特异siRNA下调卵巢癌H08910细胞NAC-1基因表达并抑制生长

 目的：研究小RNA干扰NAC-1 (Nucleus accumbens-1,Nac1 or NAC-1)基因表达对卵巢癌HO8910细胞增殖的影响。方法：设计、合成针对NAC-1基因的特异性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体转染HO8910细胞。通过实时荧光定量RT-PCR 和Western印迹法分别检测转染前后HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平,MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖率,FCM法检测细胞周期分布。结果：针对NAC-1基因的特异性siRNA均能抑制NAC-1 mRNA和蛋白的表达,其中NAC-1-siRNA-1的沉默效率最高。转染NAC-1-siRNA-1 48h后,HO8910细胞中NAC-1 mRNA和蛋白表达水平分别下调74%和81%,而且细胞增殖明显受到抑制,细胞周期被阻滞于G1期,与转染阴性siRNA 及未转染组比较,有显著性差异(P?0.05)。结论：NAC-1特异性siRNA能够有效沉默NAC-1基因表达,并显著抑制卵巢癌HO8910细胞增殖。     

RNA干扰阻抑Bax inhibitor-1(bi-1)基因表达对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的： 研究RNA干扰(RNAi)效应对人卵巢癌细胞株HO8910PM和HO8910中bi-1基因表达的抑制作用和凋亡诱导作用。 方法： 把表达bi-1 shRNA的各重组干扰质粒转染到HO8910PM和HO8910细胞中,RT-PCR和Western blotting法检测bi-1基因mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术和Hoechst 33258/PI荧光染色检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果：与对照组细胞相比较,转染4种候选干扰质粒组细胞中bi-1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降（P<0.05）,以转染pmU6-b4组细胞的表达抑制率最高,在HO8910PM细胞中的抑制率分别为 (45.50±3.04）%和(51.08±4.96）%,在HO8910细胞中的抑制率分别为 (37.29±3.69）%和(44.96±4.28）%;流式细胞术结果表明,与对照组细胞相比较,转染pmU6-b4质粒24 h、48 h、72 h、96 h的HO8910PM细胞中亚二倍体峰比值明显升高 (P<0.05),以转染72 h组细胞的比值最高,达到 (25.89±5.63）%,而HO8910细胞中无亚二倍体峰出现;荧光显微镜下可见转染pmU6-b4质粒72h的HO8910PM细胞出现细胞核缩小、染色质固缩和核断裂,而HO8910细胞核无明显变化。 结论： 针对bi-1的siRNA能特异有效地下调HO8910PM和HO8910细胞中bi-1基因的表达,不同序列特异性的siRNA下调bi-1基因表达的能力不同;瞬时转染质粒pmU6-b4能有效诱导HO8910PM细胞凋亡,但不能诱导HO8910细胞凋亡。     

卵巢癌中SMS1对细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的探讨沉默神经鞘磷脂合成酶1(sphingomyelin synthase 1, SMS1)对卵巢癌细胞HO8910增殖、侵袭和迁移的影响。方法体外培养卵巢癌HO8910细胞株,设计siRNA-SMS1序列,转染细胞,分为阴性对照组(negative control, NC)、空白对照组(blank control, BC)、siRNA组;利用qRT-PCR技术检测各组细胞SMS1 mRNA相对表达量。MTT法检测HO8910细胞增殖情况、划痕实验检测转染后HO8910细胞迁移能力。Transwell实验检测细胞侵袭能力。薄层层析法检测HO8910细胞中SMS1活性、Cer水平。酸性神经鞘磷脂(sphingomyelin, SM)酶试剂盒、卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)试剂盒分别检测HO8910细胞中SM、PC水平。结果卵巢癌细胞中SMS1 mRMA及蛋白相对表达量比正常卵巢细胞显著升高(P0.05);转染48 h后,siRNA组细胞中SMS1 mRMA及蛋白相对表达量、SMS1酶活性比NC组与BC组均显著降低(P0.05);siRNA-SMS1组A570比BC组与NC组显著降低(P0.05);迁移指数、侵袭细胞数较BC组与NC组显著降低(P0.05);与NC、BC组相比,siRNA组HO8910细胞中SM水平显著降低(P0.05),Cer水平显著升高(P0.05)。结论 SMS1基因沉默可抑制卵巢癌HO8910细胞增殖、迁移及侵袭能力,可能与下调细胞中SM水平、上调Cer水平有关。     

