HIF-1α基因沉默对大鼠肝癌CBRH-7919细胞p27和Ki67表达的影响

目的: 探讨沉默缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因对大鼠肝癌CBRH-7919细胞在缺氧状态下p27和Ki67表达的影响。方法: 选用大鼠肝癌细胞株CBRH-7919作为研究对象,利用氯化钻(CoCl₂)模拟缺氧状态。构建HIF-1α siRNA特异性载体,利用小分子RNA干扰技术沉默肝癌细胞HIF-1α基因。应用real-time RT-PCR和Western blotting方法分别检测肝癌细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达变化,用Western blotting方法检测肝癌细胞 p27和Ki67 蛋白的表达变化。应用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果: 在缺氧条件下,肝癌细胞HIF-1α mRNA及蛋白表达显著增多(P<0.05)。HIF-1α基因被沉默后,HIF-1α mRNA和蛋白表达以及Ki67蛋白表达量明显减少(P<0.05),p27蛋白表达量显著增多(P<0.05)。转染组G₀/G₁期的肝癌细胞数量明显多于对照组,S期细胞显著减少(P<0.05)。 结论: 缺氧可以诱导肝癌细胞HIF-1α的表达;特异性siRNA沉默HIF-1α,可能通过促进p27的表达和抑制Ki67的表达,在一定程度上抑制了肝癌细胞的增殖。     

上调SMYD3对人胆管癌FRH0201细胞中DNMT3B表达及细胞增殖的影响

目的: 研究人胆管癌细胞株FRH0201中SET和MYND结构域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3)过度表达对DNA甲基化转移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)表达及细胞增殖能力的影响。方法: 瞬时转染SMYD3真核表达质粒后, RT-PCR检测细胞中DNMT3B mRNA水平的变化;Western blotting检测细胞中DNMT3B蛋白水平的变化;CCK-8检测细胞增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞周期的改变。结果: 以未处理组为对照,胆管癌细胞FRH0201在转染pEGFP-C3-SMYD3质粒后,DNMT3B蛋白及mRNA表达均显著上升(P<0.01);细胞的增殖能力显著提高、细胞增殖速度加快(P<0.05);进入G₂/M期的细胞明显增多(P<0.05)。结论: 过度表达SMYD3,可引起细胞中DNMT3B的表达上调并增强细胞增殖能力。     

人着色性干皮病D组基因对白细胞介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的: 探讨人着色性干皮病D组基因(XPD)对白细胞介素-6(IL-6)促进人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响。方法: 用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空质粒pEGFP-N2稳定转染VSMCs,然后给予1×10⁵ U/L IL-6孵育48 h。实验分为6组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)IL-6组;(5)IL-6 + pEGFP-N2组;(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wt-P53)表达量的变化。结果: 在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(P<0.05),并能抑制IL-6促进VSMCs增殖的作用(P<0.05);流式细胞仪结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了细胞G₀/G₁期增加(P<0.05)、S期减少(P<0.05)、凋亡率增加(P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs G₀/G₁期减少、S期增加、凋亡率降低的作用(P<0.01);RT-PCR和Western blotting检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(P<0.05或P<0.01),同时Bcl-2表达降低,Bax和wt-P53表达增高(P<0.05或P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs的Bcl-2表达增高、Bax和wt-P53表达降低的作用(P<0.05或P<0.01)。结论: XPD能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMCs增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。     

siRNA下调astrocyteelevatedgene-1对神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的: 探讨siRNA下调astrocyte elevated gene-1( AEG-1 )表达对神经母细胞瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法: 用设计合成的AEG-1 siRNA转染神经母细胞瘤细胞株M17和SK-N-SH,采用荧光定量RT-PCR技术观察AEG-1 siRNA对 AEG-1 基因表达的影响;用MTT法和克隆形成实验观察AEG-1 siRNA对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制作用;用流式细胞术检测下调 AEG-1 表达对神经母细胞瘤细胞凋亡及细胞周期的影响。结果: 用AEG-1 siRNA转染人神经母细胞瘤细胞,RT-PCR结果证实AEG-1 siRNA能显著基因下调 AEG-1 表达,与对照组相比有显著差异(P<0.01);MTT法和克隆形成实验结果证明下调 AEG-1 表达可显著抑制神经母细胞瘤细胞的增殖;流式细胞术检测结果表明下调 AEG-1 表达可促进神经母细胞瘤细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G₀/G₁期。结论: AEG-1 siRNA可下调基因在神经母细胞瘤细胞中表达,并抑制神经母细胞瘤细胞增殖,促进细胞凋亡。     

