透明细胞肾细胞癌组织中DNMT3B异构体表达及其整体甲基化的分析

目的检测透明细胞肾细胞癌组织中DNA甲基转移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)异构体表达及其整体甲基化的变化,探讨这些变化与透明细胞肾细胞癌的关系。方法选取15例透明细胞肾细胞癌及其癌旁组织,应用Real-time PCR技术检测DNMT1、DNMT3A、DNMT3B与DNMT3B六种主要异构体的mRNA表达,应用Western blot法检验DNMT3B4蛋白表达;应用联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)分析重复序列Alu和LINE-1的甲基化水平。结果透明细胞肾细胞癌组织中DNMT3B4 mRNA和蛋白表达水平比癌旁组织高;重复序列Alu和LINE-1的甲基化水平在透明细胞肾细胞癌组织中比癌旁组织低。结论 DNMT3B4表达增加可能与整体甲基化降低及透明细胞肾细胞癌的发生有密切关系。     

结直肠腺瘤中DNMT3B表达及RASSF1A甲基化分析

目的探讨DNA甲基转移酶的表达及抑癌基因RASSF1A的甲基化及两者表达与较大结直肠腺瘤(colorectal adenoma,CA)的关系。方法选取20对直径≥10 mm的CA患者组织及对应瘤旁组织作为对照,分别使用Real-time PCR和Western blot技术检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA和蛋白表达变化,应用亚硫酸氢盐限制性酶切分析(COBRA)技术分析重复序列LINE-1甲基化水平,应用甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术分析抑癌基因RASSF1A的甲基化水平。结果与对照组相比,CA中DNMT3B的mRNA和蛋白水平升高,DNMT3B的活性显著升高。CA组织中LINE-1甲基化水平降低,肿瘤抑制基因RASSF1A的启动子甲基化水平升高,且表达降低。结论 DNMT3B过表达可能在CA的发生、发展中起重要作用,具体机制可能与降低整体甲基化水平和升高抑癌基因RASSF1A甲基化水平有关。     

SMYD3过表达对人肝内胆管癌细胞miR-124表达及细胞增殖的影响

 目的：探讨肝内胆管癌细胞HCCC-9810中SET和MYND结构域含有蛋白3（SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3）过表达对miR-124表达及细胞增殖能力的影响。方法：瞬时转染 SMYD3 真核表达质粒后, Western blotting 检测细胞中SMYD3 蛋白水平的变化;qRT-PCR 检测细胞中SMYD3 mRNA 和miR-124 表达;甲基化特异性PCR检测miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化水平;CCK-8 和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果：以空白组为对照,肝内胆管癌细胞HCCC-9810在转染pEGFP-SMYD3质粒后,SMYD3蛋白及 mRNA 表达均显著上升（P＜0.05）,miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化显著增加（P＜0.05）,miR-124表达明显下降（P＜0.05）,细胞增殖能力显著提高（P＜0.05）。结论：过表达 SMYD3可引起miR-124基因启动子甲基化增加,导致胆管癌细胞中miR-124 的表达下降,同时过表达SMYD3可增强细胞增殖能力。     

DNA甲基转移酶在前列腺癌中的表达及其对体外细胞增殖及侵袭能力的影响

目的探讨DNA甲基转移酶(DNMTs)在前列腺癌(PCa)组织及前列腺癌细胞系中的表达情况及其对体外前列腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法收集24例患者的前列腺组织样本,其中前列腺癌组织样本12例,良性前列腺增生组织样本12例。免疫组织化学染色检测DNMT1、DNMT3b的表达。通过Western blot及RT-qPCR检测前列腺癌细胞系(DU145、PC-3)及人正常前列腺上皮细胞系(RWPE-1)中DNMT1、DNMT3b的表达。采用siRNA分别下调DU145细胞系中DNMT1、DNMT3b表达,检测DU145细胞生物学行为的改变。结果 DNMT1、DNMT3b在前列腺癌组织中的表达高于前列腺增生组织(P0.05)。DNMT1、DNMT3b在DU145、PC-3细胞系中的表达高于RWPE-1细胞系(P0.05),且DNMT1、DNMT3b在DU145中的表达高于PC-3(P0.05)。下调DU145细胞中DNMT1、DNMT3b的表达,可显著抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,减弱细胞迁移及侵袭能力(P0.05),其中DNMT1抑制组效果最显著。结论 DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3b)在前列腺癌中的表达高于正常前列腺,其中DNMT1对细胞生物学行为影响最显著。     

