大肠癌相关抗原体外致敏法构建人源抗体库

建立杂交瘤单抗亲和层析纯化抗原、抗原体外致敏淋巴细胞和RT-PCR克隆人抗体基因及噬菌体呈现技术构建人源抗体库的策略.将亲和层析纯化的大肠癌相关抗原CA-Hb3经SDS-PAGE和免疫印迹鉴定后,与IL-2和丝裂原于体外致敏10个大肠癌病人各10ml外周血淋巴细胞(PBL),出现淋巴母细胞化和集落形成现象,提取总RNA并纯化mRNA,经RT-PCR扩增3种VH-CHI(γ)基因和5种VL-CL(κλ)基因,再经PCR克隆3种VH(γ)和8种VL(κλ)基因.通过(Gly_4Ser)_3相应的寡核苷酸连接序列将VH和VL基因不同组合连成24种单链抗体(ScFv)基因,经 SfiI酶切,将之克隆入fUSE 5RF,用电穿孔法将此表达载体转化MC1061,四环素抗性筛选得到10~6库容的初级抗体库,ScFv基因插入百分率为85%.该策略将可能普遍用于鼠源单抗人源化.     

107. 体外致敏鼻咽癌患者B细胞构建抗独特型噬菌体抗体库

根据Jerne免疫网络理论,抗独持型抗体（Ab2β）在三维空间能够模拟Ab1所识别的抗原结构,可以替代肿瘤抗原作为抗肿瘤疫苗,激发机体体液免疫和细胞免疫应答。抗独特型抗体的这种分子模拟功能在肿瘤免疫治疗领域已展示出诱人的前景。但因杂交瘤技术制备的单克隆抗独特型抗体为鼠源性抗体,临床应用受到极大的限制。为解决这一难题,本实验采用体外致敏法结合噬菌体呈现技术构建鼻咽癌抗独特型噬菌体抗体库。以本室制备的抗鼻咽癌单抗FC2（Ab1）为免疫原,体外致敏并用EBV转化10例鼻咽癌患者PBMC,经Sandwich ELISA检测其中8例有Ab2产生。抽提致敏、转化的鼻咽癌患者B细胞的总RNA,用cDNA合成试剂盒反转录为cDNA,经多次PCR扩增出5种VH（γ、μ)和9种VL（κ、λ）基因,经简并组成15种ScFv基因,在体外与载体fuse5连接,电导入大肠杆菌MC1061,经四环素抗性筛选,得到库容为1．1×107的初级噬菌体抗体库。随机挑取20个菌落检查噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为70％。这不仅为进一步用抗鼻咽癌单抗亲和筛选具有内影像特点的抗独特型单链抗体（Ab2βScFv）奠定了基础,而且说明外致敏法结合噬菌体抗体库技术制备人源化Ab2βScFv的策略是完全可行的。     

噬菌体抗体库的构建及抗肿瘤单抗的筛选

鼠源抗肿瘤单抗通常用杂交瘤技术制备。作者首次尝试以噬菌体抗体库技术替代杂交瘤方法制备抗肿瘤鼠单抗。以ＲＴ－ＰＣＲ方法直接从免疫Ｂａ１Ｂ／ｃ小鼠脾脏淋巴细胞扩增出全套免疫球蛋白重链Ｆｄ段及轻链基因，克隆到原核表达载体并将抗体片断Ｆａｂ表达于线状噬菌体表面，构建了噬菌体抗体库（１．０×１０￣７）。以人乳腺癌细胞系Ｂｃａｐ３７活细胞为靶抗原对噬菌体抗体库进行的４轮亲和筛选显示了噬菌体抗体的特异性富集。从第４轮筛选后选取１８２个克隆进行ＥＬＩＳＡ检测发现１７４个具有与肿瘤细胞结合活性。用１２种人肿瘤细胞系及人淋巴细胞和成纤维细胞对所获克隆进行了进一步鉴定。我们所应用的方法为抗肿瘤单抗的制备提供了一条更为有效的新途径。     

人源抗肝癌单链抗体库的构建及初步鉴定

目的构建人源抗肝癌单链抗体基因噬菌体表面呈现文库。方法利用噬菌体表面呈现技术,构建基因文库,经过panning筛选富集后,用ELISA方法检验抗原结合活性。结果从30个噬菌体克隆中筛选到8个具有肝癌细胞株SMMC7721结合活性的阳性克隆。结论从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗肝癌单链抗体的策略是可行的。     

