SiRNA 抑制 p63 基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法 荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot 检测干扰效率。噻唑蓝（MTT）和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

SiRNA抑制p63基因表达对胆管癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建SiRNA靶向p63载体,稳定导入胆管癌细胞QBC939后,观察细胞增殖和侵袭情况的改变。方法荧光定量PCR检测胆管癌细胞株QBC939细胞中p63表达。构建针对p63的shRNA慢病毒载体,转染胆管癌QBC939细胞中,建立稳定表达shRNA-p63胆管癌细胞株。Western blot检测干扰效率。噻唑蓝(MTT)和软琼脂集落形成实验检测细胞增殖的变化;Boyden小室检测细胞侵袭情况的改变。结果 p63基因显示在QBC939细胞中高表达。序列分析表明,重组到慢病毒载体中的shRNA序列正确。我们利用Western blot筛选了一个干扰p63表达效率为66.8%的单克隆细胞。p63表达降低不但能抑制细胞增殖体外能力,而且还能降低细胞侵袭能力。结论 p63在胆管癌QBC939细胞中高表达。SiRNA靶向抑制p63表达后,能明显降低细胞增殖和侵袭能力。     

野生型P73β转染对胆管癌细胞的生物学影响

目的 应用野生型P73β转染胆管癌QBC939细胞,探讨P73β基因转染对胆管癌细胞生长的抑制机制.方法 应用野生型P73β转染胆管癌QBC939细胞,并以未作处理的QBC939细胞作为空白对照.用RT-PCR及Westem blotting检测细胞中P21、Cyclin D1及Cdk2表达量的变化.使用四甲基偶氮唑盐法(MTT)和流式细胞仪检测细胞增殖及细胞周期的变化.结果 转染了野生型P73β重组质粒的胆管癌QBC939细胞,P21相对表达量增高,Cdk2相对表达量明显减少,胆管癌细胞增殖率受到抑制.结论 野生型P73 β基因转染后对胆管癌细胞的生长有抑制作用,P73β基因可通过增加P21基因的表达,抑制Cdk2基因的表达,进而作用于S期的细胞,使细胞周期停滞,从而抑制胆管癌细胞增殖.     

HCV核心基因转染对QBC939细胞凋亡及细胞周期的影响

[目的]研究丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)对肝门部胆管癌细胞(QBC939)细胞凋亡及细胞周期的影响.[方法]将包含HCV-C基因的真核表达质粒pcDNA HCV-C和空载体,利用脂质体介导将其转染QBC939,经G418筛选获得稳定转染HCV-C的QBC939细胞(QBC939 HCV-C ),RT-PCR和免疫荧光法检测HCV-C蛋白表达,MTT法检测QBC939 HCV-C 细胞、空白质粒转染QBC939(QBC939pcDNA)细胞和未转染QBC939细胞生长增生率;流式细胞术(FACS)检测3组细胞凋亡率和细胞周期,以及QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡后的细胞周期变化.[结果]①QBC939 HCV-C 细胞增殖率显著高于空白质粒转染QBC939和未转染QBC939细胞增殖率;②细胞未经Fas抗体诱导凋亡时,QBC939 HCV-C 细胞S期(20.1%±1.8%)高于未转染QBC939细胞S期(14.2%±3.6%),QBC939 HCV-C 细胞凋亡率(5.0%±0.7%)低于无HCV-C转染QBC939细胞凋亡率(9.2%±0.7%);③QBC939 HCV-C 细胞经Fas抗体诱导凋亡时,细胞S期低于未经诱导凋亡细胞S期.[结论]HCV-C蛋白具有抑制QBC939细胞凋亡和促进细胞增殖作用.     