DNMT2在胃癌的表达及靶向抑制

目的 研究DNA甲基化转移酶2(DNMT2)在胃癌的表达,并分析靶向抑制DNMT2对胃癌的影响.方法 免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织,免疫荧光法对胃癌细胞SGC-7901行DNMT2表达研究.构建3个靶向抑制DNMT2的siRNA(DNMT2-siRNA-1,DNMT2-siRNA-2,DNMT2-siRNA-3).转染DNMT2-siRNA入SGC-7901,RT-PCR 及Western免疫印迹法验证DNMT2的抑制效果.噻唑蓝比色法检测SGC-7901增殖率.结果 胃癌组织DNMT2表达率43.3％,显著低于癌旁组织的93.3％(P＜0.05);晚期及低分化胃癌组织的DNMT2表达率更低(P＜0.05).DNMT2在胃癌细胞核表达显著.DNMT2-siRNA可成功转染SGC-7901,并成功筛选靶向抑制DNMT2的siRNA(DNMT2-siRNA-3).发现转染DNMT2-siRNA-3后96 h与120 h,SGC-7901增值率1.138±0.110与1.078±0.060较对照增殖率1增加(P＜0.05).结论 DNMT2在胃癌表达降低,抑制DNMT2可能利于胃癌增殖.     

氧化应激上调人神经母细胞瘤细胞内β-裂解酶的表达

目的研究氧化应激对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)β-裂解酶(BACE1)表达的影响及组蛋白乙酰化、DNA甲基化的改变。方法采用H2O2处理体外培养的SH-SY5Y,Western blot法检测细胞的BACE1表达及DNA甲基转移酶(DNMTs)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的表达;实时定量PCR检测BACE1 mRNA的表达;吸光度值法检测组蛋白3(H3)和组蛋白4(H4)整体乙酰化水平。结果 SH-SY5Y细胞经H2O2处理1和72 h后BACE1 mRNA和蛋白表达均明显增多;H2O2处理72 h后DNMT1、DNMT3A表达均下降,分别是对照组的75%和65%(P<0.01);而组蛋白去乙酰化酶HDAC3的表达增高至对照组的1.6倍(P<0.01);同时,组蛋白H3整体乙酰化水平下降,但H4乙酰化水平无明显改变。结论氧化应激可能通过改变SH-SY5Y细胞内DNA甲基化水平及组蛋白乙酰化状态调节BACE1的表达,在阿尔茨海默病发病过程中发挥作用。     

透明细胞肾细胞癌的表观遗传学研究进展

正肾脏肿瘤的发病率在人类泌尿系统肿瘤中排名第3,约占恶性肿瘤的3%,发病年龄主要在50~70岁,每年导致90 000多例患者死亡,且呈递增趋势~([1])。肾癌的具体发病机制不详,除遗传因素外,吸烟、肥胖、污染和辐射等也是重要因素。大多数透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)患者在早期无任何症状,20%~30%患者在     

DNMT3单核苷酸多态性与乳腺癌临床病理特征的相关性研究

目的:探讨DNA甲基化转移酶3(DNMT3)基因多态性位点与乳腺癌临床病理特征的相关性。方法:采用SNaPshot技术检测68例乳腺癌患者(乳腺癌组)和80例健康体检者(对照组)外周血中DNMT3基因rs13420827、rs11887120、rs1550117、rs2424908、rs2424913和rs6087990多态性位点的基因分型。Hardy-Weinberg检验分析六个位点基因型的遗传平衡性，比较两组间各个位点基因型的分布差异，以及不同临床病理特征的乳腺癌患者各基因差异。结果:Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验结果显示，除rs2424913和rs6087990,两组对象中其余四个位点均符合遗传平衡，所选对象具有衡定性及群体代表性。DNMT3基因位点rs1550117在病例组和对照组基因型差异比较有统计学意义(P<0.05)。进一步分析发现基因型AA在乳腺癌组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示位点rs1550117基因型AA能降低患乳腺癌的风险；两组间其余各位点基因型比较差异无统计学意义(P>0.05)。乳腺癌组中不同位点临床病理例...     

