MnCl2引起SH-SY5Y细胞内质网应激及Sigma-1受体的保护作用

目的探讨内质网应激(ERS)及其介导的细胞凋亡在锰引起的神经毒性中的作用,进一步探讨Sigma-1R在锰致神经系统损害中的作用。方法以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为细胞模型,通过MTT比色法检测0.5、1、2、4、8和24 h处MnCl2对细胞存活的影响,流式细胞技术(FCM)检测上述时间段MnCl2对细胞凋亡的影响,Western blot检测MnCl2作用上述时间后,细胞ERS分子伴侣GRP78、Sigma-1受体(Sigma-1R)、CHOP及凋亡相关蛋白Caspase-4表达的变化,Sigma-1R拮抗剂BD1047抑制其活性4和24 h后,检测细胞凋亡的情况。结果 MnCl2可呈时间、剂量依赖性地降低细胞存活率,并诱导SH-SY5Y细胞凋亡;MnCl2上调ERS分子伴侣GRP78、Sigma-1R、CHOP及Caspase-4的表达;加入拮抗剂BD1047后,在4和24 h细胞存活率明显下降。结论 MnCl2可诱导SH-SY5Y细胞发生ERS,ERS通过上调Sigma-1R的表达,增加细胞的存活率,这可能是预防锰神经毒性的机制之一。     

BNIP3介导锰经线粒体凋亡途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡的研究

目的探讨线粒体蛋白BNIP3在锰诱导线粒体依赖的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。方法取对数生长期的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,经MnCl_2处理24 h后应用透射电子显微镜直接观察MnCl_2作用下SH-SY5Y细胞的凋亡情况,使用流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞线粒体膜电位(Δψm),通过蛋白免疫印记法(Western blot)检测BNIP3及凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。并使用shRNA将SH-SY5Y细胞中的BNIP3沉默,观察BNIP3对MnCl_2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡、线粒体膜电位丢失(Δψm)及凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响。结果 MnCl_2可使线粒体膜电位逐渐丢失(F=49.061,P0.01)、并使线粒体蛋白BNIP3及凋亡相关蛋白Caspase-3的表达随着MnCl_2浓度的提高而上升(F=334.832,F=299.902,均P0.01)、明显增加SH-SY5Y细胞的凋亡小体个数,上述差异均有统计学意义。沉默BNIP3(F=1.301,P=0.318,t=32.647,P0.01)可以减少MnCl_2诱导线粒体膜电位的丢失(F=1.786,P=0.252;t=20.290,P0.01),减少凋亡相关蛋白Caspase-3的表达(F=2.816,P=0.168;t=22.073,P0.01)并使SH-SY5Y凋亡小体的个数减少,上述差异均有统计学意义。结论在MnCl_2通过线粒体凋亡途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡的过程中BNIP3起到了重要作用,这种调控机制可能是锰产生神经毒性的作用机制之一。     

中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子对糖氧剥夺/再灌注诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

目的研究中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)对糖氧剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用。方法体外培养SH-SY5Y细胞,对细胞进行糖氧剥夺(OGD)6 h,再灌注(R)12 h。在再灌注时期,根据是否给予重组人MANF蛋白处理(2μmol·L-1,12 h),将细胞分为正常对照组(NC)、NC+MANF组、OGD/R组和OGD/R+MANF组。随后光学显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态的改变,MTT法检测细胞存活率,PI染色法检测细胞死亡率,免疫印迹法检测内源性MANF蛋白、内质网(ER)应激相关蛋白GRP78/Bi P、p-IRE1、p-e IF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表达。结果光学显微镜下可见OGD/R组SH-SY5Y细胞胞体变小、变圆,突起缩短或消失。进一步研究发现,MANF能明显改善OGD/R诱导的SHSY5Y细胞存活率下降和死亡率增加。免疫印迹法检测发现:OGD/R组细胞内源性MANF蛋白表达增高;ER应激相关蛋白GRP78/Bi P、p-IRE1、p-e IF2α表达增高;促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表达明显高于NC组。给予重组人MANF蛋白可降低OGD/R组GRP78/Bi P、CHOP及cleaved caspase-3的表达水平。结论 OGD/R可诱导凋亡性ER应激;MANF蛋白可通过抑制OGD/R诱导的凋亡性ER应激而对SH-SY5Y细胞具有保护作用。     

