实验性慢性肾缺血模型肾小管-间质细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达和意义

目的：观察单侧肾动脉狭窄(RAS)大鼠模型慢性肾缺血组织中肾小管-间质α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达和意义。方法：建立Goldblatt，单侧RAS大鼠模型，观察大鼠慢性缺血肾脏在90天内不同阶段的病理改变；应用免疫组化法检测肾小管-间质α-SMA及波形蛋白(vimentin)在不同时间点的表达：应用免疫荧光双标记激光共聚焦显微镜观察细胞角蛋白(cytokeratin，CK)与α-SMA在肾小管上皮细胞中的共定位情况。结果：RAS术后第5天首先出现肾小管vimentin阳性，术后第7天肾间质可见少量的α-SMA阳性细胞并随时间递增。通过连续切片观察到，vimentin阳性的肾小管周围肾间质细胞α-SMA表达增强，并与肾小管间质纤维化程度基本一致。当慢性缺血状态持续存在时，后期(术后第45天至90天)少数损伤的肾小管上皮细胞表达α-SMA。应用免疫荧光双标记激光共聚焦显微镜观察发现，部分α-SMA阳性的肾小管上皮细胞同时表达CK，并且个别细胞还有向间质游走的趋势。结论：在慢性肾缺血早期Vimentin阳性的。肾小管上皮细胞本身叮能诱导了肾间质固有细胞发生肌成纤维细胞转分化，参与肾间质纤维化的发生和发展；在慢性肾缺血后期，肾小管上皮细胞转分化可能是导致肾纤维化进行性发展的关键环节。     

Gremlin在原发性肾小球疾病患者肾小管间质中的表达及其意义

目的探讨原发性肾小球疾病患者肾小管间质中Gremlin的表达及其意义。方法采用免疫组化法检测63例原发性肾小球疾病患者及9例正常肾组织穿刺标本中Gremlin、转化生长因子（TGF）-β1,及a-平滑肌肌动蛋白的表达,并用计算机图像分析软件检测肾小管间质Gremlin、TGF—β1及a-SMA阳性染色相对面积,同时检测原发性肾小球疾病患者血肌酐和尿素氮。结果与对照组比较,原发性肾小球疾病患者肾小管间质Gremlin、TGF-β1。及a-SMA表达均明显增加（P〈0．05）;原发性肾小球疾病患者小管间质Gremlin表达阳性率随小管间质纤维化损害程度增高而增加（P〈0．05）,并与TGF-β1,及a—SMA表达呈正相关（r=0．583、0．596,P均〈0．05）;肾小管间质Gremlin表达阳性率与患者血肌酐、尿素氮水平呈正相关（r=0．802、0．708,P均〈0．05）。结论Gremlin表达与原发性肾小球疾病肾间质纤维化程度密切相关,它可以作为原发性肾小球疾病肾间质纤维化程度的一个标志。     

2型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞中α-SMA的表达及其与肾功能的关系

目的 探讨α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在2型糖尿病（T2DM）大鼠肾小管上皮细胞中表达的变化,揭示α-SMA的表达及其与肾功能的关系.方法 应用免疫组化技术及流式细胞学技术检测T2DM大鼠模型中12、24 w时肾小管上皮细胞中α-SMA的表达.结果 免疫组化显示：T2DM组大鼠较同期对照组的肾小管上皮细胞胞浆中α-SMA表达增强,24w比12 w表达更加明显.流式定量测α-SMA表达与免疫组化结果一致.结论 α-SMA在T2DM大鼠肾小管上皮细胞中表达随时间延长逐渐增加,并且与肾功能的损伤程度呈正相关关系.     

肾小管上皮细胞转分化与转化生长因子-β和以其为靶点的治疗策略

肾间质纤维化几乎是所有肾脏疾病进展到终未期。肾功能衰竭的共同病理途径,近年研究表明,肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化（EMT）是肾间质纤维化发生发展的核心环节之一。转化生长因子（TGF）-β是促EMT作用最强的细胞因子,可以启动并完成整个EMT过程,是纤维化形成与发展的启动枢纽。因此,针对TGF—β可为肾间质纤维化的防治提供新的有效途径。现就该研究方向的新进展作一综述。     

红花对肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用

目的 目的观察红花对结扎单侧输尿管诱导的肾间质纤维化实验大鼠肾小管上皮细胞表型转化的抑制作用.方法 结扎单侧输尿管方式复制肾间质纤维化实验动物模型,分别给以红花4.0 g*kg-1*d-1、缬沙坦10 mg*kg-1*d-1经口灌服,采用免疫组化、原位杂交方法检测大鼠肾脏肾小管上皮细胞表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅲ型胶原的表达.结果 单侧输尿管结扎大鼠肾脏α-SMA动蛋白和Ⅲ型胶原的阳性面积及积分光密度较假手术组明显增强,红花及缬沙坦可显著性抑制其表达.结论 红花可以通过抑制肾小管上皮细胞的表型转化拮抗肾间质纤维化.     