DNMT在胃癌中的表达及DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌的影响

目的: 研究DNA甲基化转移酶(DNMT)各亚型DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L在胃癌与胃黏膜中的表达特点,并分析DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌和胃黏膜细胞的影响。方法: 免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织行5种DNMT表达研究。免疫荧光法和Western免疫印迹法对SGC-7901、MKN-45(胃癌细胞)和GES-1(胃黏膜细胞)行5种DNMT表达研究。噻唑蓝比色法和流式细胞术分析5-氮杂-2’-脱氧胞苷对SGC-7901、MKN-45和GES-1增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果: 胃癌与癌旁组织均有5种DNMT不同程度表达,但胃癌组织DNMT1和DNMT3A表达显著低于癌旁组织(P<0.01),DNMT2和DNMT3L表达也低于癌旁组织(P<0.05),只有DNMT3B在胃癌与癌旁组织中无显著差异(P>0.05)。胃癌细胞(SGC-7901和MKN-45)与胃黏膜细胞(GES-1)亦有部分DNMT表达,除DNMT3B在胃黏膜细胞表达较强外,余DNMT在胃癌与胃黏膜细胞中无显著差异。5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌与胃黏膜细胞的增殖率、周期分布和凋亡率并无显著影响。结论: DNMT在胃癌中表达呈降低趋势,抑制DNMT对胃癌细胞的增殖和凋亡无显著影响。     

RNAi沉默DNMT1基因对胰腺癌细胞ppENK甲基化状态的影响

目的观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默DNMT1基因的表达对胰腺癌Panc-1细胞的前脑啡肽原(preproen-kephalin,ppENK)基因甲基化状态的影响。方法采用针对DNMT1的Stealth核糖核苷酸干扰(siRNA)胰腺癌细胞,观察DN-MT1信使核糖核酸(mRNA)及DNMT1蛋白的表达;甲基化特异性PCR反应(MSP)检测不同处理组ppENK的甲基化状态。结果 Stealth RNAi转染到胰腺癌细胞Panc-1中48 h后,siRNA-3转染组的mRNA相对表达量和比率分别为0.116和32.9%,与空白对照组(0.352,100%)、脂质体对照组(0.346,98.2%)、RNAi阴性对照组(0.339,96.3%)相比差异有统计学意义(F=2.107 E4,P=0.000 1),转染组的mRNA相对抑制率为67.1%。siRNA-3转染组DNMT1蛋白相对表达量和比率分别为0.179和32.9%,与空白对照组(0.547,100%)、脂质体对照组(0.520,95%)、RNAi阴性对照组(0.535,97%)相比差异有统计学意义(F=2.195 E5,P=0.000 1)。于100 bp和96 bp处可见ppENK基因特异性条带,呈现部分去甲基化状态的特点。结论 DNMT1靶向的Stealth RNA瞬时转染到胰腺癌细胞Panc-1中可明显沉默DNMT1的基因和蛋白的表达,逆转抑癌基因ppENK的高甲基化状态,为胰腺癌的基因治疗提供相关的理论依据。     

转录因子CDX2过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖和细胞周期的影响*

 目的： 探索CDX2过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖、生长和细胞周期的影响及其分子机制。方法: 采用携带CDX2基因的重组慢病毒颗粒（LV-CDX2-GFP）感染SGC-7901细胞,作为实验组（LV-CDX2-GFP组）;以对照慢病毒颗粒（LV-GFP）感染SGC-7901细胞,作为阴性对照组（LV-GFP组）;空白对照组常规培养,不做任何处理。分别采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组细胞周期的分布,半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting技术检测细胞中CDX2、Bax、Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达。结果: 与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-CDX2-GFP组细胞增殖活力明显降低(P<0.05),G0/G1期所占比例上升(P<0.05),Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达降低（P<0.05）,Bax mRNA和蛋白的表达上调（P<0.05）,而LV-GFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论: 慢病毒介导的CDX2过表达抑制胃癌细胞增殖和生长,使细胞周期停滞在 G0/G1期,其机制可能与CDX2过表达使胃癌细胞Bcl-2、cyclin D1、survivin表达下调和Bax表达上调有关。     