调节Ubc9基因对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响

目的探讨调节Ubc9基因对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的影响,探讨其作用机制。方法应用体外Transwell细胞侵袭实验检测调节Ubc9基因对卵巢癌HO8910细胞侵袭能力影响,以稳定转染Ubc9的HO8910-Ubc9细胞为Ubc9组,对照组为未转染的HO8910细胞(normal)及转染空质粒的HO8910细胞(vector);另以转染Ubc9特异性siRNA的HO8910-Ubc9细胞为siRNA1、siRNA2组,对照组为未被Ubc9特异性siRNA转染HO8910-Ubc9细胞(normal)及转染无关序列RNA的HO8910-Ubc9细胞(negative control)。应用划痕实验观察调节Ubc9基因对卵巢癌HO8910细胞迁移能力的影响。结果 HO8910-Ubc9组穿过Matrigel胶的细胞数量明显高于空白对照组和空质粒组(P0.05),Ubc9-siRNAs转染48h后,HO8910-Ubc9细胞穿过人工基底膜的细胞数目明显低于对照组(P0.05)。HO8910-Ubc9细胞在6、12、24h愈合率明显高于HO8910组(P0.05),转染Ubc9-siRNA的HO8910-Ubc9细胞于划痕后在24h,细胞愈合率明显低于对照组(P0.05)。结论 Ubc9促进HO8910细胞侵袭、迁移,可能成为临床治疗的新靶点。     

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移

目的探讨C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)对卵巢癌细胞增殖和转移的抑制作用。方法 ELISA分别检测卵巢癌患者与健康志愿者血清,SKOV3、3AO和HO8910上皮性卵巢癌细胞与IOSE80正常卵巢上皮细胞培养上清中CTRP6的水平;采用人CTRP6重组蛋白处理高转移性卵巢癌HO8910细胞,ELISA检测HO8910细胞白细胞介素8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)的分泌水平,采用CCK-8法检测细胞增殖、TranswellTM侵袭实验检测细胞侵袭能力;采用CTRP6小干扰RNA(CTRP6 siRNA)或CTRP6抗体处理HO8910细胞,采用CCK-8法检测细胞的增殖能力、细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果CTRP6在卵巢癌患者血清和上皮性卵巢癌细胞培养上清中水平降低;CTRP6重组蛋白处理HO8910细胞48 h后,细胞增殖和侵袭能力显著下降;利用siRNA抑制CTRP6表达后,细胞增殖和迁移能力显著增强;CTRP6抗体处理后,细胞增殖和迁移能力亦显著增强。结论 CTRP6在卵巢癌患者血清和上皮性卵巢癌细胞上清中水平降低;CTRP6可阻断IL-8/VEGF通路从而抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖和迁移。     

苦参素诱导卵巢癌HO8910细胞凋亡的实验研究

目的探讨苦参素对卵巢癌细胞株HO8910的抑制增殖效应及凋亡诱导作用。方法用不同浓度苦参素处理HO8910细胞,采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用,倒置显微镜和电镜观察细胞形态学改变;以及应用流式细胞仪观察细胞凋亡过程中细胞周期的变化。结果随着药物浓度的升高,作用时间的延长,苦参素对HO8910细胞的生长抑制率逐渐增高;在苦参素作用下,HO8910细胞呈凋亡改变,出现凋亡小体。细胞凋亡的同时,细胞周期发生特定的改变,亚G1峰出现,S+G2～M期细胞所占比例组明显增高。结论苦参素能诱导卵巢癌细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞增殖。     

下调ERα36提高他莫昔芬对卵巢癌细胞作用的敏感性

目的探讨新型膜性雌激素受体ERα36在他莫昔芬(tamoxifen, TAM)治疗卵巢癌中的作用。方法转染特异性的siRNA,下调卵巢癌细胞SKOV3、HO8910中ERα36的表达;TAM处理肿瘤细胞后,采用CCK-8、流式细胞术及Western blot等方法检测卵巢癌细胞的增殖、凋亡及相关信号通路关键蛋白的表达。结果 siRNA特异性下调ERα36蛋白的表达;CCK-8检测显示,1μmol/L TAM作用于卵巢癌细胞的抑制率较为适中,故作为后续实验的处理浓度;不同浓度的TAM作用ERα36下调的肿瘤细胞后,与siRNA对照组相比,肿瘤细胞抑制率明显上升(P0.01);下调ERα36表达后,p-Akt蛋白表达显著下降(P0.01),凋亡相关Caspase-3、Bax蛋白表达量显著升高(P0.01),BCL-2蛋白表达显著降低(P0.01)。结论利用特异性siRNA下调ERα36的表达后,可以增强TAM对卵巢癌细胞作用的敏感性。     