小鼠肾组织中SnoN蛋白表达水平与肾小管上皮细胞转分化的关系

目的：通过观察正常和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾组织中转录共抑制因子SnoN表达水平的变化，探讨SnoN在肾小管上皮细胞转分化的作用。方法：采用结扎雄性CD-1小鼠左侧输尿管的方法建立UUO动物模型。设假手术小鼠为正常对照组。应用酶联免疫吸附（ELISA）法检测肾组织中转化生长因子β1（TGF-β1）水平，酸水解一比色法测定肾组织内胶原的含量。借助蛋白印迹技术，检测肾组织中SnoN和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白的变化。以人肾小管上皮细胞（HKC）为体外研究对象，观察TGF-β1对其SnoN表达的直接作用。结果：与假手术组小鼠相比，UUO小鼠术后3天肾组织中SnoN蛋白的表达量即明显降低，术后7天时进一步降为对照组的16％。同时，UUO小鼠肾组织TGF-β1水平、α-SMA蛋白表达量，及其胶原的含量亦随着病程的增加而显著增加。相关分析结果表明，SnoN的减少程度与肾组织内TGF-β1水平、α-SMA的表达和胶原的聚积密切相关（P〈0．01）。此外，HKC细胞培养实验结果表明，TGF-β1减低该细胞表达SnoN蛋白的作用先于α-SMA蛋白的变化。结论：肾脏SnoN表达水平与肾纤维化密切相关，可能通过干扰TGF-β1所致的小管上皮细胞转分化作用影响肾组织的纤维化过程。     

内皮素-1诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的可能机制

目的:探讨内皮素-1(ET-1)是否可诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化(TEMT)及可能的分子机制.方法:体外培养大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)并进行分组;倒置显微镜观察细胞的形态变化;Western印迹法检测细胞E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及磷酸化-p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白的表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞E-cadherin及α-SMA mRNA的表达. 结果:ET-1可诱导细胞由鹅卵石样变为梭形,下调E-cadherin表达,上调α-SMA、p38 MAPK及p-p38MAPK表达,增强p38MAPK活性(P＜0.05),而内皮素A受体拮抗剂BQ123能明显抑制这些变化(P＜0.05).p38MAPK特异性抑制剂SB203580可抑制ET-1诱导的细胞梭形性变,ET-1诱导的E-cadherin、α-SMA及p-p38MAPK表达改变及p38MAPK活性改变(P＜0.05),但对p38MAPK表达无明显影响(P＞0.05). 结论:ET-1可能通过激活肾小管上皮细胞p38 MAPK通路,下调E-cadherin的表达,同时上调d-SMA的表达,从而诱导肾小管上皮细胞转分化.     

瘦素对人肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1表达的影响

目的观察瘦素(LP)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)转分化及与转化生长因子-β1(TGF-βl)表达的影响,探讨其诱导转分化的机制。方法不同浓度LP(10、50、100ng/ml)刺激体外培养的HK-2细胞,以及LP作用不同时间(24、48、72h)进行分组,倒置显微镜下观察细胞形态学变化;RTPCR法和Western blot法检测细胞α-SMA、E-cadherin、TGF-βl、FN的表达水平;ELISA法检测上清中TGF-βl蛋白表达量。抗TGF-βl抗体中和实验分析LP对HK-2细胞转分化及与TGF-βl的关系。结果 (1)LP可使HK-2细胞逐渐由椭圆形变成长梭形,类似肌成纤维细胞的形态;(2)LP可下调E-cadherin的表达,同时上调α-SMA、TGF-βl的表达,其作用呈一定的剂量及时间依赖性;(3)抗TGF-βl抗体能够逆转LP诱导的转分化作用。结论 LP通过诱导HK-2细胞发生转分化,参与肾间质纤维化的发生发展,其作用机制与上调TGF-βl的表达有关。     

糖基化终产物诱导人脐静脉内皮细胞表达间质细胞标志物的观察

目的观察AGE对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)标志物表达的影响。方法在体外培养的HUVEC细胞株中分别加入AGE、牛血清白蛋白(BSA),采用免疫组织化学技术和Western blot检测HUVEC中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和血管性血友病因子(vWF)的表达情况。结果 HUVEC经AGE处理7d后,AGE组α-SMA表达较BSA组增强[(27.04±0.05)vs(20.12±0.02),P<0.01],vWF表达较BSA组降低[(29.66±1.44)vs(55.28±1.77),P<0.01]。结论 AGE可体外诱导HUVEC表面标志物发生改变,该转分化机制可能参与糖尿病血管病变的发生发展。     

