鱼腥草注射液治疗呼吸道合胞病毒感染的体外实验研究

目的探讨鱼腥草注射液体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的有效性。方法采用MTT比色法检测鱼腥草对Hep2单层细胞的毒性作用;以利巴韦林为对照,通过空斑试验和试管观察细胞病变法确定鱼腥草对RSV的抑制作用。结果鱼腥草最大稀释度(1∶10)对细胞无毒性,不影响细胞形态及生长;鱼腥草(1∶10)和利巴韦林(5 mg/L)均可以完全抑制稀释度为10-5(100TCID50)的RSV、半数抑制10-4(1 000 TCID50)的RSV,二者均可使空斑明显变小。结论鱼腥草注射液对RSV有体外抑制作用,对培养细胞无毒性。     

实验动物体外寄生虫三种检测方法的比较

目的对几种实验动物体外寄生虫感染情况进行初步调查，并对三种检测方法进行比较。方法采用拔毛法、刮皮法、处死法三种方法。结果处死法检测四组小鼠样本的体外寄生虫感染率分别是75．5％、90．0％、73．3％、85％，拔毛法和刮皮法分别为19．8％、27．3％、10．0％、75．0％与19．8％、60．6％、40．0％、65．0％。用处死法测得豚鼠体表长虱和新西兰兔体表疥螨的感染率均为100％。结论处死法检测实验动物体表寄生虫效果较好，但处死法与其它两种方法结合，可使检测结果更具科学性。     

体外培养人表皮细胞的实验研究

太面积Ⅲ度烧伤病人必须经植皮封闭倒面方可治愈。植同种或异种皮肤虽可暂时覆盖创面，但存在免疫排异反应。大张异体皮打洞嵌入自体皮和微粒植皮法的出现，大大的提高了大面积Ⅲ度饶伤病人的成活率，但在自体皮源不足的情况下，短期内迅速封闭创而仍是一个棘手的问题，J.G．Rheirrwala出和H．Green成功地培养出人表皮细胞与O’Corner体外培养人皮肤移植成功，为治疗大面积重度烧伤病人提供了一个新选径。近期我室培养出第一代人表皮细胞，并利用培养的表皮细胞初步进行了基础和临床实验研究。现将培养方法与结果报告如下。     

研究人员优化体外实验方法以减少“首次应用于人体”的药品试验风险

英国研究人员通过调查2006年发生的免疫调节因子TGN1412药品试验失败（导致6名健康的志愿者患上严重疾病）的事故原因,研发出一种体外实验方法,这种方法可能预测出该药在人体实验前的严重副反应。     

MARCKS相关多肽与地尔硫(艹卓)对大鼠气道黏液高分泌模型MUC5AC分泌的影响

目的 研究在大鼠气管内滴入MARCKS相关多肽（MANS）或/和地尔硫（艹卓）（DTZ）对气道黏蛋白5AC（MUC5AC）分泌的影响并探讨其可能的作用机制。方法 通过雾化吸入丙烯醛建立大鼠气道黏液高分泌模型后随机分为4组，对照组气管内滴入生理盐水，三个实验组即MANS组、DTZ组和联用组在气管内分别滴入MANS、DTZ以及二者同时滴入，1 h后获取支气管肺泡灌洗液（BALF）及肺组织。用ELISA法对BALF中的MUC5AC进行定量；用免疫组化染色对气道杯状细胞中MUC5AC进行特异性染色，用灰度扫描和图像分析对杯状细胞内的MUC5AC进行半定量分析。结果 BALF中MUC5AC的分泌量在MANS组和联用组均较对照组明显减少（P均〈0.05），在DTZ组无明显变化（P〉0.05）；在联用组较MANS组亦明显减少（P〈0.05）。气道杯状细胞内MUC5AC的量在MANS组和联用组均较对照组显著增多（P均〈0.05）；在单用DTZ组没有明显变化（P〉0.05）。结论 在丙烯醛诱导的大鼠气道黏液高分泌模型中，气管内滴入MANS可以减少气道黏液的分泌，单用DTZ气管内滴入不能减少气道黏液的分泌。但二者联合滴入时DTZ对MANS抑制气道黏液的分泌可能具有协同作用。     

