高尿酸通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍

目的高尿酸血症是心血管和肾脏疾病的独立风险因素,本研究拟从miR-155入手初步探索其在高尿酸导致内皮功能障碍过程的作用机制。方法培养人脐静脉内皮细胞系HUVEC,以600μmol/L的尿酸孵育24、48 h之后收集细胞及细胞上清液,检测eNOS的蛋白表达及上清液的NO含量;预测并利用双荧光素酶系统验证miR-155的靶基因,随后利用荧光定量PCR检测高尿酸环境中内皮细胞miR-155的表达情况,通过miR-155 inhibitor的转染检测它对内皮功能障碍的影响。结果 600μmol/L的尿酸能诱导内皮细胞eNOS表达下降,NO分泌减少;microRNA在线分析软件及双荧光素酶报告实验提示eNOS的翻译水平受miR-155直接调控;同时发现高尿酸刺激内皮细胞后miR-155的表达上调,而miR-155 inhibitor能抑制它的表达;内皮细胞转染miR-155 inhibitor之后再进行高尿酸的孵育,eNOS的表达及NO的分泌水平与单独高尿酸孵育组相比均显著升高。结论高尿酸可通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍。     

高尿酸通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍

目的高尿酸血症是心血管和肾脏疾病的独立风险因素,本研究拟从miR-155入手初步探索其在高尿酸导致内皮功能障
碍过程的作用机制。方法培养人脐静脉内皮细胞系HUVEC,以600 μmol/L的尿酸孵育24、48 h之后收集细胞及细胞上清液,
检测eNOS的蛋白表达及上清液的NO含量;预测并利用双荧光素酶系统验证miR-155的靶基因,随后利用荧光定量PCR检测
高尿酸环境中内皮细胞miR-155的表达情况,通过miR-155 inhibitor的转染检测它对内皮功能障碍的影响。结果600 μmol/L
的尿酸能诱导内皮细胞eNOS表达下降,NO分泌减少;microRNA在线分析软件及双荧光素酶报告实验提示eNOS的翻译水平
受miR-155直接调控;同时发现高尿酸刺激内皮细胞后miR-155的表达上调,而miR-155 inhibitor能抑制它的表达;内皮细胞转
染miR-155 inhibitor之后再进行高尿酸的孵育,eNOS的表达及NO的分泌水平与单独高尿酸孵育组相比均显著升高。结论高
尿酸可通过miR-155下调eNOS表达而导致内皮细胞功能障碍。
     

miRNA-24对血管内皮细胞eNOS表达/活性及其代谢产物NO生成的影响

目的 探讨微小RNA(miRNA)-24对血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达、活性调节的分子机制及其代谢产物的影响.方法 构建miRNA-24高表达质粒,并转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC).MTT法检测细胞的增殖情况,划痕实验检测细胞的迁移能力,RT-PCR和Western印迹法检测细胞eNOS mRNA和蛋白的表达情况,ELISA法检测eNOS的表达活性,硝酸还原法测定细胞培养上清液中NO的含量.结果 与对照组相比,转染miRNA-24后细胞增殖能力下降54.32%、迁移能力下降48.62%;转染miRNA-24后eNOS mRNA降低43.92%,蛋白表达量减少42.71%;转染miRNA-24后eNOS的酶活性降低73.20%,同时NO的合成与释放减少55.29%.结论 miRNA-24高表达抑制eNOS的表达及酶活性;miRNA-24抑制代谢产物NO的合成与释放,这可能成为心血管疾病防治的分子靶点.     

依帕司他对高糖诱导的血管内皮损伤的保护作用

目的初步研究依帕司他保护高糖诱导的血管内皮细胞损伤的作用。方法体外培养脐静脉血管内皮细胞HUVEC,高糖刺激8 h后利用化学发光法检测细胞培养上清中NO的含量,利用Real time PCR和Western blot分别检测细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA和蛋白表达水平,以同浓度的甘露醇作为对照。给予依帕司他(0.1μmol/L)预处理30 min,随后再进行高糖培养,检测NO的含量以及eNOS的mRNA和蛋白表达,同时检测依帕司他的靶向基因醛糖还原酶(AR)以及NO的上游基因NADPH氧化酶4(NOX4)的蛋白表达水平。结果高糖培养8 h之后,血管内皮细胞分泌NO下降,eNOS的mRNA和蛋白表达水平下降,与甘露醇对照组相比,具有统计学差异(P<0.05);预先给予依帕司他处理后再进行高糖培养,细胞中eNOS的mRNA和蛋白表达水平均升高,NO表达上调,与单独高糖培养组相比,具有统计学差异(P<0.05)。同时,细胞中AR和NOX4的蛋白表达下降。结论高糖可以诱导内皮细胞损伤,表现为NO的分泌水平降低。依帕司他可能是通过抑制AR和NOX4的表达而发挥对血管内皮细胞损伤的保护作用。     