用噬菌体抗体库技术筛选单克隆抗体

用噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体是近年来抗体技术中的革命性进展，本文简要介绍了我们在这方面所进行的研究工作：从乳癌细胞免疫后的小鼠脾脏细胞和接种过HBsAg疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞扩增出k链和Fd段基因，组装到Fab段噬菌体抗体表达载体pCOMB3中,分别建立了鼠源性和人源性噬菌体抗体库，以固相化的HBsAg和乳癌细胞为抗原．通过“吸附-洗脱-扩增”富集性筛选过程获得了鼠抗人乳癌细胞和人抗HBsAg的噬菌体抗体，并通过对表达载体的改造，在大肠杆菌表达出了可溶性的Fab段,对所获得的抗体Fab段进行了特异性、亲和力以及DNA序列的分析，显示噬菌体抗体库技术是一个行之有效的抗体制备手段。     

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选

背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应。方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库。在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2scFv。结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因。在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库。经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2scFv单克隆,阳性率为33.7%。再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2scFv。结论:联     

人源基因工程抗体技术的进展与展望

鼠源抗体对人的异源免疫原性问题直接导致了人源抗体技术的出现,经过十几年的研究,该技术日臻成熟.嵌合和人源化抗体的研究巳经取得了很大的成功,巳有产品应用于临床,但在实践中有其局限性.噬菌体抗体库体系的创建,用细菌克隆代替B细胞克隆,是人源抗体技术又一次突破性进展.噬菌体抗体操作简便,可以从中筛选出包括中和抗体、毒素抗体、多糖抗体、自身抗体、抗全细胞抗体在内的各种高亲和力抗体.转基因动物抗体技术于叨年代初出现,技术还不大成熟,目前人们只能将一部分人的Ig全套胚系基因转移到动物体内,但发展前景不可限量.     

抗γ-精浆蛋白人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库的构建及导向筛选

目的:建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库,筛选抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源性抗体轻链。方法:PCR扩增前列腺癌患者外周血淋巴细胞人抗体全套轻链基因,克隆人含鼠源抗γ-sm抗体Fd基因的pComb3X噬粒中,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切等分别对库容、基因重组率和多样性进行鉴定。以M13K07辅助噬菌体超感染,利用纯化的γ-sm对杂合库进行筛选,对筛出的阳性克隆进行功能检测。结果:构建了库容量为1．2×107CFU、重组率为90％、多样性好的人-鼠杂合噬菌体抗体库。ELISA检测出2个强阳性克隆,Western blot确证为抗γ--sm的人-鼠杂合Fab,竞争ELISA显示其表观亲和力约为亲本鼠抗体亲和力的71．8％。DNA测序显示筛到的人源轻链可变区基因属IGKV4-1*01胚系家族。结论:成功得到人源性抗γ-sm抗体轻链,为进一步获得全人源化抗体奠定了基础。     

抗前列腺癌γ-精浆蛋白人源Fab抗体的原核表达和特性鉴定

目的:对从噬菌体抗体库筛选的抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源化Fab抗体进行表达纯化和生物学特性鉴定,为其应用于前列腺癌抗体导向酶-前药治疗奠定基础.方法:首先将重组表达载体γ-sm-hFab/pComb3X转化大肠杆菌并诱导其可溶性表达,亲和纯化后采取Western-blot检测表达产物对γ-sm抗原结合特异性.其次分别采用抑制ELISA和竞争抑制ELISA方法分析表达纯化的抗γ-sm人源Fab抗体的亲和力和结合表位.最后采用竞争抑制流式细胞术和免疫组化超敏S-P法鉴定制备纯化的人源Fab抗体在前列腺癌细胞和组织上的结合分布特性.结果:成功诱导表达和纯化出理论分子量大小可溶性Fab抗体蛋白,含量约占细菌总可溶性蛋白的20.5%,Western-blot证实其能特异性结合识别γ-sm.抑制ELISA显示其表观结合常数(Ka)为0.78×108 M-1,亲和力约为亲本鼠源单抗E4B7的37.5%,竞争抑制ELISA进一步显示,二者识别γ-Sm抗原蛋白上的表位相同.流式细胞术和免疫组化显示,表达纯化的人源Fab抗体可显著地与前列腺癌细胞和组织特异性结合,其结合主要分布在腺上皮内瘤和中低度恶性的前列腺癌组织上.结论:成功地对筛选的抗γ-sm人源Fab抗体进行了原核可溶性表达、纯化和免疫生物学特性鉴定,为其进一步应用于抗体导向酶-前药实验治疗前列腺癌奠定了基础.     