致癌性微小RNA-106a对正常胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞生长的影响

目的: 探讨微小RNA-106a(miR-106a)是否具有致癌特性。方法: 用脂质体把miR-106a类似物转染到正常胃黏膜上皮细胞GES-1中,然后用MTT方法检测该细胞的增殖情况。用脂质体把miR-106a抑制剂转染到胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中,然后分别用流式细胞术和Western印迹方法检测细胞周期分布和细胞周期相关蛋白表达的变化;最后观察裸鼠胃癌移植瘤的生长情况。结果: miR-106a类似物以剂量依赖方式促进正常胃黏膜上皮细胞的增殖。miR-106a抑制剂通过抑制细胞周期素依赖的蛋白激酶(CDK)1和CDK2的表达阻滞MGC-803细胞于G₀/G₁期和G₂/M期,而通过抑制CDK1的表达阻滞SGC-7901于G₂/M期。动物实验结果显示,miR-106a抑制剂以剂量依赖方式抑制肿瘤的生长。结论: miR-106a可能参与了胃癌的发生过程。     

干扰素诱导蛋白p204表达变化对大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响

目的: 观察干扰素诱导蛋白p204对鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及p21表达的影响,探讨p204在VSMCs增殖调控中的作用及可能机制。方法: 应用干扰素 α(IFN-α)处理和p204基因( Ifi204 )的小干扰RNA(siRNA)瞬时干预体外培养的VSMCs,用MTT法测定细胞活力反映细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期,用半定量RT-PCR 法和Western blotting 分别检测p204和p21的mRNA和蛋白表达。结果: IFN-α可诱导鼠VSMCs p204 mRNA和蛋白表达上调,降低VSMCs细胞活力和细胞周期G₁/S转换,伴p21 mRNA和蛋白表达上调。转染 Ifi204 siRNA可抑制p204和p21表达,提高VSMCs细胞活力和促进细胞周期G₁/S转换。结论: p204表达可抑制鼠VSMCs的增殖,该效应可能与激活p21表达有关。     

siRNA沉默LBH基因促进人支气管上皮细胞周期进展

目的: 利用合成的小分子干扰RNA(siRNA)转染人支气管上皮细胞16HBE,观察LBH(limb-bud and heart) 基因表达下调对16HBE细胞周期及相关基因表达的影响。方法: 脂质体2000转染靶向LBH 基因的siRNA到16HBE细胞,荧光定量RT-PCR检测siRNA转染后LBH基因表达,流式细胞术检测LBH基因沉默后16HBE 细胞周期的改变,荧光定量RT-PCR及Western blotting检测LBH基因沉默后细胞周期素E1和E2表达水平。结果: 50 nmol/L siRNA转染16HBE细胞48 h后, LBH基因的表达水平只有对照组的14%;siRNA转染16HBE细胞48 h,其G₁期细胞百分率比对照组减少9.28%,而S期细胞百分比增加14.08%;16HBE细胞在50 nmol/L siRNA的转染后,细胞周期素E2的表达水平为对照组的2倍,而细胞周期素E1的表达没有发生明显改变。结论: 靶向于LBH基因的siRNA能有效沉默16HBE细胞中LBH基因的表达,LBH基因的表达下调促进了16HBE细胞周期G₁/S期的进展;细胞周期素E2的表达上调参与了LBH沉默导致的细胞周期G₁/S期的进展。     

