基于报告基因和干扰素-α信号通路的药物筛选模型的建立

目的　建立基于报告基因和干扰素 α(Interferon α)信号通路的药物筛选模型,用于筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。方法　构建带有ISRE(IFN αstimulatedresponseelement)靶序列和报告基因的诱导性表达载体,并将其转染入血管内皮细胞 (ECV304 )中,筛选报告基因碱性磷酸酶(SEAP)表达受IFN α诱导的阳性克隆。选取相关的细胞因子干扰素 β、干扰素 γ和生长因子甲状旁腺素(PTH)进行模型特异性考察。结果　ECV304细胞中SEAP的表达受IFN α的诱导并呈现剂量依赖关系,IFN α的最高诱导表达率是IFN β最高诱导表达率的 9 0倍、IFN γ的 8 8倍、PTH的 9 1倍,具有相对特异性。IFN α对ECV304细胞无增殖作用。本方法的Z' 因子为 0 8,说明此模型具有很好的稳定性。结论　本模型的SEAP基因表达水平能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在 96孔板上用化学发光法测定SEAP基因的诱导表达水平可筛选具有IFN α样活性的小分子化合物。     

基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

基于COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选模型的建立及应用

为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型。该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COL1A1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制。作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体p GL4.17的重组质粒。采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍。该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL。经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物(S1~S7)的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用最强。Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原m RNA和蛋白水平的表达。结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选。     

甘氨酸类化合物对PPARα及γ亚型的激活作用

目的利用适于PPAR转录激活效应检测的细胞模型,分析系列化合物对PPARα及γ亚型的活化作用。方法将PPARα(或PPARγ)表达质粒、报告基因质粒和内参照质粒共转染HepG2细胞,并以仅转染报告基因质粒和内参照质粒的细胞作为对照。5个化合物(LTD-1,3,4,6,7)分别以不同浓度作用于转染细胞24h,然后裂解细胞,测定细胞内报告基因质粒的荧光素酶活性,后者表示化合物对PPARα(或PPARγ)的激活强度。结果细胞模型稳定可靠,能够灵敏反映PPAR的特异激活效应。甘氨酸类化合物的检测表明,LTD-4、LTD-6、LTD-7均具有激活PPARα和PPARγ的双重效应,LTD-1则仅能激活PPARγ,而LTD-3对PPARα和PPARγ均无明显的激活作用。结论所建细胞模型适于PPARα和PPARγ转录激活作用的分析,化合物LTD-4,6,7具有激活PPARα和PPARγ的双重作用,为作为双激动剂先导化合物的深入研发提供了依据。     

基于报告基因的雌激素受体α亚型配体筛选模型的建立和应用

目的　建立基于报告基因的雌激素受体α亚型配体的筛选模型,用此模型对收集到的化合物进行筛选,以发现具有新结构的雌激素受体配体。方法　构建诱导性表达载体并转染入ERα ⁺HepG2细胞中,筛选报告基因CAT表达受雌二醇诱导的阳性克隆。采用ELISA法检测化合物对CAT表达的影响,体外细胞存活实验对化合物进行功能性检测。结果　ERα ⁺HepG2细胞中CAT的表达受雌二醇的诱导并呈现剂量依赖关系。化合物三羟基二苯乙烯诱导CAT表达的最大活性为雌二醇的1.75倍。结论　利用此模型通过测定CAT基因的诱导表达水平可筛选得到新结构的雌激素受体配体。     

基于报告基因和NF-κB信号通路的抗阿尔茨海默病药物细胞筛选模型的建立与应用

目的建立基于报告基因和核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路的药物筛选模型,探讨不同化学结构类型的化合物对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的NF-κB信号通路的抑制作用。方法构建带有NF-κB靶序列和报告基因的诱导性表达载体(TATA-like promoter-NF-κB-secreted alkaline phosphatase,pTAL-NF-κB-SEAP),并将其转入人胚肾细胞(HEK293)中,考察模型的稳定性、时效、量效关系以及脂多糖对细胞的增殖作用。结果转染pTAL-NF-κB-SEAP的HEK293细胞中SEAP报告基因的表达受脂多糖的诱导并呈剂量与时间依赖关系,脂多糖对阳性克隆细胞无增殖作用,本模型的Z′因子为0.88。结论利用此模型通过测定分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)报告基因的诱导表达水平可筛选NF-κB信号通路抑制剂。     