高表达p27基因对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的构建抑癌基因p27高表达细胞株,研究其对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法运用RT-PCR技术从HeLaRNA中扩增p27 cDNA,连接酶连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),所得的重组质粒pcDNA3.1(+)-p27用脂质体法转染子宫颈癌HeLa细胞,使用RT-PCR以及Western blot法筛选p27基因高表达的细胞株。MTT法和流式细胞术检测p27基因高表达对细胞增殖的影响。结果成功获得p27高表达的HeLa细胞株。细胞增殖分析和流式细胞术结果显示,p27基因高表达对细胞增殖有抑制作用,并明显增加G1期的细胞数(由44.4%增加到59%,P<0.05)。结论 p27基因在HeLa细胞中高表达能通过抑制细胞G1/S转换从而抑制细胞增殖,提示p27基因可能成为子宫颈癌基因治疗的靶基因。     

WNT5B过表达对人乳腺癌MCF-7细胞活力及凋亡的影响

目的:检测WNT5B在人正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞株中的表达,及过表达WNT5B后对人乳腺癌MCF-7细胞活力及凋亡的影响,探讨WNT5B在乳腺癌发生发展中的作用。方法:采用RT-PCR法检测正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中WNT5B的mRNA表达水平,将WNT5B的表达载体pc DNA3.1/WNT5B和空白对照载体pc DNA3.1分别瞬时转染人乳腺癌MCF-7细胞,通过real-time PCR和Western blotting法分别在mRNA和蛋白水平验证WNT5B的表达效率;并通过CCK-8的方法检测WNT5B过表达对人乳腺癌MCF-7细胞活力的影响,通过流式细胞术分别检测过表达WNT5B对MCF-7细胞周期分布及凋亡比例的影响。结果:与正常乳腺上皮细胞相比,WNT5B在乳腺癌细胞中低表达;在乳腺癌细胞MCF-7中转染WNT5B表达质粒后,WNT5B表达上调,差异有统计学显著性(P0.05);与对照组相比,过表达WNT5B后,MCF7细胞的活力明显降低,处于S期细胞的量明显增加,G1和G2/M期细胞明显减少,且细胞凋亡比例明显增加,差异均有统计学显著性(P0.05)。结论:WNT5B在乳腺癌细胞中低表达,过表达WNT5B可使人乳腺癌细胞MCF-7阻滞在S期,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

Expression profiling and clinicopathological significance of DNA methyltransferase 1, 3A and 3B in sporadic human renal cell carcinoma

Purpose: This study aimed to evaluate the expression of DNA methyltransferase (DNMT) family proteins in renal cell carcinoma (RCC) and to assess the clinical significance and prognostic value of their expression patterns. Methods: A total of 97 renal cell carcinoma and 52 no-tumor tissues were recruited for immunohistochemical analysis of their expression. Results: DNMT1, DNMT3A and DNMT3B proteins were highly expressed in clear cell RCC, papillary RCC and chromophobe RCC tissues than that of no-tumor tissues (all P < 0.05). DNMT1, DNMT3A and DNMT3B expression was significantly associated with tumor size (P=0.003, 0.001 and 0.003, respectively), tumor pathology stage (P=0.039, 0.034 and 0.037, respectively), histopathological grading (P=0.042, 0.026 and 0.031, respectively), lymph node metastasis (P=0.022, 0.030 and 0.020, respectively) and vascular invasion (P=0.042, 0.031 and 0.044, respectively). The Kaplan-Meier survival analysis demonstrated that expression of DNMTs protein in RCC was significantly associated with shorter over all survival and disease-free survival (all P < 0.05). Furthermore, multivariate analysis showed that the expression of DNMT1 was an independent prognostic factor for overall survival (OS) (P=0.036), and the expression of DNMT3A or DNMT3B was an independent prognostic factor for disease-free survival (DFS) in the patients (P=0.031 and P=0.023, respectively). Conclusions: DNMTs were higher expressed in RCC than no-tumor tissues, and the expression of DNMTs were strongly associated with RCC tumor size, tumor pathology stage, histological grading, lymph node metastasis, vascular invasion, recurrence, and prognosis. DNMTs may thus serve as prognostic markers and novel therapeutic targets for RCC patients.     