长链非编码RNA Beta2.7通过上调eNOS/NO通路影响内皮细胞功能

 目的 探索在内皮细胞中调控内皮型-氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表达及其磷酸化的长链非编码RNA （long non-coding RNA，LncRNA）分子及其对内皮细胞功能的影响。方法 培养原代小鼠主动脉内皮细胞，构建LncRNA-Beta2.7过表达质粒、LincRNA-p21干扰质粒、LncRNA-ANRIL干扰质粒、LncRNA-H19过表达质粒，通过慢病毒载体实现稳定转染。稳定转染后，收集内皮细胞及其培养基上清，PCR检测eNOS mRNA表达水平，Western blot检测eNOS、p-eNOS表达水平，还原比色法检测细胞内及培养基上清的NO含量；稳定转染的内皮细胞通过划痕实验和小管形成实验验证LncRNA对内皮细胞功能的影响。结果 过表达LncRNA-Beta2.7上调内皮细胞eNOS mRNA与蛋白的表达水平，且p-eNOS/eNOS比值保持不变；过表达LncRNA-Beta2.7后，内皮细胞NO分泌增多，其划痕愈合速率以及在形成血管过程中的分支数和小管总长度均显著升高。而其余3种LncRNA的作用并不显著。结论 LncRNA-Beta2.7在内皮细胞中通过上调eNOS的表达激活eNOS/NO信号通路，增强血管内皮功能。     

异丙酚抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞黏附分子表达

 目的  研究异丙酚抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞黏附分子的表达并探讨其可能的机制。方法  采用Histopaque-1077溶液提取人外周血单核细胞。采用一氧化氮(NO)试剂盒检测脐静脉内皮细胞NO生成。采用Western blot检测内皮细胞黏附分子、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)(总蛋白,单体及双体)、eNOS磷酸化水平及caveolin-1表达。结果  高糖上调血管内皮细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)的表达,促进单核细胞-内皮黏附,并减少NO生成。异丙酚改善高糖环境下NO生成,并抑制VCAM-1表达及单核细胞-内皮黏附。异丙酚的作用可被eNOS抑制剂L-NAME所拮抗。异丙酚能上调高糖环境下eNOS-Ser1177磷酸化水平及双体/单体比值,下调高糖环境下eNOS-Thr495磷酸化水平及caveolin-1表达。结论  异丙酚通过调节高糖环境下eNOS的磷酸化水平、单体/双体比值及caveolin-1表达,改善内皮细胞NO生成,进而抑制内皮细胞黏附分子的表达及单核细胞-内皮细胞的黏附。     

内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化.方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况.结果 RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120 h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05).转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异.结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定.     

内皮型一氧化氮合酶基因在犬内皮细胞的转染和表达

目的探讨转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因后内皮细胞(EC)的功能变化。方法采用脂质体法转染eNOS基因于实验犬EC;RT-PCR和免疫组化法检测转染效果;分别采用比色法和酶联免疫法检测细胞培养液一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)和vWF的浓度;并观察转染细胞生长增殖情况。结果RT-PCR产物电泳和测序及免疫组化法检测证实转染效果满意;转染后EC培养液NOS和NO浓度在不同时间明显升高(120h分别为33.53和32.99),与正常组对比差异显著(P<0.05)。转染后细胞生长增殖和vWF含量无显著差异。结论通过脂质体法成功地将eNOS基因转染于实验犬EC;转染后eNOS基因在mRNA和蛋白质水平均高效表达;内皮细胞eNOS活性显著增强;转染后细胞生物学功能稳定。     

