疏肝健脾方对腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠黏膜多巴胺信号通路离子转运的影响

[目的]通过观察疏肝健脾方对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)模型大鼠多巴胺信号通路结肠黏膜离子转运的影响,旨在探讨疏肝健脾方对IBS-D的疗效机制.[方法]将体质量180～220 g雄性SD大鼠随机分为正常对照组、IBS-D模型组和疏肝健脾方治疗组,除正常对照组外,其他2组进行造模;采用体外短路电流测量技术测定各组大鼠结肠黏膜的短路电流变化.[结果]3组大鼠在基础电流、基础电压及跨上皮电阻三项电参数方面比较均差异无统计学意义(P＞0.05);多巴胺(DA)引起的最大短路电流下降值(△ⅠSC),疏肝健脾方治疗组较IBS-D模型组明显减小(P＜0.05);将Cl-,HCO3,Cl-/HCO3-从K-HS液中替代后,3组大鼠的△ⅠSC均减小但3组间△ⅠSC比较差异无统计学意义(P＞0.05);分别采用非选择性Cl-通道阻断剂glibenclamide、DPC阻断顶膜侧Cl-转运后,3组大鼠的△ⅠSC均减小但3组间△ⅠSC比较差异无统计学意义(P＞0.05);采用上皮Na+通道阻断剂Amiloride阻断顶膜侧的Na+转运后、非选择性K+通道阻断剂Ba2+阻断顶膜侧K+转运后,3组大鼠的△ⅠSC均基本不受影响,疏肝健脾方治疗组较IBS-D模型组明显减小(P＜0.05);采用抑制剂Bumitanide抑制黏膜基底侧Na+ -K+ -2Cl-共转运体的离子、抑制剂SITS抑制黏膜基底侧Cl-/HCO3 -转运后,3组大鼠的△ⅠSC均减小但3组间△ⅠSC比较差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]疏肝健脾方对IBS-D模型大鼠治疗作用的发挥与其对大鼠结肠黏膜多巴胺通路相关的Cl-及HCO3-转运的调节作用有关,这一过程主要由结肠黏膜顶膜侧Cl-通道,基底膜侧阴离子交换体及Na+-K+-2Cl-共转运体等膜通道蛋白共同介导.     

慢性心理应激对机械刺激诱导的远端结肠黏膜离子转运的影响

目的探讨在慢性心力应激大鼠模型中,机械刺激诱导的远端结肠黏膜离子转运是否发生改变。方法 SD大鼠分为对照组和模型组,采用束缚制动法制备慢性心理应激大鼠模型,通过排便测定、蔗糖水偏嗜度和悬尾实验测定其行为学,采用短路电流技术结合去除溶液中阴离子和运用各种阻断剂的方法,观察机械刺激诱导的远端结肠黏膜离子转运。结果同对照组比较,模型组大鼠的排便数量显著增加(P0.05),蔗糖水偏嗜度显著降低(P0.05),静止时间显著延长(P0.05),而挣扎次数显著降低(P0.05)。两组大鼠结肠黏膜的基础电生理特性无显著差异。机械刺激导致对照组和模型组大鼠结肠黏膜的短路电流均显著增加,但是模型组中增加的短路电流(△Isc)显著高于对照组(P0.05)。去除溶液中的HCO-3并不能改变两组的△Isc,但是去除溶液中的Cl-均显著降低两组的△Isc(P0.001)。运用Ca2+激活的Cl-通道(Ca2+-activated Cl-channel,CaCC)的阻断剂DIDS并不能改变两组的△Isc,但是运用囊性纤维变性跨膜电导调节器(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)的抑制剂CFTR(inh)-172或Na+-K+-2Cl-共转运体(Na+-K+-2Cl-cotransporter,NKCC)的阻断剂bumetanide均显著降低两组的△Isc(P0.001)。结论在慢性心理应激大鼠模型中,机械刺激诱导的远端结肠黏膜Cl-分泌增加,而这可能是功能性胃肠病(FGIDs)患者产生腹泻的原因之一。     

长期应用川芎嗪对大鼠结肠黏膜阴离子分泌的影响

目的:探讨长期应用川芎嗪对大鼠结肠黏膜阴离子分泌的影响.方法:健康SD大鼠分为两组:川芎嗪组[腹腔注射川芎嗪40 mg/(kg·d)]和对照组(腹腔注射等量生理盐水),7 d后剥离结肠黏膜,采用短路电流技术并运用吲哚美辛和forsktin观察大鼠结肠黏膜阴离子的分泌.结果:对照组和川芎嗪组结肠黏膜的基础电流相比有显著差异(23.4 μA/cm2±2.2μA/cm2vs 18.1μA/cm2±2.2μA/cm2,P<0.05);预先加入前列腺素环化酶抑制剂-吲哚美辛后,对照组和川芎嗪组结肠黏膜的基础电流相比无显著差异;对照组和川芎嗪组分别加入腺苷酸环化酶的激动剂-forskolin后,30 min内转运的电荷数的增加量有显著差异(47.9 mC/cm2±3.6 mC/cm2 vs 27.1 mC/cm2±2.6 mC/cm2,P<0.01);而川芎嗪组结肠黏膜30 min内转运的电荷数与川芎嗪组单纯加入forskolin后的短路电流相比差异无显著性.结论:川芎嗪可通过抑制结肠黏膜对前列腺素的自发分泌来降低阴离子的分泌.     

