用单克隆抗体对约氏疟原虫抗原的分析 Ⅰ.约氏疟原虫红内期与人疟原虫具有共同抗原

用粗提的约氏疟原虫裂殖子免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与S_p2/0瘤细胞融合,获得13株分泌抗约氏疟红内期的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤。这些McAb分别属于小鼠IgG_1,IgG_(2a),IgG_(2b),及IgG_3亚类。根据免疫荧光观察,13株McAb可以分为4类:(1)抗红内期各发育阶段的原虫;(2)抗晚期滋养体及裂殖体;(3)抗裂殖体及裂殖子;(4)单纯抗裂殖子。有5     

约氏疟原虫红内期抗原定位的免疫电镜研究

应用LR White低温包埋法并结合胶体金标记免疫电镜细胞化学技术对保护性单克隆抗体M26-32识别的约氏疟原虫红内期抗原进行了超微结构定位。结果表明与单克隆抗体M26-32发生特异性免疫反应的抗原主要定位于早期滋养体、晚期滋养体、裂殖体和裂殖子的细胞质,为无性期不同发育阶段的共同抗原;在滋养体发育过程中该抗原有所增加,一部分可通过原虫的胞吐作用运出并定位于邻近虫体的感染红细胞细胞质。     

约氏疟原虫红内期体外培养的研究

约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)红内期的体外连续培养尚未取得理想的效果。本研究在Trager等体外培养恶性疟原虫方法的基础上,对培养条件进行改进:将约氏疟原虫放在悬液系统培养仪的小室内,使用磁性搅拌器搅拌成悬液;每天更换培养基并向培养基中添加新的网织红细胞;37℃、5% CO_2培养箱内常规培养。每日取体外培养物尾静脉注射小鼠,第3天检查小鼠体内疟原虫感染情况。结果显示,体外培养的24 h内,约氏疟原虫的原虫率增长至2.200%,呈小幅增长,但随后开始下降。第10天,未发现被感染的红细胞。第1~9天的体外培养物感染的小鼠均呈阳性,且第10天的体外培养物感染小鼠呈阴性。第1天体外培养物感染小鼠的原虫率最高,为54.960%。说明约氏疟原虫红内期的体外培养可以维持9 d,且体外培养的约氏疟原虫具有感染力。     

约氏疟原虫红内期的体外培养

本文作者应用Eagle改良的最小基本培养基MEM,内含5%胎牛血清,葡萄糖含量为RPMI 1640培养基的5倍,所用的气体含10%CO_2。针对约氏疟原虫偏爱侵入网织红细胞,因此在培养中使用两种来源的网织红细胞。一种是苯肼(Phenylhydrazine)诱发者:即未感染的CBA小鼠自腹腔内给予盐酸苯肼2.5mg,8天后,小鼠血内即含有20～30%的网织红细胞;另一种称之为“危象后期”(post-crisis)者:即小鼠接种感染后,用药物清除疟原虫,血内即含有40～60%未感染的网织红细胞。培养在37℃和20℃两种温度下进行。     

约氏疟原虫与伯氏疟原虫侵入期抗原的初步研究

目的　用针对鼠约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)侵入期的8种单克隆抗体,对约氏疟原虫和伯氏疟原虫(P.berghei)侵入期即动合子、裂殖子和子孢子棒状体和表面抗原检测分析。　方法　间接免疫荧光实验(IFA)对各侵入期抗原进行亚细胞结构定位,SDSPAGE及Western印迹对两种鼠疟原虫的不同侵入期进行抗原组分分析。　结果　经上述两种方法检测发现,顶端复合体抗原成分复杂,约氏疟原虫和伯氏疟原虫的棒状体有共同的抗原表位,约氏疟原虫的动合子与其自身的裂殖子有类似成分,也有各自独特的抗原。两种鼠疟原虫动合子抗原有类似成分。约氏疟原虫的子孢子具有与裂殖子、动合子不同的抗原成分。　结论　疟原虫侵入期棒状体和表面抗原在同一虫种的不同侵入期和不同虫种中有共同的抗原表位,也有各自的独特组分。     