Role of extracellular signal-regulated kinase 1/2 in cigarette smoke-induced mucus hypersecretion in a rat model

Background  Airway mucus hypersecretion is an important pathophysiological feature of chronic obstructive pulmonary disease, which is closely associated with cigarette smoking. However, the signal transduction pathway from the cell surface to the nucleus through which cigarette smoke causes upregulation of mucin gene expression is not well known. This study was designed to investigate the role of extracellular signal-regulated Kinase 1/2 (ERK 1/2) in airway mucus hypersecretion induced by cigarette smoke in rats.

Methods  A rat model of airway mucus hypersecretion was induced by exposure to cigarette smoke for 4 weeks．Rats exposed to inhalation of cigarette smoke or normal saline were given an intraperitoneal injection of U0126, a specific MEK1 kinase inhibitor, at doses of 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg and 1 mg/kg for 14 days. Expression of MUC5AC mRNA and protein, ERK 1/2 and phosphorylated-ERK 1/2 (p-ERK 1/2) were detected by RT-PCR, immunohistochemistry and Western blotting.

Results  Cigarette smoke significantly increased airway goblet cells metaplasia, induced the overexpression of MUC5AC mRNA and protein in bronchial epithelia, and increased the ratio of p-ERK 1/2 and ERK 1/2. U0126 significantly attentuated the expression of MUC5AC mRNA and protein induced by cigarette smoke (P <0.05). Moreover, there was a significant positive correlation between the ratio of p-ERK1/2 to ERK1/2 and the expression of MUC5AC mRNA and protein (P <0.05).

Conclusions  Inhibition of ERK 1/2 by U0126 decreased the ratio of p-ERK 1/2 to ERK 1/2 and expression of MUC5AC mRNA and protein. ERK 1/2 may play an essential role in cigarette smoke-induced mucus hypersecretion in vivo.

     

晚期糖基化终末产物受体促进甲苯二异氰酸脂哮喘小鼠MUC5AC表达及气道黏液高分泌

目的 探讨晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号对甲苯二异氰酸脂(TDI)哮喘小鼠黏蛋白MUC5AC表达及气道黏液分泌的影响.方法 在体内水平上建立TDI小鼠哮喘模型,实验分4组:对照组、TDI溶剂(AOO)致敏激发组、TDI致敏激发组、RAGE抑制剂处理组.采用糖原染色评估各组间气道黏液分泌情况,Western blotting及免疫组化法检测MUC5AC表达水平.同时通过Western blotting检测各组间细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路磷酸化水平.在体外水平配制TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA)复合物,刺激人支气管上皮细胞(16HBE)及经慢病毒转染空载体和shRNA-RAGE载体的人支气管上皮细胞,检测各组MUC5AC及ERK通路分子表达情况,加入ERK抑制剂U0126后,进一步评估MUC5AC mRNA表达情况.结果 与对照组相比,TDI哮喘组小鼠糖原染色阳性率及MUC5AC表达升高(P<0.05),p-ERK表达增多(P<0.05),RAGE抑制剂处理组糖原染色阳性率及MUC5AC表达较TDI组减少(P<0.05).同时,p-ERK表达下降(P<0.05).体外水平,与对照组相比,TDI-HSA处理组MUC5AC mRNA及p-ERK表达增多(P<0.05),sh RNA-RAGE组MUC5AC mRNA及p-ERK表达下调(P<0.05),ERK抑制剂预处理组,MUC5AC mRNA表达下调(P<0.05).结论 TDI小鼠哮喘模型下RAGE可能通过激活ERK通路促进黏蛋白MUC5AC的表达及黏液高分泌的发生.     