人Gax基因转染对血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

目的: 探讨腺病毒介导人生长终止特异性同源异型盒基因(hGax基因)转染对血清刺激后兔血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和细胞周期的影响,为静脉桥再狭窄基因治疗新策略提供帮助。方法: 构建含 hGax 的重组腺病毒载体并感染兔VSMCs;应用RT-PCR、免疫荧光染色检测hGax mRNA和蛋白的表达; MTT法观察hGax基因过表达对血清刺激后VSMCs增殖的影响;划痕法测定细胞迁移;流式分析细胞周期。结果: 成功构建Ad5-hGax重组腺病毒载体。转染48 h后 RT-PCR和免疫荧光染色法示转染 hGax 基因的VSMCs中存在目的基因特异性片段(174 bp)和目的蛋白表达;MTT法示hGax蛋白显著抑制血清刺激后VSMCs增殖;划痕法示hGax基因过表达明显抑制血清刺激后VSMCs迁移;流式结果示血清刺激72 h后,Ad5-hGax转染组G₀/G₁期细胞比例明显增加,G₂/M+S期细胞减少。结论: 含hGax的重组腺病毒载体构建成功,并在细胞中过表达。hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖和迁移,并使细胞停滞于G₀/G₁期。     

IGFBP7对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制

目的: 探究胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其分子生物学机制。方法: 将质粒pCMV6-IGFBP7转染MCF-7细胞,构建稳定表达IGFBP7的MCF-7细胞系;采用Western blotting检测IGFBP7在MCF-7细胞稳定转染子的表达;采用软琼脂培养克隆形成实验检测IGFBP7对MCF-7细胞克隆形成能力的影响;采用流式细胞术检测IGFBP7对MCF-7细胞周期的影响;采用Western blotting检测IGFBP7对MCF-7细胞细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p-ERK1/2、细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)、cyclin E、CDK2、p21^CIP1/WAF1、p27^KIP1、p53、视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)和p-Rb蛋白含量的影响。结果: (1)只有稳定转染质粒pCMV6-IGFBP7的MCF-7细胞表达IGFBP7。(2)IGFBP7能够显著降低MCF-7细胞的克隆形成率(P<0.01),阻止细胞从G₁期进入S 期,使其停滞于G₁期(P<0.01)。(3)IGFBP7能够显著抑制ERK1/2的磷酸化(P<0.01)。(4)IGFBP7能够下调cyclin D1和cyclin E蛋白表达(P<0.01),上调p27^KIP1、p21^CIP1/WAF1和p53蛋白表达(P<0.01),抑制Rb的磷酸化(P<0.01)。(5)MEK1/2阻断剂PD98059可部分模拟IGFBP7的肿瘤抑制效应。结论: (1) IGFBP7可通过下调cyclin D1和cyclin E蛋白表达,上调p27^KIP1、p21^CIP1/WAF1和p53蛋白表达,以及抑制Rb磷酸化发挥抗肿瘤作用;(2) IGFBP7对cyclin D1和p27^KIP1的调节可能与其抑制ERK1/2信号通路有关。     

洛伐他汀诱导人子宫内膜癌JEC细胞G1 期同步化的研究

目的: 探讨洛伐他汀(Lov)诱导人子宫内膜癌JEC细胞G₁期同步化的方法及JEC细胞解除G₁期同步化后的细胞周期进程。方法: CCK-8法测定JEC细胞的倍增时间,采用10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L的Lov,作用1×细胞倍增时间进行流式细胞术检测G₁期细胞的比例,获得G₁期同步化的最佳Lov浓度;采用最佳浓度作用JEC细胞,于作用后的0.5×倍增时间~2×倍增时间内,每隔4 h检测同步化程度,获得最佳浓度Lov作用下的最佳同步化时间;解除G₁期同步化,每隔4 h检测一次,研究JEC细胞解除G₁期同步化后的细胞周期进程。结果: CCK-8法检测显示JEC细胞的倍增时间约为24 h;JEC细胞的最佳G₁期同步化条件为:20 μmol/L Lov作用24 h,可获取G₁期细胞(85.00±0.79)%;JEC细胞于解除G₁期同步化后16 h,获得最大量的S期细胞,为(45.28±0.53)%;同时G₁期细胞比例达到最低,为(35.93±0.44)%。结论: 20 μmol/L Lov作用24 h,可获得大量G₁期细胞;解除G₁期同步化后16 h,S期细胞比例最高,G₁期细胞比例达到最低,达到满意的G₁期同步化释放后效果。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对HepG2细胞生长周期的影响