基于分子对接技术靶向PPARγ的降糖药物虚拟筛选

目的:筛选出特异性靶向PPARγ的配体,为降糖药物的研发提供思路.方法:以核受体PPARγ配体结合区域的晶体结构作为靶点,运用Schrodinger分子对接技术虚拟筛选Drugbank中老药分子化合物,结合打分值以及化合物与靶蛋白受体的相互作用模式优化筛选结果,获得具有降糖潜在活性的小分子化合物.结果:经过SP和XP两...     

基于抗氧化反应元件的药物筛选模型的建立

目的建立基于抗氧化反应元件(antioxident responseelement,ARE)和SEAP报告基因的细胞筛选模型,用此模型对金雀异黄素、芹菜苷配基、儿茶素、茨非醇4种化合物进行活性比较,观察上述化合物拮抗过氧化氢损伤的作用,寻找具有强抗氧化活性作用的黄酮类化合物。方法构建重组报告基因表达载体pARE-TAL-SEAP与对照载体分别转染HEK-293细胞,检测上述黄酮类化合物作用后对SEAP的活性和抗氧化作用的影响。结果在加入25μmol.L-1H2O2进行氧化损伤的HEK-293细胞中,加入100μmol.L-1的4种化合物进行比较时金雀异黄素的抗氧化作用最强,金雀异黄素诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.3倍;加入25μmol.L-14种化合物的抗氧化作用时茨非醇的抗氧化作用最强,茨非醇诱导SEAP的最大表达水平较对照孔升高1.5倍。结论利用此模型可以检测H2O2的氧化应激反应并可筛选到抗氧化活性强的黄酮类化合物。     

基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型,筛选调节免疫系统、造血系统和抗肿瘤药物。方法构建以串连的多个STAT的DNA结合序列为调控序列,以荧光酶基因作为报告基因的表达载体。通过将该载体分别转入体外培养的不同细胞系中使之稳定表达,建立具有激活STAT活性的药物筛选模型,并利用多个抗过敏和抗肿瘤药物样品进行检测。结果建立多株药物筛选细胞模型,筛选方法简便,操作容易,灵敏度高,结果稳定。结论本细胞株可以用于大规模高通量药物筛选。     

基于计算机分子模拟技术从天然产物中筛选PPARγ激动剂

目的:采用分子对接技术从天然产物中筛选PPARγ激动剂。方法:研究时间为2021年1月至9月。基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的PDB晶型结构（PDB Code：6md4）,构建虚拟靶标模型,以天然产物数据库中的1 680个化合物为配体筛选对象,以6md4原配体分子为对照。首先采用SYBYL软件对天然小分...     

基于报告基因的PPAR-α激动剂筛选体系的建立

目的基于PPAR-α受体的信号传递通路和利用双萤光素酶报告基因分析方法,建立稳定的PPAR-α激动剂体外筛选体系。方法 pcDNA3.1-PPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV共转染293T细胞后,设0,0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特不同浓度点进行干预后,测定每浓度点重复5个样本。对转染优化试验数据,比较均值大小选取最佳结果;对不同转染组之间的差异性比较,采用t检验和方差分析。结果浓度为0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特干预组相对诱导率分别为：0.82,1.29,1.72,1.94,表现有统计学差异（P〈0.05）。结论成功建立基于PPAR-信号通路及双萤光素酶报告基因分析方法的PPAR-α激动剂筛药系统。     