环孢霉素A治疗结膜干燥症对其结膜上皮杯状细胞与黏蛋白的影响

目的探讨环孢霉素A滴眼液对结膜干燥症老鼠杯状细胞与结膜上皮粘蛋白5AC（MUC5AC）表达的影响。方法30只C57BL6小鼠皮下注射东莨菪碱12d制造结膜干燥症模型鼠，十只为干眼对照组不使用局部治疗，十只小鼠使用1μL 0．05％环孢霉素A（CsA）滴眼每日3次（干眼＋C认组），十只小鼠使用1μL蓖麻油滴眼每日3次（干眼＋载体组）。另取十只为正常组，作为未作处理的对照。采用PAS染色、免疫组织化学及Western blot方法。对上述4组小鼠结膜上皮细胞中的杯状细胞与MuC5AC的表达进行检测。结果杯状细胞数目、MUC5AC免疫组化及Western blot表达在正常组和干眼＋CsA组均高于眼对照组和干眼＋载体组（P均〈0．01）；各组杯状细胞数目与MUC5AC表达均呈正相关（P均〈0．01）。结论CsA可稳定膜结膜杯状细胞，促进黏蛋白分泌，从而维持泪腺分泌的基本功能。     

复发性翼状胬肉中MUC5AC的表达与泪膜稳定性的相关研究

目的：检测粘蛋白MUC5AC在复发性翼状胬肉组织中的表达水平,初步探讨粘蛋白MUC5AC与翼状胬肉术后泪膜稳定性的相关性。方法：应用SP免疫组织化学染色法检测5例正常结膜组织、6例原发性翼状胬肉组织及22例复发性翼状胬肉组织中粘蛋白MUC5AC的免疫学定位及表达,所有病例术前均检查泪膜破裂时间（BUT）、泪液分泌（Schirmer）试验,分析MUC5AC在复发性翼状胬肉中的表达与BUT、Schirmer实验的相关性。结果：正常结膜组织、原发性翼状胬肉组织及复发性翼状胬肉组织的Schirmer试验、BUT组间差异有统计学意义,P〈0.05;MUC5AC在正常结膜组织、原发性翼状胬肉组织及复发性翼状胬肉组织的表达组间差异有统计学意义,P〈0.05;复发性翼状胬肉组MUC5AC阳性细胞计数与正常结膜组比较差异有统计学意义,P〈0.05;Spearman相关分析,MUC5AC的表达与BUT呈负相关;r=0.616。结论：粘蛋白MUC5AC在复发性翼状胬肉中高表达与翼状胬肉术后泪膜稳定性下降有关。     

人MUC5AC基因启动子荧光素酶报告 基因载体的构建及其转录活性分析

目的：克隆人黏蛋白/黏液素5AC(MUC5AC)基因启动子并构建该启动子的荧光素酶报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性。方法：运用Vector NT1软件包对MUC5AC基因5′端1 348 bp进行启动子特征分析;以人A549细胞基因组DNA为模板分离出人MUC5AC基因5′端非翻译区大小为1 348 bp的片段并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板对启动子进行5′端删除分析,分别扩增737 bp(-689/+48),372 bp(-324/+48),112 bp(-64/+48)的片段,与荧光素酶报告基因载体重组构建,通过双荧光素酶活性进行转录活性分析。应用定点突变技术,在重组质粒的基础上建立MUC5AC启动子区SP-l结合位点和核因子（NF）-κB结合位点单独突变体,并测定中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导的转染细胞荧光素酶的相对活性。结果：序列分析发现人MUC5AC基因5′端1 348 bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功构建了4个不同长度的MUC5AC启动子报告基因载体。双荧光素酶活性分析372 bp片段为有活性的最小片段。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导SP-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究MUC5AC基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。MUC5AC 5′上游序列中-324/-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件SP-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用。     