目的: 构建丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-core-1b)真核重组质粒,获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,观察HCV-core-1b对HepG2细胞株生长周期及cyclin D1 和pRb/p130表达的影响,探讨丙型肝炎病毒慢性感染的可能机制。方法: 将HCV-core-1b亚克隆入pBabe-Flag-puro载体,获得重组质粒pBabe-Flag-HCV-core-1b;将重组质粒转染病毒包装细胞Pheonix 293T,筛选获得分泌HCV-core-1b的病毒包装细胞株。利用包装细胞产生的病毒上清感染靶细胞,筛选后获得稳定表达HCV-core-1b的HepG2细胞株,流式细胞仪检测靶细胞生长周期的变化,Western blotting检测cyclin D1 和pRb/p130蛋白的表达。结果: 基因测序确认HCV-core-1b亚型基因编码区完整无移位,与标签蛋白Flag形成融合蛋白。HepG2-HCV-core细胞株成功表达Flag-HCV-core-1b蛋白,并导致细胞cyclin D1 和 pRb/p130的水平下调,显著改变了HepG2细胞生长周期,使细胞阻滞在G₀/G₁期。结论: 成功构建了pBabe-Flag-HCV-core-1b真核表达质粒,获得稳定表达Flag-HCV-core-1b融合蛋白的HepG2细胞。由于HCV-core-1b蛋白的表达,下调了HepG2细胞 cyclin D1和pRb/p130的表达,显著抑制HepG2细胞生长周期。     

反义Bmi-1 RNA转染对人肺癌细胞株A549体外增殖的影响

目的 研究转染反义Bmi-1 RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响.方法 将表达反义Bmi-1 RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株,GA18筛选挑取阳性克隆.应用即时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达;应用MTT比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力;用PI单染及Annexin-V-PI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况.结果 Western blot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95%;MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目(0.67±0.50)明显低于未转染组(73.0±4.1)及转染空质粒组(67.0±4.0,P<0.01);流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G_0/G_1期,但对细胞凋亡没有影响.结论 反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0/G1期实现的.     

STK15过表达对人食管癌细胞株KYSE150生长的影响

 目的：探讨丝氨酸／苏氨酸激酶15 (serine/threonine kinase 15,STK15)过表达对人食管癌细胞株KYSE150生长的影响。方法：采用脂质体法将pEGFP-C1-STK15真核表达载体转染人食管鳞癌细胞株KYSE150,构建STK15过表达的稳定细胞系（GFP-STK15）,通过荧光显微镜和Western blotting检测STK15的表达。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察STK15过表达对体外肿瘤细胞生长的影响。通过流式细胞术分析STK15过表达对细胞周期和凋亡的影响。采用裸鼠致瘤实验观察STK15过表达对体内肿瘤细胞生长的影响。结果：pEGFP-C1-STK15质粒转染细胞后筛选得到稳定克隆,荧光显微镜显示GFP-STK15融合蛋白定位于细胞的中心体以及纺锤体,Western blotting可检测到GFP-STK15 融合蛋白的表达。与对照细胞相比,GFP-STK15细胞系的体外生长能力明显增加;G0/G1期细胞百分率降低,细胞凋亡率减少;GFP-STK15细胞系接种组裸鼠肿瘤明显增大,差异均具有统计学意义（P<0.01）。结论：STK15过表达能促进人食管癌KYSE150细胞的生长,提示STK15将可能成为治疗食管癌的新靶点。     