基于报告基因的PPAR-α激动剂筛选体系的建立

目的 基于PPAR-α受体的信号传递通路和利用双萤光素酶报告基因分析方法,建立稳定的PPAR-α激动剂体外筛选体系。方法 pcDNA3.1-PPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV共转染293T细胞后,设0,0.1,1,10,50 μmol·L^-1非诺贝特不同浓度点进行干预后,测定每浓度点重复5个样本。对转染优化试验数据,比较均值大小选取最佳结果;对不同转染组之间的差异性比较,采用t检验和方差分析。结果 浓度为0.1,1,10,50 μmol·L^-1非诺贝特干预组相对诱导率分别为：0.82,1.29,1.72,1.94,表现有统计学差异(P<0.05)。结论 成功建立基于PPAR-信号通路及双萤光素酶报告基因分析方法的PPAR-α激动剂筛药系统。     

以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型。方法将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒pGL3-Insig-2并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4∶1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性。结论成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础。     

基于报告基因检测的PXR、FXR和LXRα激动剂高通量筛选模型的建立

目的建立基于报告基因法的高通量筛选细胞模型,用来发现PXR、FXR和LXRα受体激动剂。方法利用Real-time定量PCR方法比较HEK293、Hep G2和LS174T细胞中内源性核受体PXR、FXR和LXRα的表达量,将p SG5-h PXR和p GL3-XREM-CYP3A4、p EGFP-N3-h FXR和EcRETK-Luc、p CMX-FLAG-h LXRα和p GL3-XREM-CYP3A4等质粒分别共转染到工具细胞中,优化共转染比例,并考察阳性药与萤光素酶报告基因表达强度的量效关系、模型特异性和稳定性。结果 1根据Real-time定量PCR结果,模型选用低表达PXR、FXR和LXRα的HEK293细胞作为工具细胞;2根据不同共转染比例对报告基因活性的结果,PXR、FXR和LXRα报告基因药物筛选模型的报告基因和过表达质粒比例,最终分别选择1∶1、2∶1和2∶1;3模型中,报告基因活性均与相应阳性药物(PXR/Rif、FXR/CDCA和LXRα/T0901317)呈剂量依赖性增长;4仅PXR激动剂Rif、FXR激动剂CDCA和LXRα激动剂T0901317可分别明显增加相应筛选模型的报告基因活性,分别重复5次试验后,计算得Z'值分别为0.58、0.66和0.63。结论该研究建立的PXR、FXR和LXRα激动剂高通量筛选模型,具有良好的特异性和稳定性,适用于对PXR、FXR和LXRα受体激动剂的筛选,进而开发以核受体作为药物靶点的药物。     

PPARγ配体罗格列酮及其激动剂GW9662对脂肪细胞因子表达的影响

目的：脂肪组织是一个内分泌器官已逐渐得到了肯定,它能分泌多种信号分子如：脂联素和抵抗素。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome pro-liferator activated receptorγ,PPARγ）在脂肪组织高水平表达,胰岛素增敏剂-噻唑烷二酮类药物是它的选择性激动剂,噻唑烷二酮类药物如罗格列酮的胰岛素增敏作用部分是通过激活PPARγ调节脂联素（胰岛素增敏分子）和抵抗素（涉及胰岛素抵抗）表达介导的。但现在不同研究发现PPARγ激动剂对抵抗素的表达调控方向存在矛盾,我们的问题是当抵抗素表达增加的情况下脂联素的表达还能否上调。方法：用3T3-L1细胞株作为研究模型,分别用溶媒对照、罗格列酮（10μmol/L）、GW9662（5μmol/L）或罗格列酮＋GW9662作用细胞,然后检测脂联素和抵抗素 mRNA表达变化情况。结果：与对照组相比,罗格列酮分别增加脂联素和抵抗素 mRNA水平1.77和1.66倍,其差异具有统计学意义（P〈0.05） ;重要的是GW9662也增加脂联素水平（1.57倍,P〈0.05）但对抵抗素无影响。罗格列酮和GW9662两者合用时,仍上调adiponectin mRNA水平（对照组的1.87倍,P〈0.05） ,抵抗素的增加与罗格列酮单用比弱下降（对照组的1.31倍,P〈0.05）。结论：本研究为PPARγ激动剂（罗格列酮）和拮抗剂（GW9662）都上调脂联素的转录提供了新的证据,两者合用时GW9662不阻断罗格列酮诱导的脂联素上调作用。综合这些数据提示噻唑烷二酮类药上调脂联素的机制可能不依赖于PPARγ。并且, GW9662在增加脂联素水平的同时不上调抵抗素水平的特性进一步支持PPARγ拮抗剂用于临床治疗胰岛素抵抗的可能性。降低抵抗素表达可能不是罗格列酮胰岛素增敏作用的重要机制。我们的结果为将来研究噻唑烷二酮类药物对人脂肪细胞因子表达在剂量和时间上提供了一定的基础。     