川芎嗪刺激结肠黏膜分泌阴离子的信号转导机制

目的　探讨川芎嗪刺激结肠黏膜分泌阴离子的信号转导机制。方法　运用某些工具药 ,采用短路电流技术观察了川芎嗪促进大鼠远端结肠黏膜分泌阴离子的信号转导机制。结果　结肠黏膜的基底膜加入 1mmoL/L的川芎嗪后 ,短路电流明显增加 ,在 3 0分钟内转运的电荷数增加了 3 7.5± 5 .1mC/cm2 (n =12 ) ;黏膜的基底膜和腔面膜预先加入PKA的抑制剂 -H89(0 .0 48μmoL/L)后 ,川芎嗪所产生的电荷数为 9.1± 2 .5mC/cm2 (n =8) ,相对于对照组 ,减少大约 76% (P <0 .0 0 1) ;在黏膜的基底膜预先加入前列腺素环化酶抑制剂 -吲哚美辛 (10 μmoL/L)后 ,川芎嗪所产生的电荷数为 11.4± 4.0mC/cm2 (n =9) ,相对于对照组 ,减少大约 70 % (P <0 .0 0 1) ;在黏膜的基底膜预先加入Ca2 +螯合剂 -BAPTA -AM(10 0 μmoL/L)后 ,川芎嗪所产生的电荷数为 2 0 .5± 7.3mC/cm2 (n =5 ) ,相对于对照组 ,减少大约 45 % (P <0 .0 5 )。结论　川芎嗪可以通过细胞内的前列腺素 /cAMP和Ca2 +途径刺激结肠黏膜分泌阴离子     

正丁酸盐诱导的大鼠非炎症性结肠致敏模型

目的: 研究正丁酸盐结肠灌注对大鼠结肠敏感性的影响, 探讨结肠致敏模型制作的新方法.方法: Wistar大鼠每天接受浓度为300 mmol/L丁酸盐1 mL从肛门灌肠2次, 共6 d. 分别在造模3、6 d后以半定量的方法观察大鼠对直肠扩张(CRD)的反应, 进行结肠敏感性评估, 记录初始感觉压力和最大耐受压力. 实验后处死大鼠, 取距肛门10 cm的结直肠, 观察肠黏膜损伤指数, 病理检查观察组织病理改变.结果: 模型组和盐水对照组均未见黏膜及黏膜下层组织结构破坏, 黏膜下嗜酸性粒细胞计数、肥大细胞计数无显著差异. 造模6 d模型组结肠运动最大压力较盐水对照组明显升高,差异有显著意义( t = 9.25, P<0.01). 模型组初始压力感觉及最大耐受压力较盐水对照组明显降低, 差异有显著意义( t = 36.71, 15.02, 均P<0.01).结论: 正丁酸盐灌肠可以使结肠敏感性增加,不破坏结肠黏膜组织结构, 结肠黏膜致敏与肥大细胞无关.     

大鼠肠道DCs及相关细胞因子在冷-束缚应激诱导肠功能紊乱后的表达

目的:了解肠道表面树突状细胞(DCs)及炎症细胞因子VIP、IL-1β在肠功能紊乱时的表达,以及外周血中VIP、IL-1β的表达,探讨大鼠肠道免疫耐受的变化.方法:将60只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,建立冷-束缚应激动物模型.将大鼠处死后,取大鼠回肠末端、远端结肠各长约2 cm的肠段,免疫组织化学法检测肠道表面CD11c、VIP、IL-1β的表达,留取腹主动脉血清ELISA方法检测外周血清中VIP、IL-1β的表达.结果:在回肠末端,实验组大鼠CD11c的表达较对照组无显著差异性;实验组大鼠VIP、IL-1β表达较对照组均明显增加,差异有显著性(177.67±35.44 vs 92.64±22.19,359.56±45.48 vs 216.46±41.56,均P<0.05).并且VIP的表达与IL-1β呈正相关(r=0.78,P<0.01).在远端结肠,实验组大鼠CD11C、IL-1β的表达较对照组均无显著差异性;而实验组大鼠远端结肠VIP的表达较对照组明显增高,差异有显著性(380.15±33.24 vs 254.04±40.53.P<0.05);在外周血中,与对照组相比较,VIP、IL-1β表达均增高,差异有显著性(149.03 ng/L±56.82 ng/L vs 104.24 ng/L±39.03 ng/L,8.82 ng/L±3.91 ng/L vs 5.49 ng/L±3.79 ng/L.P<0.05).结论:冷-束缚应激后肠功能紊乱大鼠中,末端回肠和远端结肠黏膜存在轻度的炎症反应,DCs尚不能解释肠功能紊乱后肠道存在轻度炎症反应的发病机制.     