葫芦素B抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖机制的初步研究

目的研究葫芦素B对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖的影响及其作用的分子机制。方法通过MTT法检测葫芦素B对SH-SY5Y细胞增殖的影响,流式细胞仪检测葫芦素B对SH-SY5Y细胞凋亡和生理水平上活性氧含量、线粒体膜电位的影响。Hoechst 33258染色检测药物处理前后细胞形态的变化。Westernblot检测葫芦素B处理SH-SY5Y细胞24 h前后Bcl-2、Bax、p21、p53等蛋白合成的变化。结果实验浓度范围内,葫芦素B可时间与浓度依赖性地抑制SH-SY5Y细胞增殖;浓度依赖性地诱导SH-SY5Y细胞凋亡、活性氧水平升高和线粒体膜去极化;在蛋白水平上,葫芦素B能诱导凋亡抑制蛋白Bcl-2下调,促凋亡蛋白Bax、p21、p53上调。结论葫芦素B在体外能显著抑制SH-SY5Y细胞增殖,这一影响可能通过诱导细胞凋亡、ROS积累、线粒体膜去极化及其相关蛋白表达变化来实现。     

不同浓度利多卡因对SH-SY5Y细胞乳酸脱氢酶及Caspase-3表达的影响

目的:在离体细胞培养条件下,通过观察利多卡因对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放率、细胞凋亡率及Caspase-3表达水平的影响,探讨不同浓度利多卡因对SH-SY5Y细胞的神经毒性损伤作用。方法:神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)离体培养,分为4组,即:正常培养组(Con组,即对照组,未经药物处理);0.5%,1%,2%利多卡因组(L1,L2,L3组):分别用相应浓度的利多卡因处理SH-SY5Y细胞10 min。分别检测LDH释放率、细胞凋亡率及Caspase-3表达水平。结果:正常对照组细胞LDH释放率为11.7%,1%和2%利多卡因处理10 min后,LDH释放率明显增加,分别为18.8%和28.5%。Con组细胞凋亡率为6.1%,L1组、L2组、L3组细胞凋亡率分别为14.9%,19.2%和23.0%。正常对照组Capase-3表达相对较低,0.5%利多卡因处理10 min后Caspase-3表达即有增加,1%和2%利多卡因组Caspase-3表达明显增加。结论:3种浓度利多卡因均可致SH-SY5Y细胞损伤,且随浓度的增加,损伤作用明显。     

自噬参与锰诱导的SH-SY5Y细胞毒性研究

目的研究不同剂量的锰(Mn)对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞生长增殖的影响以及诱导自噬的情况。方法体外培养SH-SY5Y细胞,以200～1 000μmol/L MnCl2处理后进行四唑盐比色实验(MTT)观察MnCl2对细胞的抑制作用,MDC染色法检测自噬小泡形成情况,Western blot检测自噬标志蛋白LC3和Bclin-1的表达和活化情况。DCFH-DA染色检测活性氧(ROS)含量。结果 MTT结果显示200～1 000μmol/L MnCl2对细胞的生长增殖有显著的抑制作用。Western blot结果显示MnCl2处理后LC3蛋白表达增加并且活化,Bcelin-1蛋白表达增加,细胞产生自噬小泡。与对照组相比,200、400和800μmol/L MnCl2组ROS含量明显升高。结论一定剂量的MnCl2对SH-SHY5Y细胞的生长增殖有明显的抑制作用,这一作用可能是通过破坏胞内氧化还原平衡导致ROS大量产生继而诱发细胞发生自噬性的死亡。     

芹菜素对SH-SY5Y细胞内质网应激诱导凋亡的影响

目的 探讨芹菜素逆转毒胡萝卜素(TG)所致人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞内质网应激诱导凋亡的分子机制。方法 采用细胞计数试剂-8(CCK-8)检测不同浓度TG和不同处理时间对SH-SY5Y细胞活力的影响，观察芹菜素对SH-SY5Y细胞的保护作用；蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测SH-SY5Y细胞内质网应激球蛋白结合蛋白(BIP)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12(CASPASE-12)及细胞凋亡Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)表达变化。结果 与对照组(CON组)比较，TG可浓度和时间依耐性降低SH-SY5Y细胞活力(P<0.01);10、20及30μmol·L^-1芹菜素处理SH-SY5Y细胞1 h,与1.0μmol·L^-1TG比较，10μmol·L^-1芹菜素能逆转细胞活力(P<0.01),效果优于20、30μmol·L^-1芹菜素；芹菜素预处理能降低BIP、CHOP表达(P<0.05),增强B...     