新型PPARγ激动剂CMHX008对高糖诱导人肾小管上皮HK-2细胞纤维化的影响及机制

目的本研究以罗格列酮为对照,探讨新型PPARγ激动剂CMHX008对高糖诱导人肾小管上皮HK-2细胞纤维化标志的影响及机制。方法罗格列酮和CMHX008处理高糖培养的HK-2细胞,CCK-8法检测不同药物浓度处理后的细胞存活率;免疫印迹法检测纤维化标志蛋白和磷酸化PPARγ(Ser273)的表达;qRT-PCR检测纤维化指标mRNA的表达;划痕和Transwell侵袭实验检测HK-2细胞迁移和侵袭能力的变化。结果 CCK-8法结果显示,3μmol·L~(-1)罗格列酮和3μmol·L~(-1) CMHX008对HK-2细胞均无明显细胞毒性;免疫印迹法显示,给予罗格列酮和CMHX008能逆转高糖条件下PPARγ(Ser273)磷酸化的上调,减少TGF-β1、α-SMA的表达,增加E-cadherin的表达;划痕和Transwell实验显示,罗格列酮和CMHX008可以抑制高糖引起HK-2细胞迁移和侵袭能力的增强。结论与罗格列酮类似,新型PPARγ激动剂CMHX008能抑制高糖引起的HK-2细胞纤维化标志物的上调,减弱细胞的迁移和侵袭能力,提示CMHX008有改善糖尿病引起肾脏纤维化的作用,其机制可能与抑制PPARγ(Ser273)磷酸化有关。     

PPARγ与骨代谢的研究进展

过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）是核激素受体超家族成员。PPARγ2亚型是脂肪细胞分化的主要调节因子,对骨髓干细胞的分化方向起关键调控作用,可能是引起骨质疏松的机制之一。本文综述了PPARγ与骨代谢的研究进展。     

基于膜电位检测原理的γ-氨基丁酸A型受体药物高通量筛选模型

目的 利用膜电位检测原理,构建一种靶向γ-氨基丁酸A型受体(GABAAR)的药物高通量筛选模型.方法 采用α1β2γ2L-GABAAR-CHO细胞株构建GABAAR药物高通量筛选方法;分别以工具化合物的50％激动效应浓度(EC50)和EC80浓度下的激活值(ASV)和Z′因子作为判定指标,对缓冲液反应体系、激动剂GAB...     

基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptor β，ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型，以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive element，ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP，并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中，筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，SEAP)表达受雌二醇(17β-estradiol，E₂)诱导的阳性克隆。选取相关核受体配体进行模型的特异性考察，同时考察模型的稳定性及时效量效关系，以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况。利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选。结果转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中，SEAP报告基因的表达受E₂的诱导并呈剂量与时间依赖关系，E₂对阳性克隆细胞无增殖作用，本模型的Z′因子值为0.7，免疫细胞化学染色结果表明，转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低。结论利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂。     

噻唑烷二酮和芳酮酸类PPARγ激动剂三维定量构效关系研究

目的建立PPARγ激动剂-噻唑烷二酮和芳酮酸类化合物的三维定量构效关系,为设计高活性PPARγ激动剂提供结构信息。方法与结果用比较分子力场分析方法得到噻唑烷二酮和芳酮酸类化合物CoMFA模型,其交叉验证相关系数R²=0.656,非交叉验证相关系数R²=0.982,F_10,37=201.1,绝对误差SE=0.115。结论从CoMFA系数等势图中揭示芳酮酸类化合物较噻唑烷二酮类化合物活性更高的原因,提示芳酮酸类化合物与PPARγ结合时形成了不同于BRL-PPARγ复合物晶体的结合腔。