miRNA-375 靶向磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位 α 对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨miRNA-375 靶向磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚单位α（PIK3CA）对宫颈癌细胞增殖和 迁移的影响。方法 选取宫颈癌细胞系SiHa,分别转染miRNA-375 模拟基因、miRNA-375 抑制剂、对照模拟 基因及对照抑制剂,采用RT-PCR 法检测miRNA-375 表达,Western blot 检测PIK3CA 蛋白表达,MTT 法检 测细胞增殖活性,划痕实验检测细胞迁移能力。双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-375 与PIK3CA 的靶向 关系。结果 转染miRNA-375 模拟基因后miRNA-375 表达上调,PIK3CA 蛋白表达降低（P <0.05）;转染 miRNA-375 抑制剂后miRNA-375 表达降低,PIK3CA 蛋白表达增强（P <0.05）。转染miRNA-375 模拟基 因后SiHa 细胞增殖活性、迁移能力降低（P <0.05）;转染miRNA-375 抑制剂后SiHa 细胞增殖活性、迁移 能力增强（P <0.05）。miRNA 靶基因预测软件检测结果显示,miRNA-375 能作用于PIK3CA 3''-UTR。与转 染对照模拟基因比较,共转染miRNA-375 模拟基因与PIK3CA-WT 可使SiHa 荧光素酶活性降低（P <0.05）。 结论 miRNA-375 可抑制宫颈癌细胞增殖及迁移,其机制可能与靶向调控PIK3CA 有关。     

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α(HIF-1α)促血管内皮祖细胞(EPCs)成血管活性的可行性.方法密度梯度法分离人外周血EPCs,电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPCs,RT-PCR法观察未转染/转染质粒在转染后3、12、20、72 h,HIF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达含量的变化;免疫组化法检测常氧中转染前后HIF-1α蛋白表达、VEGF受体Flk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异;ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶(eNOS)含量的改变.结果HIF-1α基因有效转染入EPCs;HIF-1αmRNA在未转染时即有表达,在HIF-1α质粒转染后3、12、20、72 h,含量较未转染时增加(P＜0.05);HIF-1α过表达诱导VEGF表达上调(P＜0.05).Flk-1蛋白在常氧下有一定含量,在HIF-1α质粒转染后Flk-1蛋白表达进一步增加.VEGF释放含量在HIF-1α过表达组显著增加(P＜0.05);HIF-1α诱导eNOS含量增加,并与时间、VEGF刺激量成正比.结论HIF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs,促进其下游靶基因及受体表达,引起相应的功能学改变,促EPCs向内皮细胞分化、扩增,可进一步应用于基因治疗.     

诱导正常血管内皮细胞具备肿瘤血管特性的研究

[目的]探讨用肿瘤细胞培养上清液诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是否具备肿瘤血管内皮细胞的特性,旨在寻找一种简便的方法,解决肿瘤血管内皮细胞不易获得的难题.[方法]HUVEC用含不同浓度人肝癌细胞株HepG2培养上清的条件培养液培养,3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑盐法(MTS)检测其增殖率,免疫细胞化学法结合图像定量分析测量血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤内皮标记物1和8(TEM1、TEM8)的mRNA表达.[结果]含体积分数10%、20%、40%HepG2培养上清的条件培养液培养,HUVEC增殖率分别为71%、89%、109%.HUVEC用含体积分数50%HepG2培养上清液的条件培养液培养后,VEGFR2平均光密度值明显高于对照组(P＜0.05),且TEM1及TEM8呈阳性表达,而对照组不表达.[结论]HepG2上清液促进HUVEC增殖,增殖后的HUVEC具备肿瘤血管内皮细胞的特性.     

内皮祖细胞的生物学特性研究进展

内皮祖细胞在体内外能分化为成熟内皮细胞。目前,内皮祖细胞已被证实存在于成年人外周血,骨髓和人脐带血中。本综述总结了近年来内皮祖细胞的生物学研究进展,并讨论了其在心血管疾病中的潜在的治疗作用。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化。方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强。结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降。     