三氧化二砷诱导卵巢癌HO8910细胞凋亡

目的探讨三氧化二砷对卵巢癌细胞株HO8910的抑制增殖效应及凋亡诱导作用。方法用三氧化二砷处理HO8910细胞,采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用,倒置显微镜和电镜观察细胞形态学改变,琼脂糖凝胶电泳观察DNA降解,以及应用流式细胞仪观察细胞凋亡过程中细胞周期的变化。结果在三氧化二砷作用下,HO8910细胞呈凋亡改变,DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型的凋亡特征。细胞凋亡的同时,细胞周期发生特定的改变,亚G1峰出现,S+G2~M期细胞所占比例组明显增高。结论三氧化二砷能诱导卵巢癌细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞增殖。     

过表达人tRNA甲基转移酶9样蛋白KIAA1456抑制HO8910PM细胞增殖

目的研究人tRNA甲基转移酶9样蛋白KIAA1456的高表达对HO8910PM细胞增殖及细胞周期的影响。方法利用PCR扩增KIAA1456编码区片段,克隆插入载体Ubi-MCS-EGFP-IRES-puromycin中,构建Ubi-KIAA1456-EGFP-puromycin(LV-KIAA1456)慢病毒表达载体;将慢病毒表达载体包装生成慢病毒颗粒并感染HO8910PM细胞,72 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)在HO8910PM卵巢癌细胞中的表达分布情况;反转录PCR检测HO8910PM细胞中KIAA1456 mRNA水平,Western blot法检测HO8910PM细胞KIAA1456蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期。结果成功构建重组慢病毒表达载体LV-KIAA1456,慢病毒颗粒感染HO8910PM细胞后,细胞中KIAA1456的mRNA和蛋白均高表达。过表达KIAA1456的HO8910 PM细胞增殖能力明显抑制、G1期细胞明显增加。结论过表达KIAA1456显著抑制HO8910 PM卵巢癌细胞增殖,细胞周期阻滞于G1期。     

Caveolin-1与人卵巢癌转移的相关性及其机制的研究

目的探讨窖蛋白-1(caveolin-1)与卵巢癌转移的相关性及其可能的调节机制。方法采用免疫荧光法、蛋白印迹实验及逆转录聚合酶链反应检测人卵巢浆液性囊腺癌高低转移细胞系(HO-8910PM及HO-8910)中caveolin-1基因的表达差异。表皮生长因子(EGF)处理低转移卵巢癌HO-8910细胞后,经上述方法检测caveolin-1基因表达的改变。同时经Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力的改变。结果 caveolin-1在HO-8910细胞中为高表达,在HO-8910PM细胞中为低表达(P0.01)。EGF可明显降低HO-8910细胞中caveolin-1基因的表达(P0.01)并促进细胞侵袭(P0.01)和迁移(P0.05)。结论卵巢癌细胞的侵袭、迁移可能与caveolin-1基因表达下降有关,经由EGF/EGFR的信号很可能是caveolin-1介导的卵巢癌转移抑制的重要调节者。     

AM激活mTOR信号通路对人卵巢癌细胞增殖的影响

目的探讨肾上腺髓质素(Adrenomedullin,AM)通过激活mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)信号途径对人卵巢癌细胞HO8910增殖的影响。方法应用AM及mTOR拮抗剂(雷帕霉素)诱导卵巢癌细胞,CCK8法检测AM及雷帕霉素对卵巢癌细胞增殖的影响,进一步采用Western印迹法,测定AM对mTOR磷酸化的激活作用结果 AM可促进卵巢癌细胞的增殖,并呈剂量依赖关系及受体依赖关系,而这种促增殖作用可被mTOR信号通路的拮抗剂雷帕霉素所抑制;随着AM浓度的增加,卵巢癌细胞mTOR磷酸化水平随之升高。结论AM介导的mTOR信号通路促进卵巢癌细胞增殖,为卵巢癌的分子靶向治疗提供新的思路。     