恶性疟原虫红内期抗原差异分析

选用一组抗恶性疟原虫红内期裂殖体抗原gp195的单克隆抗体,分析海南省、江苏省恶性疟原虫分离株gp195的抗原差异。间接荧光抗体试验表明,6个恶性疟原虫分离株的gp195抗原既合共同性抗原决定簇,也含特异性抗原决定簇。根据原虫对该组单抗的反应差异,可划分为两个主要的gp195血清型。恶性疟原虫FCC_(8705)/JS为Ⅰ型;FCC/HN为Ⅱ型,FCC_(7802)/HN、FCC_(8702)/HN为Ⅱ_2型; FCC_(7801)/HN、FCC_(8701)/HN为Ⅰ Ⅱ混合型。免疫印迹法显示,恶性疟原虫FCC_(8705)/JS、FCC_1/HN、FCC_(8702)/HN、FCC_(7801)/HN gp195分子量分别为210kD_8、200kD_a、200kD_a、198kD_a。其中江苏FCC_(8705)/JS的gp195分子量高于其它三个海南分离株。作者对gp195抗原差异的规律及其对疟疾疫苗研究的影响作了讨论。     

约氏疟原虫纯化保护性抗原对鼠疟红内期保护性免疫调节作用…

用５３ｋＤａ抗原单独或加佐剂经不同途径、以不同剂量免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，再用约氏疟原虫非致死株１０＾５ＰＲＢＣ／只攻击，观察各组小鼠血原虫率变化，比较血清抗体水平。５３ｋＤａ抗原２０ｕｇ／只加福氏完全佐剂经腹腔注射免疫２次可使小鼠产生有效的免疫保护。以腹腔注射产生的保护作用最好。     

恶性疟原虫红内期保护性抗原的分析

本文利用7株单克隆抗体(McAb)、疟疾流行区人免疫血清和BALB/c小鼠免疫血清对恶性疟原虫海南株(FCC-1/HN)无性红细胞内期的保护性抗原进行了初步鉴定。 实验结果表明,McAbs 93A3和94B5主要识别125,83和55KD的~35S-蛋氨酸代谢标记的多肽,而94C3则主要识别183和55KD的多肽。针对培养上清抗原的McAb 21E3只能识别125KD的~35S-蛋氨     

啮齿动物约氏疟原虫期特异性和种特异性的单克隆抗体及交叉反应抗原

疟原虫感染可产生抗疟原虫抗体,但诱导这些抗体应答的抗原数量和位置以及其特征仍不清楚。过去在识别和分离个别疟原虫抗原以及评定其对免疫的产生和抑制作用亦很困难。而现今应用杂交瘤技术使有可能产生大量对单一疟原虫抗原决定簇的单克隆抗体,并用以识别和最终纯化疟原虫抗原。本文报道了用18种杂交瘤细胞系研究啮齿动物约氏疟原虫的种特异性,期特异性以及血清交叉反应抗原的情况。     

用单克隆抗体检测疟原虫抗原的研究

以兔抗鼠血清代替约氏疟原虫粗制抗原或恶性疟原虫作包被,采用单克隆抗体M_(26-52)的酶联免疫吸附抑制试验检测恶性疟和间日疟红内期疟原虫抗原,对69份镜检疟原虫阳性和88份镜检阴性滤纸血进行测定,以抑制率≥9％为阳性标准,结果其阳性和阴性样本符合率均超过90％,抑制率与原虫密度呈密切正相关,最低可检出2.6个疟原虫/10~4红细胞。     