腺病毒介导的p16对胆管癌细胞的生长抑制作用

目的 研究p16基因对胆管癌细胞的作用。方法 将重组体腺病毒p16转移到人胆管癌细胞QBC939,对p16基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果 用Ad-LacZ进行重组体腺病毒转导效率的检测,发现当MOI为100以上时,重组体朱病毒可使90%以上的培养的人胆管癌QBC939细胞被转导,用RT-PCR方法检测,在胆管癌QTBC939细胞系中p16呈低表达,重组体腺病毒能介导外源基因p16在胆管癌QBC939细胞系中高效表达,重组体朱病毒介导的p16在QBC939细胞中表达,能抑制QBC939细胞的生长和集落形成。流式细胞计数和细胞DNALadder,证实p16能诱导QBC939细胞发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 p16基因通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞在肿瘤的基因治疗方面发挥作用。     

蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939增殖及cyclin E和P27蛋白表达影响的研究

目的 已有诸多研究显示中药蟾蜍灵具有明显抑制肿瘤增殖的作用,观察蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939的cyclin E和P27表达的影响,探讨其调控胆管癌细胞增殖的途径和机制. 方法 MTT比色法观察不同浓度蟾蜍灵(0.1、1、10μmol/L)对人胆管癌细胞QBC939增殖的影响;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)实验检测蟾蜍灵毒性;流式细胞术检测人胆管癌细胞QBC939细胞周期的变化;Western blot法测定cyclin E、P27蛋白水平变化. 结果 MTT比色法结果 表明蟾蜍灵对人胆管癌细胞QBC939生长具有较强的抑制作用,并在一定范围内具有时间和浓度依赖性,流式细胞仪检测细胞周期阻滞在G0/G1期,具有良好的量效关系.Western blot 测定cyclin E蛋白表达量下降,P27蛋白表达量升高. 结论 蟾蜍灵可能是通过阻滞细胞周期,减少cyclinE蛋白表达,增加P27蛋白表达,来达到抗肿瘤作用.     

小分子药物CX-3543对胆管癌QBC939细胞中c-Myc相关miRNA及miRNA靶基因表达的影响研究

目的 探讨在小分子药物CX-3543作用下,胆管癌细胞QBC939中癌基因c-Myc相关的miRNA及miRNA靶基因的表达变化.方法 MTT检测CX-3543对QBC939细胞增殖的影响.Western blot检测CX-3543处理后细胞中c-Myc及c-Myc相关miRNA靶基因的表达,同时,Northern blot检测c-Myc相关miRNA的表达.结果 CX-3543抑制QBC939细胞增殖.CX-3543可抑制QBC939细胞中c-Myc的表达,且与作用时间及剂量正关性.同时CX-3543抑制了c-Myc相关miRNA(miR-9、miR-19和miR-20α)的表达,继而上调了miR-9及miR-19的靶基因E-钙粘蛋白及RB1的表达,下调了miR-20α靶基因Pten的表达.结论 CX-3543可有效抑制胆管癌细胞系QBC939中癌基因c-Myc的表达,影响c-Myc相关miRNA及miRNA靶基因的表达,减弱c-Myc介导的通路对胆管癌的影响.     

p16和p53基因及顺铂联用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：探索p16基因和p53基因及p16基因和顺铂（CDDP）联合应用对体内外胆管癌细胞系生长的抑制作用。方法：将重组体腺病毒p16（Ad-p16）和Ad-p53及Ad-p16和CDDP联合作用于人胆管癌细胞系QBC939，观察和分析其对体内外胆管癌细胞生长抑制作用及其机制，结果：Ad-p16在QBC939细胞中表达能抑制QBC939细胞的生长，与p53、CDDP联合应用能明显抑制QBC939细胞的生长，p16和p53基因诱导癌细胞发生G1期阻滞和细胞凋亡，CDDP能诱导癌细胞发生G2期阻滞和细胞凋亡；裸鼠皮下移植瘤模型瘤体内注射Ad-p16及腹腔内注射CDDP均能抑制QBC939肿瘤的生长，两者联合应用具有协同作用。结论：p16基因和p53基因及CDDP联合应用具有协同作用。     

pmCherry-N1-WWOX真核表达载体的构建及其在胆管癌细胞QBC939中的表达

目的 构建人脆性位点抑癌基因WWOX真核表达载体,并观察其在人胆管癌细胞株QBC939中的表达.方法 通过全基因合成的WWOX cDNA为模版,用PCR技术扩增,将扩增片段连接到PUC57质粒,构建克隆载体,鉴定出阳性克隆后用 DNA测序法鉴定重组质粒.将克隆载体与pmCherry-N1同时用Xho I/BamH I双...     

