插入质粒pET28a( )(5.3 kb)中,重组质粒pETdeoD在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达,表达量占总蛋白的27%。以HPLC方法测定腺苷磷酸化酶的比酶活为每毫克蛋白0.151 U。     

巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组和表达研究

目的运用聚合酶链反应技术从巨大芽孢杆菌中获得葡萄糖脱氢酶基因，并表达该基因。方法根据巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因两端序列设计引物，通过PCR获得该基因，与表达载体pET22b连接后转化至大肠杆菌JM109（DE3）进行诱导表达。结果重组基因表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定显示特异性奈带，并且酶活力达15u／mL，比活力为10u／mg。结论运用基因工程手段获得了葡萄糖脱氢酶基因，经诱导获得了较高产量的葡萄糖脱氢酶。     

酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌 ,为酶促转化法生产S 腺苷甲硫氨酸奠定基础。方法　应用PCR技术从S 腺苷甲硫氨酸高产酿酒酵母染色体DNA中扩增得到S 腺苷甲硫氨酸合成酶基因sam2 ,将其克隆至表达载体pT7 7,转化大肠杆菌 ,1%琼脂糖电泳比较大小 ,筛选重组子。结果　SDS PAGE显示重组菌S 腺苷甲硫氨酸合成酶亚基分子量约为 4 2KDa ,平均表达量约占菌体总可溶性蛋白的 4 2 % ,酶活达到 14 .1U/g湿菌体 ,比宿主菌酶活提高 15 .7倍。结论　酿酒酵母SAM合成酶基因在大肠杆菌中高效表达 ,重组菌已具有初步的工业化应用价值     

促红细胞生成素载体的构建、分离纯化及其活性检测

目的 为了进一步考察促红细胞生成素(EPO)的组织保护作用,构建了高效表达人源性EPO (rhEPO)的原核表达载体,并通过小鼠体内实验考察了其捉红细胞生成活性.方法 构建原核表逸载俸pET30b(+)-rhEPO;转化至大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达重组转化子菌株;Ni-NAT亲和层析纯化融合蛋白;利用网织红细胞指数考察融合蛋白在小鼠体内的促红细胞活性.结果 成功构建pET30b(+)-rhEPO重组子;实现了在原核生物中的表达;纯化后的融合蛋白达到了电泳级纯;其相对分子质量与理论值相符,原核表达的融合蛋白能够显著提高小鼠体内网织红细胞数,可溶性融合蛋白和包涵体蛋白比活性分别是应用化学科1 059.63、727.94 U/mg.结论 构建和表达重组载体pET30b(+)-rhEPO,表达的目的蛋白经分离纯化后具有体内生物学活性,为进一步的功能研究奠定基础.     

重组巴氏杆菌透明质酸合成酶的克隆、表达及活性鉴定

目的： 构建重组巴氏杆菌透明质酸合成酶(rPmHAS)原核表达系统,获取高纯度、有活性的rPmHAS。方法： 利用大肠杆菌BL-21 pET32a(+)表达重组蛋白,镍亲和柱纯化,夹心竞争ELISA法检测酶活性。结果： Western blotting 检测显示特异性条带,重组蛋白正确表达,镍亲和柱纯化后得到重组蛋白的纯度可达90%。结论： 成功构建了pET32a(+)/rPmHAS重组质粒并实现了目的蛋白高效可溶表达,为PmHAS性质相关研究及单一相对分子质量寡聚透明质酸的合成奠定了基础。     

抗菌肽CM与血管内皮生长因子VEGF_(121)在大肠杆菌中表达及鉴定

目的：构建和表达人VEGF121的基因工程菌,为肿瘤血管的靶向治疗提供实验数据。方法：通过PCR引物延伸的方法,获得SUMO-CM-VEGF121融合基因;将该融合基因与原核表达载体pET22b连接后转化至Rosetta-gami(DE3)宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达。将融合蛋白经DEAE阴离子交换层析、Ni-NTA和分子筛等方法进行纯化,用SUMO酶切除分子伴侣SUMO后,最终获得融合蛋白CM-VEGF121。结果：DNA测序,设计合成的SUMO-CM-VEGF121融合基因为774 bp;所构建的表达菌株Rosetta-gami(DE3)/pET22b-SUMO-CM-VEGF121在20℃诱导24 h可溶性最好,其可溶性表达为菌体可溶性蛋白的21%。Western blotting检测该表达产物与人VEGF单克隆抗体具有特异性结合能力。结论：原核表达载体pET22b和Rosetta-gami宿主菌为CM-VEGF121最合适的条件,解决了其表达量低和不可溶问题。     