铜绿假单胞菌诱导气道上皮细胞产生MUC5AC的分子机制

目的探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa,Pa）诱导气道上皮细胞表达产生粘蛋白MUCSAC的影响,并探讨其可能的分子机制。方法体外培养NCI—H292细胞,用Pa感染后,采用ELISA检测MUC5AC的产生情况;并用商品化的MMP-9活性检测试剂盒检测其产生以及酶活性情况。同时,采用EGFR,P13K,NADPH,ROS和MMP特异性抑制剂AG1478,LY294002,DPI,NAC和GM6001预处理NCI—H292细胞,观察MUC5AC以及MMP-9的产生情况。结果Pa能以时间依赖性方式诱导NCI—H292细胞产生MMP-9．并增加其活性。EGFR活化后,经P13K途径激活Racl并诱导MMP-9的表达,最终诱导MUC5AC产生。结论Pa经EGFR／P13K／Racl／NADPH／ROS／MMP-9通路诱导NCI—H292细胞产生MUC5AC。     

哮喘小鼠肺组织中水通道蛋白5和黏蛋白5AC的表达变化及其相关性研究

目的探讨支气管哮喘(以下简称哮喘)小鼠肺组织水通道蛋白5(AQP5)和黏蛋白MUC5AC基因和蛋白的表达变化及其两者的相关性。方法制作小鼠哮喘模型,测定支气管肺泡灌洗液细胞分类及肺组织湿干重比值,应用Real-time PCR法测定哮喘组(OVA组)和对照组肺组织中AQP5和MUC5AC mRNA的表达,应用免疫组化法测定AQP5在肺组织中的分布,免疫印记法、ELISA法测定AQP5和MUC5AC蛋白在肺组织中的表达。结果小鼠哮喘组肺组织中AQP5表达较对照组明显减低(P<0.01),而MUC5AC表达显著升高(P<0.01),两者呈负相关(r=0.901,P<0.01)。结论哮喘时肺组织中AQP5表达的减低可能与气道MUC5AC表达的升高有关,从而促进了气道黏液过度分泌。     

哮喘患者气道上皮钙激活的氯离子通道1表达增加与黏液高分泌

目的　通过检测哮喘患者气道上皮钙激活的氯离子通道 1 (CaCC1 )和黏蛋白MUC5AC、黏膜下腺黏蛋白的表达情况 ,探讨哮喘患者气道黏液高分泌的机制。方法　取 2 0 0 4年华西医院胸外科手术病人离体标本 ,其中哮喘患者 6例 ,非哮喘患者 1 0例作为对照。分别用原位杂交、免疫组化、阿辛兰 PAS染色检测气道上皮细胞CaCC1 、MUC5AC及黏蛋白的表达。结果　与正常对照组比较 ,哮喘组患者气道上皮CaCC1 、MUC5AC表达细胞较对照组增加 ,强度增强 (P值分别为0 .0 1和 0 . 0 4 ) ;哮喘组和对照组气道上皮的杯状细胞均有黏蛋白的分泌 ,哮喘组分泌黏蛋白的杯状细胞较对照组增加 (P =0 . 0 1 ) ;哮喘组黏膜下腺较对照组分泌黏蛋白增加 (P <0 . 0 5 )。哮喘组气道上皮CaCC1 表达增加与MUC5AC表达增加呈正相关 (P =0 . 0 1 ,r=0 . 76 5 )。哮喘组气道上皮CaCC1表达增加与该组患者气道上皮黏蛋白阳性细胞百分比增加呈正相关 (P =0 .0 1 ,r =0 . 75 7) ;哮喘组气道上皮CaCC1 表达增加与黏膜下腺光密度、着色面积、光密度×着色面积增加均呈正相关 (P值分别为 0 . 0 3、0 . 0 2和 0. 0 1 ,r分别为 0 . 5 5 4、0 . 5 94和 0 . 6 1 9)。结论　CaCC1 在哮喘患者气道上皮表达增加 ,可能与哮喘患者的气道黏液高分泌密切相关。