谷氨酸诱导大鼠结肠 Cajal 间质细胞构建自噬模型

目的通过谷氨酸诱导离体大鼠结肠Cajal间质细胞(ICC)构建细胞自噬模型。方法使用不同浓度的谷氨酸不同时间点作用于原代培养的大鼠结肠ICC,免疫荧光鉴定大鼠结肠ICC细胞;CCK-8法检测谷氨酸对ICCs活力的影响;Western印迹检测不同浓度谷氨酸在不同作用时点对大鼠结肠ICC自噬蛋白微管相关蛋白轻链(LC)3表达水平的影响;透射电镜观察谷氨酸干预后细胞内自噬体和超微结构的变化。结果与空白组相比,谷氨酸(5 mmol/L)24 h显著降低大鼠结肠ICC活力(P<0.01)。谷氨酸(5 mmol/L)作用6 h、24 h均可显著提高自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P<0.05),其中以5 mmol/L谷氨酸作用24 h的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值最高(P<0.01)。透射电镜检测5 mmol/L谷氨酸干预大鼠结肠ICC 24 h发现,细胞内自噬空泡和自噬体数量明显增加。结论谷氨酸诱导大鼠结肠ICC自噬模型的最佳浓度和时间为5 mmol/L和24 h。     

胃动素对大鼠近端结肠平滑肌细胞钙钾电流的影响

目的 研究胃动素对大鼠近端结肠平滑肌细胞(PCSM)膜电压依赖性钾通道及L型钙通道电流的影响,以探讨其增强结肠运动的机制.方法 采用酶解法分离大鼠PCSM,采用全细胞模式膜片钳技术测定PCSM电压依赖性钾离子通道快速激活型钾电流及延迟整流型钾电流和L型钙电流,组间比较采用配对t检验.结果 胃动素对快速激活型钾电流及延迟整流型钾电流无明显作用.(0.5～10.0)×10-5 mmol/L胃动素浓度依赖性地激活L型钙电流,6×10-5 mmol/L胃动素在-10、0及10 mV刺激电压下,使最大电流密度分别增加154.61％、62.69％及21.02％,激活动力学曲线明显左移,半数激活电压由给药前的(2.740±1.211) mV降至(-25.290±0.614)mV(t=8.534,P=0.007),斜率因子则无明显差异.结论 胃动素通过促进钙离子内流来增强结肠平滑肌的收缩幅度,但不能通过平滑肌细胞的平衡电位及动作电位频率的变化来改变结肠平滑肌的收缩频率.     

高糖对大鼠结肠平滑肌细胞表达内源性胰岛素样生长因子1的影响

目的:探讨高糖对大鼠结肠平滑肌细胞(SMCs)表达内源性胰岛素样生长因子1(IGF-1)的影响.方法:酶解法分离培养SD大鼠结肠SMCs,α-actin免疫荧光鉴定,然后将大鼠结肠SMCs随机给予葡萄糖不同浓度(5.5mmol/L和25mmol/L)组及甘露醇对照组(5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇)刺激,CCK8实验检测SMCs增殖情况;流式细胞术检测SMCs细胞周期;ELISA检测培养液上清中IGF-1的含量;Western blot、Real-time PCR法检测SMCs合成内源性IGF-1的表达变化.结果:高糖(25mmol/L)抑制大鼠结肠SMCs的增殖,在24h与正常糖浓度间差异最大(0.494±0.003vs0.597±0.044,P<0.05);高糖使约90%的结肠SMCs停滞在G1期(90.850%±0.706%vs55.202%±3.807%,P<0.05),进入S期的SMCs明显减少(3.622%±0.156%vs30.780%±3.808%,P<0.05);高糖环境中,结肠SMCs合成分泌的IGF-1减少(208.000ng/L±31.443ng/Lvs265.750ng/L±26.538ng/L,P<0.05),SMCs表达内源性的IGF-1 mRNA和蛋白也均减少(2.037±0.196vs2.257±0.273;0.247±0.045vs0.906±0.103,P<0.05).结论:高糖抑制大鼠结肠SMCs增殖,使SMCs内源性IGF-1表达减少.     

人结肠上皮系T84的电生理特性研究及其对阿魏酸钠的反应

目的 研究阿魏酸钠(SF)对结肠上皮离子转运功能的影响和结肠上皮细胞系的电生理特性。方法 利用短路电流技术和细胞培养技术，观察SF对人结肠上皮细胞系T84离子转运的影响以及T84的电生理特性。结果 去除细胞外的Cl^-分别降低T84的跨膜电压和基础电流约69％、86％，跨膜电阻增加约400％，去除细胞外的HCO3^-降低T84的基础电流约73％，跨膜电阻增加约41％。细胞的腔面膜加入SF能够引起短路电流的增加，增加的效应分为一个尖峰和随后的一个平台，去掉细胞外的Cl^-可以降低SF的效应约95％，去掉细胞外的HCO3^-离子可以降低SF产生的平台约76％。结论 在正常情况下T84主要通过氯通道分泌阴离子，SF可以促进结肠上皮细胞对阴离子(主要是Cl^-)的分泌。