特异siRNA下调卵巢癌H08910细胞NAC-1基因表达并抑制生长

 目的：研究小RNA干扰NAC-1 (Nucleus accumbens-1,Nac1 or NAC-1)基因表达对卵巢癌HO8910细胞增殖的影响。方法：设计、合成针对NAC-1基因的特异性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体转染HO8910细胞。通过实时荧光定量RT-PCR 和Western印迹法分别检测转染前后HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖率,FCM法检测细胞周期分布。结果：针对NAC-1基因的特异性siRNA均能抑制NAC-1 mRNA和蛋白的表达,其中NAC-1-siRNA-1的沉默效率最高。转染NAC-1-siRNA-1 48h后,HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平分别下调74%和81%,而且细胞增殖明显受到抑制,细胞周期被阻滞于G1期,与转染阴性siRNA 及未转染组比较,有显著性差异(P?0.05)。结论：NAC-1特异性siRNA能够有效沉默NAC-1基因表达,并显著抑制卵巢癌HO8910细胞增殖。     

LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法:应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区,利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA-LKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Western blot检测LKB1和STAT3在A549细胞中的表达变化。通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测获得性表达LKB1基因后肺癌细胞的增殖变化,流式细胞术(FCM)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果:成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系,与转染空白载体组比较,转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G1/G0期比例明显增加,S期比例减少,细胞凋亡率升高;同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。结论:LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。     

Effects of targeted nano-delivery systems combined with hTERT-siRNA and Bmi-1-siRNA on MCF-7 cells

The aim of this study was to evaluate the efficiency of a targeted siRNA nano-delivery system to silence the expression of Bmi-1 and hTERT, and to verify the toxicity of this delivery system in MCF-7 breast cancer cells. The most effective Bmi-1 siRNA and hTERT siRNA sequences were selected using RT-PCR and Western blotting. The polyethyleneimine (PEI)/siRNA nano-condensate was synthesized using PEI and modified using an NGR peptide fragment for targeting to tumor cells. The vector morphology, particle size and zeta potential were observed using an atomic force microscope and a laser particle size analyzer. The MCF-7 breast cancer cell line was transfected with the vector, and cytotoxicity was tested by MTT assays. The transfection efficiency was evaluated by qRT-PCR and Western blotting. Changes in gene expression and apoptosis rate were measured by flow cytometry. The size of LPN carrier and the condensate particle was between 100 and 200 nm and the potentials were close to neutral. There was maximum transfection efficiency and no significant increase in toxicity at 15 pmol/L. Bmi-1 and hTERT expression decreased, but the inhibition rate increased in the hTERT siRNA group, the hTERT+Bmi-1 siRNA group and the hTERT+Bmi-1 siRNA group compared with the scrambled siRNA group and the control group. Moreover, the hTERT+Bmi-1 siRNA group had the highest level of gene silencing. The complex, composed of Lipo, PEI and siRNA, is low toxicity and efficient transfection vectors. The expression level of Bmi-1 and hTERT was decreased by the gene silencing of either Bmi-1 or hTERT, but the effects were more significant when both were silenced simultaneously.     

PRL-2基因转染对肝细胞增殖及细胞周期的影响

目的：研究PRL-2基因对肝细胞增殖和细胞周期的影响。方法:采用脂质体转染的方法将重组质粒稳定转染至正常永生化肝细胞系CL1中，G418筛选阳性克隆。应用实时荧光定量聚合酶链反应、Western印迹和免疫组化分析PRL-2在阳性细胞的表达及蛋白定位，MTT法检测细胞的群体倍增时间，流式细胞仪检测细胞周期变化，Western印迹分析细胞周期素A、D1、E以及周期蛋白依赖激酶抑制因子p16、p21WAF1及p27Kip1的变化,实时荧光定量聚合酶链反应检测p21WAF1mRNA的变化。结果: 成功构建PRL-2真核表达载体pcDNA3-PRL-2。脂质体转染细胞经过G418筛选后,获得稳定表达PRL-2的细胞亚系PRL-2-CL1。经实时荧光定量PCR、Western印迹和免疫组化证实,PRL-2-CL1细胞系PRL-2基因及蛋白表达水平高于对照组，流式细胞仪检测细胞周期S期细胞比例明显增高，MTT法检测细胞群体倍增时间缩短。Western印迹及实时荧光定量聚合酶链反应显示p21WAF1在转染后较对照组明显降低，细胞周期素A、D1、E及p16、p27Kip1无明显变化。结论: 重组PRL-2真核表达载体构建正确,并在永生化肝细胞中获得稳定、高效表达。PRL-2基因具有促进细胞增殖的作用，这种作用与其降低p21WAF1蛋白含量相关。     