siRNA对卵巢癌细胞周期及EGFR表达的影响

目的体外构建编码人类表皮生长因子受体（EGFR）的小干扰RNA（siRNA）的质粒表达载体,观察其对卵巢癌Skov-3细胞EGFR的特异性抑制作用及对细胞凋亡和周期的影响。方法构建pSilencer-EGFR siRNA真核基因表达载体,采用脂质体介导的方法将其转染到卵巢癌细胞株Skov-3,实验分为以下3组：空白对照组（未经转染的人卵巢癌Skov一3细胞）、非特异性转染组（转染非特异性质粒载体）及特异性转染组。用RT-PCR的方法检测mRNA水平的变化,用免疫荧光法检测EGFR蛋白水平的变化,流式细胞仪检测其对卵巢癌细胞周期及凋亡的影响。结果成功构建pSilencer—EGFR siRNA真核基因表达载体。psiRNA—EGFR质粒明显下调Skov-3细胞中EGFR的表达,阻断细胞周期在G1期,促进细胞凋亡。结论重组质粒psiRNA—EGFR能有效地抑制Skov-3细胞内EGFR的表达、抑制细胞增殖,其抑制机制可能与引起细胞周期再分布、降低S期细胞比例和促进细胞凋亡有关。     

MiR-610通过下调双微体基因2的表达抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移

目的：探讨miR-610 对卵巢癌细胞侵袭和迁移能力的作用及机制。方法：通过RT-PCR 检测卵巢癌组织及细 胞、正常组织及细胞中miR-610 与鼠双微体基因2（MDM2）mRNA的表达;通过Lipofectamine 2000 将miR-NC、 miR-610 mimic、miR-6101 inhibitor、pc-MDM2质粒分别或联合转染进入HO8910细胞;划痕实验检测细胞迁移 能力,Transwell 法检测细胞侵袭能力,免疫印迹检测E- 钙黏着蛋白（E-cadherin）、N- 钙黏着蛋白（N-cadherin） 和MDM2蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因检测miR-610 与MDM2靶向关系。 结果：与正常卵巢组织和上皮 细胞系HOSEpiC相比,人宫颈癌组织和细胞系中miR-610 表达明显下调,选择下调效果较明显的HO8910细胞系 进行后续实验。与Control 组相比,miR-610 mimic 组卵巢癌HO8910细胞划痕闭合率明显降低、侵袭细胞数目明 显减少、E-cadherin 明显上调、N-cadherin 表达明显下调,miR-610 inhibitor 组卵巢癌HO8910细胞划痕闭合率明显 升高、侵袭细胞数目明显增多、E-cadherin 明显下调、N-cadherin 表达明显上调。MiR-610 与MDM2 3'UTR 区存在 结合位点,且miR-610 靶向下调MDM2 表达。共转染pc-MDM2逆转了miR-610 mimic 对卵巢癌HO8910细胞迁移 和侵袭能力抑制作用。 结论：MiR-610 通过靶向下调MDM2抑制卵巢癌HO8910细胞迁移和侵袭能力。     

HE4基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞HO8910生长侵袭的影响

目的探讨卵巢癌基因HE4对卵巢癌细胞增殖及侵袭能力的影响。方法构建针对HE4基因的PcDNA3．1／HE4载体．脂质体法介导PcDNA3．1／HE4载体转染人浆液性卵巢癌细胞系HO8910,WESTERN—BLOT检测转染前后细胞内HE4蛋白的表达效果。用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察HE4基因对细胞增殖能力的影响,经细胞粘附实验、体外侵袭力实验比较转染前后细胞侵袭能力的变化。结果Western-blot结果显示PcDNA3．1／HE4载体成功转染HO8910细胞并显著提高该细胞HE4基因的表达,细胞增殖能力较前无明显变化,侵袭能力明显下降。结论通过增强HE4基因表达,可降低其侵袭能力,有望成为卵巢癌基因治疗的新的候选基因。     

TRIM28siRNA通过活化E2F转录因子1增加非小细胞肺癌PAa细胞对依托泊苷的敏感性

目的 探讨siRNA沉默TRIM28（tripartite motif containing 28）增强非小细胞肺癌（NSCLC）PAa细胞对依托泊苷的敏感性和可能的机制。方法 应用RNA干扰技术沉默TRIM28基因在PAa细胞中的表达;TRIM28siRNA单独或联合依托泊苷处理PAa细胞后,应用MTT法和集落形成实验检测各组细胞的增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blotting方法检测各组细胞中E2F转录因子1（E2F1）的表达水平。结果 在PAa中沉默了TRIM28的表达;TRIM28siRNA联合依托泊苷显著抑制PAa细胞的增殖和集落形成,明显诱导细胞凋亡;联合处理的PAa细胞中E2F1mRNA和蛋白水平的表达明显增加,同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少。结论TRIM28siRNA联合化疗药物依托泊苷对抑制NSCLC细胞生长有明显效果。     