人直肠癌淋巴管生成相关因子与癌转移关系的探讨

目的 探讨血管内皮生长因子C在直肠腺癌淋巴管生成中的作用。方法 用免疫组化SABC染色法观察63例直肠腺癌组织中VEGF-C和淋巴管内皮透明质酸受体1蛋白表达的情况。结果 直肠腺癌组织周边部淋巴管密度比内部明显增高（P〈0．01）；直肠腺癌组织周边部VEGF-C阳性细胞数比内部明显增多（P〈0．01）。VEGF-C表达阳性细胞密度和淋巴管密度呈正相关；直肠腺癌组织中VEGF-C异位表达在淋巴管内皮细胞上，而在血管中未见表达，差异有显著性（P〈0．01）。结论 VEGF-C促进直肠腺癌淋巴管的病理生成，淋巴管生成提示在为肿瘤细胞提供养分的同时，也为肿瘤转移创造了条件。     

缺血性心脏病慢性心力衰竭患者循环内皮微粒变化的临床意义

目的 观察缺血性心脏病慢性心力衰竭(CHF)患者循环血内皮微粒(EMPs)变化与内皮功能、心功能变化的关系.方法 选择78例缺血性心脏病慢性心力衰竭患者和健康对照组28例.于治疗前、治疗3个月后采集CHF患者静脉血,采用流式细胞术测定患者血浆EMPs,硝酸还原酶比色法测定血清一氧化氮(NO),放射免疫法测定内皮素-1(ET-1),同时测定血流介导的内皮依赖性血管舒张功能(FMD)及左心室射血分数(LVEF)变化.结果 与对照组比较,CHF患者循环血EMPs、ET-1水平升高,FMD、LVEF和NO降低(均P＜0.01),且上述指标随着心功能分级严重的患者改变更为明显;治疗后EMPs、ET-1水平降低,FMD、LVEF和NO升高(均P＜0.05);EMPs与ET-1水平呈显著正相关,与FMD、LVEF和NO水平呈显著负相关(分别rs=0.327,P ＜0.05; rs=-0.684,P＜0.01;rs=-0.602,P＜0.01;rs=-0.539,P＜0.01).结论 缺血性心脏病CHF患者EMPs升高与心力衰竭严重程度和内皮功能障碍程度相关;EMPs对于评价缺血性心脏病CHF患者病情严重程度、治疗效果及内皮功能障碍程度具有一定的临床意义.     

糖尿病大鼠血管内皮损伤的实验研究

内皮损伤研究方兴未艾。为了探讨血管损伤与早发性糖尿病大血管病变之关系,分别随机抽取３０只成年健康雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠和四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠,测定其循环内皮细胞计数（ＣＥＣ）和血管紧张素转化酶（ＡＣＥ）血清活力。结果显示：糖尿现鼠ＡＣＥ高于对照ＡＣＥ（９８０．０２±１３２．１８ｕ／５６０．０７±１５０．０３ｕ）,糖尿病鼠ＣＥＣ（２．５２±０．６７个／０．９ｕｌ）高于健康鼠ＣＥＣ（０．７２±０．２     

内皮祖细胞在急性肺损伤中应用的研究进展

急性肺损伤是由各种肺内外因素导致的进行性呼吸困难和难治性低氧血症,其病理特征包括炎症反应及肺泡-毛细血管屏障功能破坏,微循环血管内皮损伤是主要标志.内皮祖细胞可以从骨髓动员迁移到损伤部位,分化为成熟内皮细胞发挥直接修复作用,并通过间接免疫调节作用改善微环境.此外内皮祖细胞还可以分泌细胞因子以自分泌或旁分泌方式促进新生血...     

可溶性血管内皮细胞生长抑制因子基因的克隆与表达

目的：对可溶性人血管内皮细胞生长抑制因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＶＥＧＩ）基因进行克隆和表达,检测表达产物对血管内皮细胞增殖的抑制活性。方法：将可溶性人ＶＥＧＩ基因克隆入载体ｐＵＣ１９后测序;再将正确的ＶＥＧＩ基因亚克隆入表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴｂ,ＩＰＴＧ诱导表达;初步纯化表达产物,检测对新生牛主动脉内皮细胞增殖抑制活性。结果：可溶性人ＶＥＧ     

血管内皮生长因子对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨缺氧对培养人静脉内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预性影响。方法 （1）人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定。（2）建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型,TUNEL法观测不同缺氧时间（0、12、24、48h）对内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预作用。结果 随缺氧时间延长,NUVECs凋亡率显著升高,血管内皮生长因子抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡。结论 内皮细胞的过渡凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素,血管内皮生长因子通过抑制内皮细胞凋亡,而具有内皮细胞保护作用。