人源性肺癌噬菌体展示单链抗体库的构建

目的:构建人源性肺癌噬菌体单链抗体库,为筛选肺癌相关抗原的抗体奠定基础。方法:提取肺癌转移淋巴结总RNA,用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染,形成噬菌体单链抗体库,采用限制性内切酶鉴定其多样性。结果:从肺癌转移淋巴结中成功提取RNA,逆转录PCR扩增出人可变区基因,连接形成单链抗体,最终构建了库容为1.2×108的抗人肺癌单链抗体库。BstNⅠ酶切法证明构建的抗体库具有良好的多样性。结论:成功地构建了噬菌体展示的抗人肺癌单链抗体库,为进一步筛选肺癌相关蛋白的可溶性抗体奠定了基础。     

全人源抗MLAA-34单链抗体的筛选和鉴定

目的:抗体药物治疗是目前癌症治疗中很有前景的一种方法,利用前期实验得到的MLAA-34纯化蛋白作为抗原,在噬菌体抗体库中进行筛选得到抗MLAA-34的单链抗体,进行测序并鉴定其亲和力。方法:包被纯化的MLAA-34抗原蛋白于96孔板上,封闭过夜,加入1×1012 cfu噬菌体抗体库,4 ℃结合4 h,洗脱,洗脱后的噬菌体感染大肠杆菌TG1扩增,经过3轮淘选,淘选得到的克隆再进行Phage-ELISA的鉴定,筛选得到阳性克隆。结果:纯化的MLAA-34作为抗原,经过在噬菌体抗体库中的3轮固相筛选,噬菌体的回收得到富集,洗脱的噬菌体产率显示回收率逐级增加,富集倍数约1 000倍。最后一轮筛选后挑选出188个重组噬菌体克隆,His标签蛋白作为对照蛋白,应用Phage-ELISA筛选出33个阳性克隆。结论:利用得到的MLAA-34蛋白为目标抗原,对全人源噬菌体抗体库进行淘选,应用Phage-ELISA法挑选出和MLAA-34抗原结合力的阳性噬菌体,为抗MLAA-34抗体的制备奠定了基础。     

嵌合轻链为模板导向筛选人源性抗肝癌抗体重链Fd片段

目的:利用噬菌体抗体库和导向选择技术,以抗HAb18G嵌合抗体轻链为模板,筛选人源性抗肝癌抗体Fd片段.方法:利用RT-PCR自肝癌患者外周血淋巴细胞中扩增全套人抗体重链Fd基因片段,克隆入含嵌合L链的展示载体pComb3X,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.然后,利用大肠杆菌表达的非融合HAb18GE为抗原进行亲和筛选,利用pⅢ融合抗体的形式进行克隆鉴定,并对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测.结果:构建成功库容量为2×107PFU的杂合人-鼠噬菌体抗体库,利用非融合表达的HAb18GE进行6轮筛选.ELISA及流式细胞仪检测,其中7个克隆呈特异性阳性反应.其中克隆AP6-2和AP6-7亲和力较高,测序显示其基因序列相同,且与亲本抗体恒定区序列相同,属IgG2亚类,可变区属VH3家族.结论:通过本实验,利用嵌合轻链为模板,进行Fd片段替换,成功筛选到人源性抗体Fd片段.     

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的：MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段（ScFv)。方法：从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重,轻链可变区DNA（VH和VL DNA）,两者经linker DNA连接形成ScFvDNA,将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv,以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5 ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果：VH,VL和ScFvDNA分别约为340bp,320bp和750bp,在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个,结论：用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。     

抗CD3人／鼠嵌合抗体的研究

已有的研究表明抗人T细胞CD3抗原的单抗具有激活和抑制人T细胞的双向功能。该单抗在抗肿瘤、抗多种器官移植排斥反应及再生障碍贫血的治疗中已显示出广阔的应用前景。但目前所用的CD3单抗都是鼠源的，大大地限制了它在临床治疗中的应用。为解决这一难题，本研究应用基因工程技术将鼠源CD3单机进行“人化”改造，在国内首次成功地构建并在其核细胞表达了抗CD3人／鼠嵌合抗体。这里综合报道研究结果如下：一、CD3单抗可变区基因cDNA的克隆和鉴定从分泌抗CD3单抗的小鼠杂交瘤HIT3a提取分离RNA，用小鼠Ig轻重涟恒定区保守序列为引物，…     

基因工程抗体研究进展

抗体分子是生物及医学领域中用途最为广泛的蛋白质分子.抗体制备技术经历了源自一百年前的多克隆抗血清、七十年代的杂交瘤单克隆抗体发展到目前的基因工程抗体阶段.使抗体的制备、性能和生产等均有了根本的改观.基因工程抗体指通过基因工程方法改造和制备抗体,它兴起于80年代对鼠单抗的人源化改造,接着出现了各种形式的小分子抗体和抗体融合蛋白,至九十年代初产生的抗体库技术将基因工程抗体的发展推向了高潮.本文仅就基因工程对抗体的改造(鼠单抗人源化、小分子抗体、抗体融合蛋白)和基因工程方法克隆新的抗体(抗体库技术)的进展情况作一简要介绍.     

