应用穿梭质粒建立哺乳动物细胞诱变检测系统的实验研究

Using Ficoll-Hypaque gradient centrifugation, we have successfully obtained the neutrophils from normal human donors, which can be used as particle antigens for immunizing BALB/c mice. Hybridomas were produced through the fusion of SP2/0 myeloma cells and splenocytes from immunized BALB/c mice. The ratio of fusion was 1:5. The cells were fused with 30% polyethylene glycol (MW 4000). The rate of fusion was 90%. The antibody producing colonies against the membrane of neutrophils in HAT medium were selected by indirect immunofluorescence assay. Antibody positive rate was 60% (102/170). Limiting dilution was used for colonization of the antibody-producing hybridoma cells. After colonization for three times, one hybridoma cell line was obtained, which could inhibit complement-mediated phagocytosis. Culture supernatant was used against class- and subclass- specific rabbit antisera (rabbit anti-mouse IgM, IgG, IgG1, IgGd22, IgG2b, IgG3) in an agar immunodiffusion system, it was shown to be IgG22.     

EMS对穿梭质粒pZ189诱变作用的初步研究

Shuttle vector plasmid pZ189 was used as a molecular tool and the SupF inserted in the plasmid was worked as a target gene for mutagenesis study. The host cells (E. coli MBM 7070) with pZ189 were treated with ethylmethane sulfonate (EMS) and plated on the selective media containing X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) and IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside). The SupF and the LacZ amber mutant carried by the host cells complemented each other and thus made the colonies blue on the selective media. However the colonies derived from the SupF mutants changed the colour from blue to white. The mutant frequencies in a series of experiments with different concentrations of EMS were estimated. Furthermore, the DNA isolated from 5 SupF mutants was digested with restruiction enzyme Hha I. It suggests that the 214 bp Hha I fragments containing mutant SupF could be distinguished from their wild type counterparts by temperature-gradient gel electrophoresis under optimal conditions.     

EMS对穿梭质粒pZ189诱变作用的初步研究

用甲基磺酸乙酯(EMS)处理穿梭质粒pZ189的转化菌,提取经处理的质粒再转化大肠杆菌MBM7070菌株。然后,在特定的选择性培养基上筛选出pZ189质粒上靶基因SupF发生了突变的转化子,计算了突变型频率。用DNA温度梯度凝胶电泳(TGGE)检出了含有SupF突变基因的DNA片段.     

信号标签诱变突变体文库穿梭质粒构建

目的建立信号标签诱变突变体穿梭质粒,为构建信号标签诱变突变体文库及病原微生物毒力基因筛选打下基础。方法通过PCR扩增信号标签(signature tags,STs)片段,导入载体pC6,构建重组质粒pC6RS,转化到大肠杆菌CC118中,提取重组质粒后转化到大肠杆菌S17-1中。结果经过PCR、核苷酸序列测定鉴定,成功地构建了pC6RS质粒。     

人FL细胞穿梭载体pS189诱变检测系统的建立及应用

作者用转染了穿梭载体ｐＳ１８９的亚克隆人羊膜ＦＬ细胞，对甲基硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）的诱变性进行了检则。结果发现，该系统中ｐＳ１８９靶基因ｓｕｐＦ的自发突变率仅为１．７×１０－５，ＭＮＮＧ剂量与其诱发突变率之间呈线性相关。用凝胶电泳、多聚酶链反应和单链构型多态对突变子分析表明，ＭＮＮＧ诱发突变子中８９％为点突变。这些结果显示，该系统可望用于诱变剂的检测及诱变机理的分析研究。     

用穿梭质粒pWB1研究黄曲霉素B1，苯并(α)芘 在人FL细胞中的诱变性

作者以β-萘黄酮诱导FL细胞表达细胞色素P450同工酶系，利用穿梭质粒pWB1研究了黄曲霉B     

用穿梭质粒pWB1研究黄曲霉素B1,苯并(α)芘在人FL细胞中的诱变性

作者以β－萘黄酮诱导ＦＬ细胞表达细胞色素Ｐ４５０同工酶系,利用穿梭质粒ｐＷＢ１研究了黄曲霉Ｂ１和苯并（α）芘在人新生儿羊膜上皮ＦＬ细胞中的诱变作用。结果：均以比自发突变频率（７．６１×１０－６）高两个数量级（１０－４）的频率,检出了黄曲霉Ｂ１和苯并（α）芘诱发的ＳｕｐＦ基因突变子,其中黄曲霉素Ｂ１表现了明显的剂量效应,从而为穿梭质粒ｐＷＢ１结合β－萘黄酮诱导ＦＬ细胞表达细胞色素Ｐ４５０同工酶系在ＦＬ细胞内检测间接致癌物的可行性提供了证据。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