提高酵母S-腺苷甲硫氨酸表达量的研究

目的 介绍S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)在Saccharomyces cerevisiae中的合成代谢机制和利用代谢工程改变酵母细胞的相关代谢途径,提高细胞SAM表达量,以及通过发酵工艺调控,提高SAM产率的有关研究进展.方法 对近年来的相关研究报道与成果进行综合分析.结果与结论 代谢工程与微生物发酵工艺调控相结合的方法,是提高酵母SAM表达水平的切实有效的途径.     

VEGF与SUMO在大肠杆菌中融合高效表达及纯化

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）与小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）融合并转入大肠杆菌B121中进行VEGF的可溶性高效表达。方法采用PCR扩增方法,获得编码VEGF与SUMO融合蛋白的DNA片段并插入表达载体pET3c中,构建重组表达载体pET3c—SUMO—VEGF,转化到大肠杆菌BL21中,获得重组菌株BL21／pET3c—SUMO—VEGF。以IPTG为诱导剂,对阳性重组菌株的诱导表达参数如诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间等进行优化。结果融合蛋白的最佳表达条件为当OD600约0．6时,加入0．5mMIPTG,20℃诱导24h,获得了纯度达70％以上的SUMO—VEGF。结论通过融合表达。解决VEGF独立表达时表达量低和可溶性差的问题,使其商业化的步伐进一步加快。     

酿酒酵母无机焦磷酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其意义

目的：利用大肠杆菌表达酿酒酵母无机焦磷酸酶(Y-IPPA),获得具有活性的酿酒Y-IPPA。方法:以酿酒酵母基因组为模版,通过查询NCBI获得酿酒酵母无机焦磷酸酶序列,设计引物,用PCR方法获得酿酒Y-IPPA基因序列,插入克隆性载体pMD19-T Simple Vector中,并转化至大肠杆菌DH5α扩增,获得重组质粒,经酶切及测序验证正确后,将酶切的目的片段插入到原核表达载体p ET28(a)中,再转化大肠杆菌DH5α扩增,经酶切及测序验证正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达蛋白,通过IPTG诱导表达出Y-IPPA,以金属离子亲和层析蛋白纯化系统纯化蛋白,并测定其比活和酶学性质。结果：获得与pMD19-T Simple Vector一致的Y-IPPA碱基序列,构建了重组表达质粒pET28(a)-Y-IPPA,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导并进行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为32 000处可见Y-IPPA蛋白条带;镍柱亲和层析纯化目的蛋白,其中一组的蛋白浓度、活性和比活分别为0.312 g.L^-1、31.13 units.mL^-1和99.73 uints.mg^-1。结论:成功制备Y-IPPA蛋白,为进一步研究其酶学性质奠定了基础。     

可溶性重组人IL23R-CHR在大肠埃希菌中的表达、纯化及活性研究

利用人白细胞cDNA文库体外扩增获得hIL23R-CHR目的基因,克隆至原核表达载体pET22b/pET28a/pET32a,转化BL21(DE3)宿主菌,并对工程菌的表达方式(直接表达、可溶性标签融合表达、分泌表达及包涵体表达)及表达量进行比较,确立pET 32a为表达载体,经IPTG诱导表达后通过镍亲和柱分离纯化融合蛋白Trx-IL23R-CHR,肠激酶4 ℃酶切Trx-IL23R-CHR分子24 h,上镍柱进行二次纯化,获得纯度达90%以上的rhIL23R-CHR分子。亲和力实验证实:原核重组表达的hIL23R-CHR与hIL23在物质的量比为1∶1时可以有效结合,小脑HE病理切片提示rhIL23R-CHR分子对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型鼠有一定的保护作用。     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET2a相匹配的酶切位点,插入载体pET2a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果 该基因在原核表达系统中经诱导,得到了M_r1000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B6感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.     