间日疟原虫与异种疟原虫之间的红内期交叉反应抗原分析

本文用1％NP－40分别提取间日疟原虫、恶性疟原虫、食蟹猴疟原虫、伯氏疟原虫及约氏疟原虫红内期可溶性抗原，用间日疟病人血清及两株抗间日疟红内期原虫单克隆抗体6H7和2C3对上述抗原进行免疫印迹分析。结果表明，间日疟原虫与异种疟原虫之间有一系列交叉反应抗原，其中食蟹猴疟原虫有14条蛋白带可被间日疟病人血清识别，多于另外三种疟原虫。五种疟原虫共有的79kD蛋白均可被间日疫病人血清识别。此外，间日疟病人血清还识别正常人红细胞膜抗原中的160kD、67kD蛋白带。McAb6H7识别不同疟原虫中相应的交叉反应抗原区带分别为：恶性疟原虫186kD、175kD；食蟹猴疟原虫133kD；伯氏疟原虫186kD、175kD及约氏疟原虫164kD，另外，McAb6H7还识别正常人红细胞膜中的184kD、170kD蛋白。McAb2C3识别四种疟原虫共有的60kD蛋白，该蛋白可能为疟原虫的种间共同抗原。     

硝喹对鼠约氏疟原虫红内期琥珀酸脱氢酶的影响

为观察红内期约氏疟原虫线粒体内是否存在琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ），并观察硝喹（ＮＱ）是否抑制该酶活性进行了本研究。给感染疟原虫的小鼠，灌服单剂量硝喹（２ｍｇ／ｋｇ）后，３．５ｈ、１４ｈ取血，酶组化孵育，电镜观察疟原虫线粒体。结果表明，红内期约氏疟原虫线粒体内存在ＳＤＨ，ＮＱ不能抑制ＳＤＨ的活性。约氏疟原虫内有三羧酸循环，ＳＤＨ不是ＮＱ的起始作用点     

硝喹对鼠约氏疟原虫红内期琥珀酸脱氢酶的影响

为观察红内斯约氏疟原虫线粒体内是否存在琥珀酸脱氢酶，并观察硝喹是否抑制该酶活性进行了本研究。给感染疟原虫的小鼠，灌服单剂量硝喹后，３．５ｈ，１４ｈ取血，酶组化育，电镜观察疟原虫线粒体。结果表明，红内斯约氏疟原虫线粒体内存在ＳＤＨ，ＮＱ不能抑制ＳＤＨ的活性。约氏疟原虫内有三羧酸循环，ＳＤＨ不是ＮＱ的起始作用点。     

用抗间日疟原虫单克隆抗体鉴定食蟹猴疟原虫复合体中具交叉反应性的红内期抗原

鉴于间日疟原虫(P.v.)和食蟹猴疟原虫(P.c.)在进化上较接近,且后者可以体外培养,作者用抗间日疟原虫 Belem 株红内期原虫的 McAb 鉴定间日疟和食蟹猴疟的靶抗原,以确定这些抗原在功能上的作用。     

蚊期和红内期持续表达绿色荧光蛋白的重组约氏疟原虫

目的 构建蚊期、红内期持续表达绿色荧光蛋白（GFP）的约氏疟原虫BY265株。 方法 用SacⅡ酶酶切含有伯氏疟原虫ssu-rrna基因和GFP基因的重组质粒pl0017使之线性化,用电转化的方法将该重组质粒转化入红内期约氏疟原虫BY265株,获BY265-EGFP重组疟原虫,尾静脉注射感染昆明小鼠,24～30 h后用乙胺嘧啶饲喂小鼠5～6 d,鼠尾静脉采血涂片观察原虫感染率。以疟原虫基因组DNA为模板,PCR鉴定转染重组质粒pl0017的约氏疟原虫。斯氏按蚊叮咬感染BY265-EGFP重组疟原虫的小鼠,按蚊血餐后第7天和第16天解剖蚊胃和唾液腺,观察疟原虫能否在蚊体内正常发育。 结果 荧光显微镜观察到呈绿色荧光的红内期各期形态正常的约氏疟原虫。PCR检测结果表明,GFP和ssu-rrna基因已成功整合到约氏疟原虫基因组中。按蚊感染实验证实重组BY265株能在蚊体内正常发育。 结论 构建了蚊期、红内期持续表达绿色荧光蛋白的约氏疟原虫。     