siRNA沉默AFP基因对肝癌细胞系 EGHC-9901 增殖的影响

 目的 建立稳定表达AFP-siRNA质粒的肝癌细胞系并探讨对其增殖的影响。方法 构建AFP-siRNA,用脂质体法转染肝癌细胞系,G418筛选4～5周,Western blot 及RT-PCR检测靶基因表达,分组：实验组,转染AFP-siRNA组;阳性对照组,转染空载体组;空白对照组,未处理组。MTT绘制生长曲线,平板克隆实验观察集落形成,流式细胞仪分析细胞周期。结果 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,实验组表达AFP近乎完全抑制;实验组增殖能力显著低于空载体组;实验组＞75μm集落形成数19±2,低于空载体组62±6;实验组G1期细胞数较空载体组提高20％左右。 结论 成功建立稳定表达AFP-siRNA的肝癌细胞系,抑制AFP表达可使肝癌细胞发生G1期阻滞,明显抑制其增殖及集落形成能力。     

CADM1过表达对人胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制

 目的：研究细胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1,CADM1）过表达对人胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭的影响并探讨其可能的分子机制。方法：采用Western blotting检测3株胃癌细胞系中CADM1蛋白的表达。构建pcDNA-CADM1真核表达载体,并将其转染MKN-45细胞,采用G418筛选稳定表达CADM1的细胞株,利用Western blotting鉴定所筛选的稳定细胞株。采用CCK-8试剂和Boyden小室分析过表达CADM1对MKN-45细胞增殖和侵袭的影响。利用Western blotting检测细胞增殖和侵袭相关蛋白表达。结果：MKN-45细胞中CADM1蛋白的相对表达水平显著低于MKN-28和SGC-7901细胞（P<0.05）。此外,成功构建pcDNA-CADM1真核表达载体,并获得稳定过表达CADM1的MKN-45细胞株。CCK-8结果显示,与未处理组和pcDNA3.1组相比,pcDNA-CADM1组中MKN-45细胞的增殖明显受到抑制（P<0.05）。Boyden小室体外侵袭实验结果显示,与未处理组（101.53±6.89）和pcDNA3.1组（98.77±7.03）相比,pcDNA-CADM1组中MKN-45细胞穿膜的细胞数（52.35±3.89）显著减少（P<0.05）。Western blotting结果显示,与未处理组和pcDNA3.1组相比,pcDNA-CADM1组中p21蛋白表达显著上调,而MMP-2和MMP-9表达显著下调（P<0.05）。结论：CADM1过表达能明显抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力,因而CADM1有望成为胃癌治疗的新靶点。     

BCL-2 基因转染的人胃黏膜上皮细胞株GES-1的建立与鉴定

目的构成BCL-2基因表达的人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞模型。方法质粒pcDNA3-BCL-2经酶切鉴定后,以脂质体法转染人胃黏膜上皮细胞GES-1,经G418筛选获得细胞克隆,荧光免疫组化法鉴定BCL-2基因表达阳性细胞。结果经酶切鉴定为携带BCL-2基因的质粒pcDNA3-BCL-2,荧光免疫组化结果显示7个克隆中,均有不同程度的BCL-2基因表达。BCL-2主要表达在胞质及细胞核膜。结论GES-1细胞为BCL-2表达阳性的细胞,为进一步研究BCL-2基因与胃癌的关系提供了理想的细胞模型。