NF-κB抑制剂PDTC对人骨髓瘤U266细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨NF-κB特异性抑制剂PDTC对多发性骨髓瘤U266细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制。方法:采用不同浓度PDTC(25、50、100和200μmol/L)处理U266细胞,CCK-8法和活细胞计数检测U266细胞的增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期;RT-qPCR及Western blot检测PDTC处理前后DNA甲基转移酶1(DNMT1)mRNA和蛋白的表达;Western blot检测NF-κB(P65)、DNMT1、Bcl-2、cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的蛋白水平。结果:PDTC处理U266细胞48 h后,NF-κB(P65)的蛋白水平被抑制;PDTC抑制U266细胞增殖,作用呈浓度及时间依赖性;PDTC作用48 h后,与对照组比较,细胞凋亡率呈浓度依赖性增高(P0.05),细胞被阻滞在G2期;DNMT1的mRNA及蛋白水平均降低;Western blot结果显示PDTC可通过抑制NF-κB下调Bcl-2的表达,使cyclin D1、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平增加。结论:PDTC抑制NF-κB信号通路,通过诱导U266细胞凋亡从而抑制细胞增殖,其机制可能与抑制DNMT1的表达、阻滞细胞周期和启动凋亡途径有关。     

Transcript levels of DNA methyltransferases DNMT1, DNMT3A and DNMT3B in CD4+ T cells from patients with systemic lupus erythematosus

Langerin/CD207 is expressed by a subset of dendritic cells (DC), the epithelial Langerhans cells. However, langerin is also detected among lymphoid tissue DC. Here, we describe striking differences in langerin-expressing cells between inbred mouse strains. While langerin+ cells are observed in comparable numbers and with comparable phenotypes in the epidermis, two distinct DC subsets bear langerin in peripheral, skin-draining lymph nodes of BALB/c mice (CD11c(high) CD8alpha(high) and CD11c(low) CD8alpha(low)), whereas only the latter subset is present in C57BL/6 mice. The CD11c(high) subset is detected in mesenteric lymph nodes and spleen of BALB/c mice, but is virtually absent from C57BL/6 mice. Similar differences are observed in other mouse strains. CD11c(low) langerin+ cells represent skin-derived Langerhans cells, as demonstrated by their high expression of DEC-205/CD205, maturation markers, and recruitment to skin-draining lymph nodes upon imiquimod-induced inflammation. It will be of interest to determine the role of lymphoid tissue-resident compared to skin-derived langerin+ DC.     

LIM矿化蛋白1过表达对骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖的影响

目的　探讨骨肉瘤细胞系OS-9901细胞中LIM矿化蛋白1（LMP-1）过表达对该细胞增殖的影响。 方法　构建LMP-1过表达慢病毒载体,通过脂质体转染进骨肉瘤细胞系OS-9901细胞。通过荧光定量PCR和Western blot检测LMP-1过表达情况,并通过BrdU掺入实验比较LMP-1过表达前后细胞增殖情况。 结果　转染了LMP-1过表达慢病毒载体6 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达均无显著变化（P>0.05）,且DNA合成量无显著变化。而当LMP-1过表达慢病毒载体转染细胞12、24和48 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达量均显著提高的同时,DNA合成量显著降低（P<0.05）。 结论　LMP-1过表达可抑制骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖。     

Effect of Bisphenol A on invasion ability of human trophoblastic cell line BeWo

Bisphenol A (BPA) is a kind of environmental endocrine disruptors (EEDs) that interfere embryo implantation. Trophoblast invasion plays a crucial role during embryo implantation. In this study, the effects of BPA on invasion ability of human trophoblastic cell line BeWo and its possible mechanism were investigated. BeWo cells were exposed to BPA and co-cultured with human endometrial cells to mimic embryo implantation in transwell model. The proliferation and invasion capability of BeWo cells were detected. The expression of E-cadherin, DNMT1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 were also analyzed. The results showed that the invasion capability of BeWo was reduced after daily exposure to BPA. BPA had biphasic effect on E-cadherin expression level in BeWo cells and expression level of DNMT1 was decreased when treated with BPA. Moreover, BPA treatment also changed the balance of MMPs/TIMPs in BeWo cells by down-regulating MMP-2, MMP-9 and up-regulating TIMP-1, TIMP-2 with increasing BPA concentration. Taken together, these results showed that BPA treatment could reduce the invasion ability of BeWo cells and alter the expression level of E-cadherin, DNMT1, TIMP-1, TIMP-2, MMP-2, and MMP-9. Our study would help us to understand the possible mechanism of BPA effect on invasion ability of human trophoblastic cell line BeWo.