用单克隆抗体酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测红内期恶性疟原虫抗原

本文介绍了以兔抗恶性疟原虫（p、f）多克隆抗体包被,用混合的二种单克隆抗体进行反应酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法检测人体红细胞内的恶性疟原虫抗原。恶性疟（镜检确诊）和非疟疾患者的滤纸血样本测定符合率分别为91.5％（43/47）和96％（24/25）。检测敏感度为5个疟原虫/10~6红细胞,对恶性疟原虫的海南和江苏地理株的测定结果显示,两者的符合率无显著差异。但对间日疟样本测定结果不理想。     

致死型约氏疟原虫红内期感染导致肝脏病理损伤的作用研究

目的探讨致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y 17XL)红内期感染对肝脏的作用影响。方法采用新鲜P.y 17XL感染红细胞(1×10~6)腹腔感染BALB/c小鼠,定期尾静脉取血检测红细胞感染率,观察小鼠生存率。取感染率30%、50%和70%小鼠肝组织,进行HE染色、F4/80免疫组织化学分析(IHC)和疟色素含量检测。密度梯度离心法分离肝单个核细胞。流式细胞术检测肝脏巨噬细胞数量。结果 P.y 17XL感染小鼠红细胞感染率从第3 d(7.1%)开始快速上升,第7 d达峰值(81.5%)后小鼠全部死亡(生存率0)。HE染色显示疟色素在P.y 17XL感染小鼠肝脏大量沉积,肝组织结构紊乱。免疫组化显示,F4/80+巨噬细胞胞浆富含大量疟色素颗粒。与对照组相比,肝脏疟色素含量在30%组(6.079μmol/L)、50%组(5.35μmol/L)和70%组(8.542μmol/L)明显增加(均P0.001),且70%组明显高于30%组和50%组(均P0.05)。流式分析显示,与对照组相比,肝脏F4/80~+CD11b~+CD11c~-巨噬细胞百分含量在30%组(7.81%,P0.01)、50%组(6.41%,P0.05)和70%组(4.35%,P0.05)均显著升高(图5A/B),绝对计数亦明显增加(均P0.05)。结论 P.y 17XL红内期感染的疟色素通过激活巨噬细胞介导肝脏病理损伤。     

人疟原虫红内期的鼠模型

人疟原虫严格的宿主专一性极大地阻碍了疟疾的实验研究。除猩猩之外,两属南美洲的猴,夜猴和松鼠猴可作为“适应”株的感受者,但往往需首先在切脾动物经过一系列的过渡。因这些动物数量有限,价格昂贵,显然降低了其作为模型的使用意义。在试图克服这些障碍的努力中,作者成功地利用了B和T细胞缺陷小鼠(如严重综合免疫缺陷的SCID或先天无胸腺的NIHⅢ小鼠)。     

约氏疟原虫红内期裂体增殖与配子体生成中的某些形态特征

用戊二醛和皂素的低渗固定液处理约氏疟原虫(P,y.)感染的红细胞,释去宿主细胞内的血红蛋白,在透射电镜下可显示更清晰的含虫空泡腔内的裂体增殖过程的形态。如裂殖子芽体的形成、核与线粒体滑入芽体的装配过程与残留体形成。 戊二醛常规固定标本中,P.y.成熟配子体核旁有一组由数层平行排列的凹形扁平囊和位于凹陷区内的一簇大小与密度不等的泡状小体组成的囊泡样复合结构,可能就是高尔基体。     

约氏疟原虫纯化保护性抗原对鼠疟红内期保护性免疫调节作用的研究 Ⅲ．53kDa抗原的免疫保护性

用５３ｋＤａ抗原单独或加佐剂经不同途径、以不同剂量免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,再用约氏疟原虫非致死株１０５ＰＲＢｃ／只攻击,观察各组小鼠血原虫率变化,比较血清抗体水平。５３ｋＤａ抗原２０μｇ／只加福氏完全佐剂经腹腔注射免疫２次可使小鼠产生有效的免疫保护。以腹腔注射产生的保护作用最好。