Soluble expression and characterization of the immunoreactive multiepitope antigen of Toxoplasma gondii in E.coli]

OBJECTIVE: To obtain soluble expression product of immunoreactive recombinant multiepitope antigen of Toxoplasma gondii from E.coli. METHODS: The gene encoding the multiple epitopes (MEG) of Toxoplasma gondii was amplified by PCR from the original plasmid containing MEG gene and cloned into the prokaryotic soluble expression vector pET32a. After identification by enzyme digestion and sequencing, the positive recombinant plasmid pET32a-MEG was transformed into BL21(DE3), which was induced with IPTG for expression of the target antigen. The relative molecular mass, solubility and antigenicity of the expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. RESULTS: The recombinant expression plasmid pET32a-MEG was successfully constructed and the highly efficient expression of the antigen was achieved after IPTG induction of E.coli. Improvement of the induction condition increased the expression product which accounted for about 28% of the total bacterial protein. The target protein, with good solubility and a relative molecular mass of about 31 000, was purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and could be well recognized by mouse and rabbit antisera derived by infection of the animals with Toxoplasma gondii B36 and RH, respectively. CONCLUSION: The recombinant multiepitope antigen has good antigenicity and potential value in diagnosis and vaccine development of toxoplasmosis.     

人单链白细胞介素12的原核表达和生物学活性鉴定

目的构建含人单链白细胞介素12(hscIL-12)基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达具有活性的hscIL-12。方法 PCR法从质粒pCA13-hscIL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建原核表达载体pET28a(+)-hscIL-12,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌液进行蛋白质印迹分析,经镍柱亲和层析(Ni2+-NTA)纯化,体外增殖实验检测其生物学活性。结果 PCR扩增、双酶切及DNA序列测定证实pET28a(+)载体上成功插入了hscIL-12基因片段。表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明其相对分子质量为70×103;蛋白质印记表明重组蛋白具有hscIL-12抗原活性;表达产物纯化、复性后进行体外生物学活性实验表明,该重组蛋白能刺激外周血单核细胞(PBMC)产生IFN-γ。结论 pET28a(+)-hscIL-12原核表达载体的构建和重组hscIL-12蛋白的制备为进一步研究hscIL-12生物学功能和临床应用奠定了基础。     

猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的克隆与高效可溶性原核表达

目的克隆猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因,并进行高效可溶性原核表达。方法利用PT-PCR从猪囊尾蚴中获得cC1编码基因,T-A克隆后,将cC1插入原核表达载体pET28a中,经酶切、测序鉴定后将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,表达的融合蛋白Ni+-亲和层析柱纯化后经快速液相蛋白层析分离系统检测其纯度。采用SDS-PAGE和Western-blotting对目的蛋白进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出的片段长度为1056bp,构建的重组表达质粒经PCR、酶切验证,和预期的结果一致,测序鉴定与Genbank中cC1基因相比于423位存在1个同义突变。转化有重组质粒的E. coli BL21(DE3)经过0.05mmol/LIPTG 37℃诱导6h高效表达了占菌体蛋白总量60%的可为囊虫病患者血清识别的相对分子质量约为40000的可溶性融合蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化后纯度达94%。结论成功克隆并高效可溶性原核表达了猪囊尾蚴期特异性抗原cC1,为其进一步研究和应用奠定了基础。     

葡萄球菌核酸酶的制备及性质研究

为获得纯度较高的葡萄球菌核酸酶(SNase)以研究其与糖尿病的关系,构建基因工程表达菌E.coli BL21/pET28a-His-SNase,诱导其表达可溶性胞外蛋白,并对纯化的SNase进行初步性质研究。采用分子生物学方法设计和构建含有SNase基因的表达载体pET28a-His-SNase,再转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞。经过乳糖诱导表达、超声破碎及镍柱亲和色谱等纯化步骤后,以SDS-PAGE和Western blot鉴定His-SNase,并对其性质进行了初步研究。结果表明,乳糖诱导后His-SNase能高效表达,亲和色谱后纯度高达85%以上,且其具备较高的核酸酶活性,作用pH范围较广,有很好的耐热性。本研究为进一步探究葡萄球菌核酸酶与糖尿病的关系奠定了基础。     

日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位的发现与克隆

目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位（proteasome activatorPA28 subunit,PA28）cDNA克隆到表达质粒pET32a（+）上,为下一步对该基因进行功能研究做准备。方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTx程序搜索,发现该插入cDNA序列所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源。根据表达质粒pET32a（+）上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjPA28基因导入原核可溶性表达质粒pET32a（+）中。结果所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白的同一性达41％,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoRI/XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论本研究所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源,并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a（+）-SjPA28。