建立pESnx／FL穿梭质粒致突变测试系统的实验研究

本研究用电穿孔法将带有邻苯二酚氧化酶基因（ｘＹ１Ｅ基因）的质粒ｐＥＳｎｘ转染至５种哺乳动物细胞（ＦＬ，ＨＴ，ＬＴＲ，ＰＡ３１７和Ｗｇ３－ｈ）。结果表明，质粒ｐＥＳｎｘ在５种细胞中均可形成抗性克隆。但是，仅ｐＥＳｎｘ／ＦＬ克隆可获得每皿５０个以上的转化子和低于１０＾４的自发突变率，符合穿梭质粒测试系统的要求。为进一步验证可用于检测致突变性，用已知可诱发点突变的致癌物亚硝基胍（ＭＮＮＧ）处理ｐＥＳｎｘ     

重组穿梭质粒pAdTrack-cmv-rHSG载体的构建及鉴定

目的构建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)腺病毒穿梭质粒,为进一步研究体内诱导rHSG在恶性胶质瘤的特异性表达奠定基础。方法提取SD大鼠心肌总RNA,利用RT-PCR方法扩增大鼠增殖抑制基因(rHSG)的全开放读码框区片段,将其亚克隆入T载体,双酶切后与经同样处理的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-cmv相连,用酶切和测序进行鉴定。结果扩增rHSG克隆出rHSG基因并成功重组于入腺病毒基因并成功的穿梭质粒。结论构建成功重组大鼠增殖抑制基因腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-cmv-rHSG。     

分枝杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因在分枝杆菌中的稳定表达

卡介苗（ＢＣＧ）是全球应用最广泛的疫苗，也是一种能携带多种致病菌保护性抗原表达的疫苗载体。本研究以ｐＵＣ１９为骨架，分别克隆入ＢＣＧ分泌抗原８５－Ｂ的调节和信号肽序列、Ｎｅｏ基因序列（编码卡那霉素抗性）以及分枝杆菌质粒复制基因，构建成分枝杆菌－大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－８０００。该重组质粒在分枝杆菌（含ＢＣＧ）、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制，并能稳定表达卡那霉素抗性。本研究为把ＢＣＧ和其它分枝杆菌发展成为多价疫苗载体打下了基础。     

用逆转录病毒载体表达嗜亲性病毒受体基因

将含有嗜亲性鼠白血病病毒（ＥｃｏＭｕＬＶ）受体基因开放读码框架的ＤＮＡ片段（Ｗ１），克隆到逆转录病毒表达载体ｐＺｉｐ－ＮｅｏＳＶ（ｘ）的５＇－端长末端重复序列（ＬＴＲ）的ＢａｍＨＩ位点，构建成重组质粒ｐＺｉｐ－Ｗ１。用磷酸钙沉淀法将重组质粒转染到辅助包装细胞ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２和ＧＰ＋Ｅ８６中，经Ｇ４１８筛选，２周后获得的抗性细胞克隆能有效地表达嗜亲性鼠白血病病毒的受体基因，该细胞培养２４ｈ后收集上清，分别做ＸＣ蚀斑和ＩＤ病灶实验，均证明该上清液内有毒力较强的ＥｃｏＭｕＬＶ。     

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1( )表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1( )-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。     

利用双顺反子表达质粒在CHO细胞中有效表达人补体1抑制物

利用基因工程手段获取编码人补体1抑制物（C1-inhibitor，C1-INH）的基因片段，将其插入双顺反子表达载体pED中，构建成功可在CHO细胞中有效表达人C1-INH的表达质粒。采用Lipofectin法将其转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞（CHO-dhfr-），获得有效表达人C1-INH的CHO-dhfr 细胞克隆。经Northern印迹、免疫及Western印迹等试验检测证实，重组的细胞克隆可以表达人C1-INH，特异性ELISA检测其表达水平在0.4μg／ml左右。重组C1-INH活性检测采用酯酶裂解抑制法。     

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。     

重组AAV1-Luc病毒制备及体外转导培养细胞的特性

目的制备携带萤火虫荧光素酶基因的重组AAV1病毒（rAAV1-Luc）,研究该病毒体外转导培养细胞的特性。方法通过“1株载体细胞/1株辅助病毒”的双因素包装策略制备出rAAV1-Luc,研究该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系,肝素对转导的拮抗作用、rAAV1的竞争抑制作用及丁酸钠对表达水平的增强作用。结果在一定范围内,随着rAAV1-Luc感染细胞的感染复数（MOI,即每个细胞感染的病毒基因组数）值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI（〉10^7）反而使荧光素酶的表达水平下降。肝素不能特异性阻断rAAV1介导的荧光素酶表达。携带不同基因的2种rAAV1病毒相互具有明显的竞争抑制作用。丁酸钠可显著增强rAAV1介导的荧光素酶表达水平。结论该研究揭示了rAAV1载体一定的细胞转导特性,对应用rAAV1载体介导基因转移研究具有指导意义。