抗前列腺癌细胞特异抗体库的构建及特异结合抗体的筛选

目的: 获得前列腺癌的噬菌体呈现型单链抗体库,筛选与前列腺癌特异结合的抗体,为前列腺癌的诊断和治疗奠定基础. 方法: 用两种恶性程度较高的前列腺癌细胞PC3,DU145膜蛋白混合物免疫Balb/c小鼠.取脾脏提取总RNA,用RT-PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL), 经Linker连接形成ScFv基因片段,将ScFv基因片段与噬菌粒载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13KO7进行超感染,获得重组噬菌体抗体.以恶性程度低的前列腺癌细胞LNCap为对照,用PC3细胞对重组噬菌体抗体库进行五轮筛选后,随机挑取克隆,经phage-ELISA筛选特异性结合PC3细胞的ScFv.结果: 用所构建的库容量为3.5×106的单链抗体库筛选特异结合抗体,得到一个与PC3细胞特异结合的噬菌体-单链抗体.结论: 本研究所构建的抗体库中可筛选到与前列腺癌细胞结合特异性较好的抗体,可用于前列腺癌的诊断和治疗中.     

噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或scFv,这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别,前提条件是能得到抗原纯品,对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用,所以又出现全细胞筛选,直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选,无需纯抗原,但目标抗原一定要有较高的表达水平,对于表达较低的情况,一种策略是先利用正常细胞筛选,去掉无关抗原后,再利用肿瘤细胞筛选;另一种策略是细胞内化筛选,特异性抗体被内化入细胞,然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞,获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等,适用面较窄,未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测:转化数,即被感染的噬菌体数,它随筛选轮数的增加而增加;抗体基因插入载体的频率,高比例的丢失意味着筛选的低效率;抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点,如细胞融合、动物免疫等,目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用。     

噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用

噬菌体抗体是指表达在噬菌体表面的抗体分子Fab或SCFV，这些分子的群体称为抗体库。经特定抗原或细胞筛选后可以获得针对该抗原或细胞表面标志物的特异性抗体。经典的筛选方法为固相或液相抗原识别，前提条件是能得到抗原纯品，对于抗原无法提纯或抗原性质不确定的情况则不能适用，所以又出现全细胞筛选，直接利用肿瘤细胞或组织细胞进行筛选，无需纯抗原，但目标抗原一定要有较高的表达水平，对于表达较低的情况，一种策略是先利用正常细胞筛选，去掉无关抗原后，再利用肿瘤细胞筛选；另一种策略是细胞内化筛选，特异性抗体被内化入细胞，然后用酸性洗脱液洗脱掉细胞膜上非特异结合的噬菌体抗体后裂解细胞，获得特异性抗体。其余筛选方法还有切片组织筛选、体内筛选等，适用面较窄，未获推广。筛选效率主要通过以下几项的检测：转化数，即被感染的噬菌体数，它随筛选轮数的增加而增加；抗体基因插入栽体的频率，高比例的丢失意味着筛选的低效率；抗体亲和性。抗体库技术避免了杂交瘤技术中的许多难点，如细胞融合、动物免疫等，目前该技术已逐渐在肿瘤诊断和肿瘤治疗中发挥重要作用，     

与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

目的从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。方法以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株,再经PCR进一步鉴定,确定含有单链抗体基因的克隆并测序,测序结果通过GeneBank比对进行同源性分析。结果获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。     

全人源食管癌噬菌体单链抗体库的筛选及特异性鉴定

目的：我们应用噬菌体抗体库技术构建了食管癌相关的人源单链抗体文库，本文目的在于对该抗体库进行鉴定，筛选食管癌抗体，同时对抗体的活性进行检测。方法：PCR鉴定TG1中食管癌单链抗体scFv的插入率；1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定Sfi I和NotI双酶切质粒的结果；先以人正常食管上皮细胞吸附后再以食管癌细胞Eca109为抗原对所建抗体库进行4轮的亲和筛选；将阳性重组噬菌体克隆感染Ecoli HB2151进行可溶性抗体表达及经亲和柱层析纯化；用SDS—PAGE测定该抗体的相对分子量；用Western blot鉴定该抗体；用ELISA法、免疫组化法鉴定该抗体与人食管癌细胞的结合的特异性。结果：seFv基因插入率为91．7％；酶切后检测到目的基因片段。在亲和筛选过程中，食管癌噬菌体单链抗体得到富集，收获率逐轮得到提高，第4轮为第1轮的141倍；SDS—PAGE与Western blot结果显示抗体的相对分子量为左右和30kd条带染色；在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅染食管癌组织，而肝癌组织和胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使Eca109细胞染色。ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的免疫活性，能与Eca109细胞结合，而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论：利用噬菌体抗体库技术的阴性、阳性筛选得到了食管癌噬菌体单链抗体，且筛选后的抗体片段与人食管癌细胞有特异性的结合活性。