HCV核心蛋白与NS4B对HepG2细胞增殖的影响

目的 探讨HCV核心蛋白与非结构蛋白4B（NS4B）对HepG2细胞增殖的影响及可能机制.方法 重组质粒pcDNA3.1（-）Core与pcDNA3.1（-）NS4B单独和联合转染HepG2细胞,同时以转染空载体和未转染HepG2细胞作为对照.RT-PCR及Western Blot检测各组细胞中HCVCore、NS4B 、Wnt1、β-catenin 、c-myc及CyclinD1表达;MTT法,平板克隆形成试验检测HCV核心蛋白与NS4B对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期.结果 ①pcDNA3.1（-）Core与pcDNA3.1（-）NS4B单独和联合转染HepG2细胞,成功表达HCV Core或/（和）NS4B mRNA和蛋白.②pcDNA3.1（-）Core和pcDNA3.1（-）NS4B单独转染和联合转染的HepG2细胞Wnt1、β-catenin、c-myc、CyclinD1 mRNA与蛋白的相对表达量均高于HepG2/pcDNA3.1（-）组和HepG2组（P＜0.01）.③与HepG2/pcDNA3.1（-）组和HepG2组比较,pcDNA3.1（-）Core和pcDNA3.1（-） NS4B单独转染和联合转染的HepG2细胞活力和克隆形成能力增强,S期和G2/M期细胞比例升高（P＜0.01）.结论 HCV核心蛋白与NS4B能加速HepG2细胞周期进程,促进细胞增殖,这种效应可能与其增强Wnt1、β-catenin、c-myc及CyclinD1的表达相关.     

The age distribution of mortality due to influenza: pandemic and peri-pandemic

Background

The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a validated therapeutic target in non-small cell lung cancer (NSCLC). However, current single agent receptor targeting does not achieve a maximal therapeutic effect, and some mutations confer resistance to current available agents. In the current study we have examined, in different NSCLC cell lines, the combined effect of RNA interference targeting the EGFR mRNA, and inactivation of EGFR signaling using different receptor tyrosine kinase inhibitors (TKIs) or a monoclonal antibody cetuximab.

Methods

NSCLC cells (cell lines HCC827, H292, H358, H1650, and H1975) were transfected with EGFR siRNA and/or treated with the TKIs gefitinib, erlotinib, and afatinib, and/or with the monoclonal antibody cetuximab. The reduction of EGFR mRNA expression was measured by real-time quantitative RT-PCR. The down-regulation of EGFR protein expression was measured by western blot, and the proliferation, viability, caspase3/7 activity, and apoptotic morphology were monitored by spectrophotometry, fluorimetry, and fluorescence microscopy. The combined effect of EGFR siRNA and different drugs was evaluated using a combination index.

Results

EGFR-specific siRNA strongly inhibited EGFR protein expression almost equally in all cell lines and inhibited cell growth and induced cell apoptosis in all NSCLC cell lines studied, albeit with a different magnitude. The effects on growth obtained with siRNA was strikingly different from the effects obtained with TKIs. The effects of siRNA probably correlate with the overall oncogenic significance of the receptor, which is only partly inhibited by the TKIs. The cells which showed weak response to TKIs, such as the H1975 cell line containing the T790M resistance mutation, were found to be responsive to siRNA knockdown of EGFR, as were cell lines with downstream TKI resistance mutations. The cell line HCC827, harboring an exon 19 deletion mutation, was more than 10-fold more sensitive to TKI proliferation inhibition and apoptosis induction than any of the other cell lines. Cetuximab alone had no relevant in vitro activity at concentrations obtainable in the clinic. The addition of EGFR siRNA to either TKIs or cetuximab additively enhanced growth inhibition and induction of apoptosis in all five cell lines, independent of the EGFR mutation status (wild-type or sensitizing mutation or resistant mutation). The strongest biological effect was observed when afatinib was combined with an EGFR-specific siRNA.

Conclusions

EGFR knockdown by siRNA further decreases the cell growth of lung cancer cells that are treated with TKIs or cetuximab alone, confirming that single agent drug targeting does not achieve a maximal biological effect. The siRNA inhibits EGFR oncogenic activity that bypasses downstream "resistance" mutations such as KRAS and PTEN. The combined treatment of siRNA and EGFR inhibitory agents is additive. The combination of a potent, irreversible kinase inhibitor such as afatinib, with EGFR-specific siRNAs should be further investigated as a new strategy in the treatment of lung cancer and other EGFR dependent cancers, including those with downstream resistance mutations.