TRAIL受体在胆管癌组织中的表达及意义

目的 :探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)的受体在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)的表达及其临床意义。 方法 :应用原位杂交组织化学法检测TRAIL受体mRNA在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)中的表达。 结果 :DR4mRNA、DR5mRNA在人胆管癌组织、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)均呈阳性表达。只有 3例DcR1(3/5 2 )和 7例DcR2 (7/5 2 )在人胆管癌组织呈弱阳性表达。DcR1、DcR2 mRNA在癌旁胆管组织呈阳性表达 ,而在胆管癌细胞株 (QBC939)均不表达。 结论 :TRAIL死亡受体和诱捕受体在人胆管癌、癌旁胆管组织和胆管癌细胞株 (QBC939)的表达不同 ,这些受体表达的变化可能在调控人胆管癌凋亡中发挥重要作用。     

莪术注射液抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的：探寻新的抗白血病药物。方法：采用ＭＴＴ法,以柔红霉素（ＤＮＲ）、阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）和羟基脲作对照,了解莪术注射液对Ｋ５６２细胞增殖抑制作用;通过流式细胞仪检测和ＤＮＡ凝胶电泳,观察莪术注射液诱导Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：莪术注射液对Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显强于对照ＤＮＲ、Ａｒａ－Ｃ和羟基脲;而它更主要的作用是诱导Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

免疫性肝损伤大鼠枯否细胞对肝星状细胞增殖的影响及芍药苷的作用

目的探讨芍药苷(Pae)通过免疫性肝损伤大鼠枯否细胞(KC)影响肝星状细胞(HSC)的增殖能力。方法用卡介苗加脂多糖诱导大鼠肝损伤模型,肝脏原位灌流分离大鼠KC和HSC,观察共培养的形态学改变,观察Pae作用后的KC培养上清对HSC增殖的影响。结果免疫性肝损伤大鼠KC能明显促进HSC的增殖,在Pae作用后,KC培养上清能抑制HSC的增殖。结论KC是Pae发挥作用的靶细胞之一,Pae可通过作用于KC抑制HSC的增殖。     

C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究

目的:观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移,从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法:分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照,做细胞迁移实验,观察其结果;将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩,并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察其结果。结果:(1)C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基(P<0.01);(2)将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳,可见二者蛋白条带存在明显差异。结论:(1)从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。(2)C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。     

影响细胞融合的诸因素研究

应用国产的聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜(DMSO)、植物血凝素(PHA)和甘油作为融合剂诱导人类食管癌上皮细胞系(Eca-109)和中国田鼠卵巢细胞系(CHO)在悬液中融合。研究了PEG的分子量和浓度,DMSO、PHA和甘油的浓度,两亲本细胞的比例,细胞的总数量,融合后接种培养的密度对细胞融合率的影响。结果表明:两亲本细胞以1:1混合,用40%的分子量为1000的PEG诱导融合,之后以1×10~5个细胞/ml的密度接种培养,获得了最高的融合率。DMSO、PHA和甘油均可加强PEG诱导融合的活力。PHA毒性较强,尤其是浓度高、作用时间长时更甚。此外,甘油本身可诱导融合获得比PEG更高的融合率。甘油作为融合剂尚未见报道。细胞的总数量(在1.6×10~6～1×10~7个之间)和PEG溶液之PH值(在5～9之间)对细胞融合率无影响。     