水飞蓟宾对锰致神经毒性的干预研究

目的研究不同剂量的水飞蓟宾(silibinin)对锰致人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞毒性的对抗作用及可能机制。方法体外培养SH-SY5Y细胞,加入不同浓度的水飞蓟宾(5~20μmol/L),继续培养24 h,吸出后加入MnCl2(终浓度为0.6 mmol/L),MTT法检测细胞活力,Western blot检测自噬标志蛋白LC3和Beclin-1的表达和活化情况,DCFH-DA染色检测活性氧(ROS)含量,同时检测水飞蓟宾的体内外抗氧化活性。结果 MTT结果显示(5~20μmol/L)的水飞蓟宾对MnCl2诱导的细胞损伤有显著的拮抗作用。Western blot结果显示水飞蓟宾能剂量依赖性地抑制MnCl2处理诱导的自噬性损伤的发生。与对照组相比,0.6 mmol/L的MnCl2处理组ROS含量明显升高,而水飞蓟宾给药则能显著抑制ROS的产生,同时体内外的抗氧化能力检测显示水飞蓟宾抗具有较强的总抗氧化能力和抗超氧阴离子自由基活力,能显著恢复细胞内GSH和SOD的活力。结论水飞蓟宾能剂量依赖性地对抗MnCl2诱导的SH-SY5Y细胞损伤,这一作用可能是通过清除细胞内ROS继而抑制自噬性死亡的发生来实现的。     

蜗牛多肽混合物抗过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用

目的观察蜗牛多肽混合物对过氧化氢(H2O2)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制作用及其可能机制。方法用H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤,MTT法测定细胞存活率;39～1250 mg·L-1蜗牛多肽混合物处理后,Hoechst染色检测细胞凋亡;罗丹明123染色检测线粒体通透性;细胞免疫化学技术和Western blot技术分别检测增殖细胞核抗原(PCNA)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。结果 1.54 mmol·L-1H2O2可诱导SH-SY5Y细胞凋亡。用39～156 mg·L-1浓度的蜗牛多肽混合物处理后,H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡数量明显减少,同时可减少H2O2引起的线粒体通透性增加,升高PCNA与BDNF的表达(P﹤0.01)。结论蜗牛多肽混合物可抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其作用机制可能与其增加细胞PCNA与BDNF的表达有关。     

砷及MPST过表达对SH-SY5Y细胞GRP78/CHOP通路的影响

目的探讨内质网应激是否参与亚砷酸钠(NaAsO2)神经毒性损伤,明确3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,MPST)过表达是否调节砷诱导的内质网应激。方法通过构建MPST基因慢病毒表达载体来获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株作为SH-MPST过表达组,另设空载体转染细胞为SH-PEB组,染砷组(NaAsO2组),内质网应激阻断剂TUDCA组,TUDCA预处理染砷组。Western blot法分别检测过表达MPST、染砷及TUDCA预处理后细胞内GRP78和CHOP蛋白表达的变化。结果单纯MPST过表达不影响SH-SY5Y细胞内GRP78、CHOP蛋白的表达水平;经NaAsO2处理后,SH-PEB细胞内GRP78、CHOP蛋白明显上调(P<0.01),而被内质网应激阻断剂TUDCA所拮抗;MPST过表达则抑制砷对GRP78、CHOP蛋白的上调(P<0.01);然而,TUDCA预处理则明显逆转MPST过表达对GRP78、CHOP蛋白的影响(P<0.01)。结论GRP78/CHOP内质网应激通路参与了砷诱导的神经毒性损伤;MPST过表达可降低砷诱导的内质网应激水平。