Th细胞亚群测定中通透剂作用效果的评价

目的建立一种在Th细胞亚群测定中评价通透剂作用效果的方法.方法将刺激培养并固定后的全血标本在通透剂作用前及用不同剂量的通透剂作用后,加入荧光素标记的CD 69抗体、髓过氧化物酶(MPO)抗体和γ干扰素(IFN-γ)抗体,用流式细胞仪检测含相应抗原的细胞.结果通透剂作用前及不同剂量的通透剂作用后,T淋巴细胞中CD69 细胞的百分率均大于90%;通透剂作用前,MPO阳性的粒细胞和IFN-γ阳性的淋巴细胞均低于1%;使用30 μl通透剂时,粒细胞几乎全部为MPO阳性, >30%的淋巴细胞IFN-γ阳性;使用50 μl通透剂时,总细胞数比通透剂作用前显著减少(t=13.623,P<0.001).结论 MPO可以作为评价通透剂作用效果的指标;当细胞数同通透剂作用前无显著差异,且粒细胞门的细胞几乎全部被染为MPO阳性时,所用的通透剂量为最适用量.     

Stem cell plasticity: the growing potential of cellular therapy

The fundamental principle of stem cell biology is that cells with the potential for both self-renewal and terminal differentiation into one or more cell types may be found in a given tissue. The corollary of this principle is that the stem cells give rise to tissues in which they reside, the so-called expected tissues. Many exciting discoveries reported over the last several years challenge this paradigm by showing that there are not only tissue-specific stem cells that differentiate to the expected mature cells, but also that tissue stem cells can differentiate into unexpected cell lineages, suggesting an enormous plasticity of differentiation. Hematopoietic stem cells, which have drawn the most attention, mesenchymal stem cells, and neural stem cells have been the focus of many investigations. However, recent studies directed toward hematopoietic stem cells have disputed the concept of stem cell plasticity, suggesting that experimental artifact or somatic cell fusion may account for reported observations of plasticity. Although the data are mounting, stem cell plasticity, strictly defined, has yet to be rigorously proven. Animal models to meticulously define the biology and potential plasticity of stem cells and pilot clinical trials to begin to explore the biology and therapeutic potential of human stem cells will both be vital to advance the field over the coming years.     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

兔子宫内膜干细胞的鉴定

目的:研究兔子宫内膜是否存在干细胞?方法:流式细胞术检测兔子宫内膜中上皮细胞及间质细胞的特异性标记分子,干细胞培养基培养出富含干细胞的集落,运用RT-PCR方法检测分化前后相关分子的表达,MTT法检测集落细胞分化前后增殖能力变化,流式细胞术检测分化前后的相关分子表达变化及细胞的凋亡情况?结果:兔子宫内膜存在上皮细胞及间质细胞两种细胞,干细胞培养基可培养出富含干细胞的集落,且分化前的细胞具有更高的增殖潜能,表现出更多的干细胞源性,具有更低的细胞凋亡比例?结论:兔子宫内膜存在富含干细胞的集落,提示存在子宫内膜干细胞?     

补益营卫方对衰老人皮肤成纤维细胞数量及细胞周期的影响

目的观察经补益营卫方药物血清作用后,衰老人皮肤成纤维细胞数量和细胞周期的变化。方法体外培养正常人皮肤成纤维细胞,将细胞分为年轻对照组、老龄对照组、补益营卫高剂量组、补益营卫中剂量组、补益营卫低剂量组。年轻对照组和老龄对照组用10%胎牛血清常规培养;补益营卫高、中、低剂量组分别用10%补益营卫方高、中、低剂量大鼠血清培养,五组细胞连续培养8d。通过细胞计数法观察细胞数量的变化;流式细胞术观察细胞周期。结果补益营卫高、中、低药物血清组的细胞数量和S期细胞比例均增高,且均高于年轻对照组和老龄对照组(P<0.05),以高剂量组增高比例明显。结论补益营卫方可促进衰老人皮肤成纤维细胞增殖(S期细胞比例增高),此作用有剂量依赖性。