乙型肝炎患者肝组织粘着斑激酶、α-平滑肌肌动蛋白的表达及意义

观察粘着斑激酶(FAK)与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达及分布,研究FAK与肝纤维化程度、肝组织炎症程度分级及肝星状细胞(HSCs)增殖的关系。应用免疫组织化学方法测定46例慢性乙型肝炎患者肝组织中FAK、α-SMA的分布及表达。①FAK在对照组中无表达;随着肝纤维化及炎症程度的加重,FAK阳性细胞明显增多,阳性程度( )～( ),与炎症及纤维化程度呈显著正相关,r值分别为0．712、0．730、P＜0．01。②α-SMA在对照组中以阴性表达为主;随着肝纤维化及炎症程度的加重,α-SMA阳性细胞亦明显增多,阳性程度( )～( ),与炎症及纤维化程度呈显著正相关,r值分别为0．778、0．793,P＜0．01。③FAK与α-SMA成显著正相关,r值为0．857,P＜0．01。慢性肝炎患者,随肝纤维化程度加重,肝组织FAK、α-SMA表达明显增加。     

转化生长因子-β1对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响,同时观察TGF-β1对肾小管上皮细胞合成细胞外基质(ECM)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的影响.方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,观察TGF-β1诱导人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)合成CTGF、ECM、TIMP-1及α-SMA的情况.结果:在无TGF-β1刺激的情况下,HK-2细胞中有基础量的CTGF mRNA表达,TGF-β1以剂量和时间依赖的方式诱导HK-2细胞合成CTGF mRNA,其表达在24h时达高峰,同时TGF-β1可使HK-2细胞合成ECM、α-SMA增多,但在时相上均晚于CTGF.随着TGF-β1浓度的增加,HK-2细胞合成TIMP-1也随之增加,但较大剂量的TGF-β1(15ng/ml)方可使TIMP-1 mRNA的表达明显增加(P＜0.05).结论:TGF-β1可直接诱导体外培养的人近端肾小管上皮细胞表达CTGF,其表达转录水平要早于ECM、α-SMA的表达,提示CTGF可能介导了TGF-β1的促肾小管上皮细胞ECM合成和转分化的作用.     

Remodeling in the microcirculation of rat skeletal muscle during chronic ischemia

OBJECTIVE: To establish the time course and extent of remodeling of terminal microcirculation in ischemic rat skeletal muscle during prolonged low flow that does not lead to inflammation. METHODS: One common iliac artery was ligated via laparotomy in adult Sprague-Dawley rats and extensor digitorum longus (EDL) muscles removed at intervals (1, 2, and 5 weeks) postsurgery. Serial frozen EDL sections were stained to show capillaries (alkaline phosphatase), cell proliferation (antibody to proliferating cell nuclear antigen [PCNA]), terminal microvessels (antibodies to alpha-smooth muscle actin (alpha-SMA) or endothelial nitric oxide synthase [eNOS]), and macrophages (antibodies to infiltrating and resident macrophages). Total muscle eNOS protein was quantified by standard Western blotting techniques. RESULTS: Capillary proliferation was very limited in ischemic EDLs, with a modest 12% increase in the capillary/fiber ratio after 5 weeks, preceded at 2 weeks by increased numbers of PCNA-positive nuclei at capillary sites. There was no muscle necrosis or evidence of inflammation, based on macrophage staining. The number of terminal microvessels that were positive for alpha-SMA and <10 microm in diameter was fewer in ischemic EDLs at all time points, whereas the number of larger positive vessels was unchanged. eNOS-positive vessels <10 microm in diameter were stained similarly throughout ischemic muscles as the controls, and showed a similar increase in vessel/fiber ratio as the capillaries. The total eNOS protein level was similar to that in controls in ischemic EDLs after 1 and 2 weeks, but was 28% lower after 5 weeks. CONCLUSIONS: Prolonged, moderate flow reduction to skeletal muscles does not necessarily lead to inflammation or extensive capillary growth. Based on eNOS staining, the terminal microcirculation remains intact, but the loss of alpha-SMA immunoreactivity may indicate remodeling involving the "deinvestment" of microvessels by smooth muscle.     

CD40/CD40L在肾小管上皮细胞转分化中的作用及其可能机制

目的 探讨CD40/CD40L在肾小管上皮细胞转分化中的作用及其可能机制.方法 将74例IgA肾病患者肾穿活检组织分为轻度系膜增生组27例、局灶增生组28例和增生硬化组19例,采用免疫组化及Masson方法观察各组肾小管间质内CD40、CD40L、TGF-β、α-SMA、Vimentin和胶原纤维的表达.结果 IgA肾病组织中小管上皮细胞高表达CD40和CD40L,肾小管间质中TGF-β、α-SMA、Vimentin及胶原纤维表达随分级变化而变化,三组间以上指标比较有统计学差异（P＜0.05或＜0.01）.结论 IgA肾病中,CD40和CD40L可能通过TGF-β启动并调节肾小管上皮细胞转分化,参与肾小管间质纤维化.     

骨髓间充质干细胞向急性肾损伤小鼠的肾脏归巢现象及功能探讨

目的:观察在缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模拟急性肾损伤的小鼠模型中,骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能否向损伤的肾小管迁移并促进其修复. 方法:Percoll密度梯度离心结合贴壁培养法有效分离纯化出C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞(mMSCs),5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记并采用免疫组化法鉴定.雄性C57BL/6小鼠45只,分为正常埘照组(15只)、I/R组(15只、夹闭双侧肾蒂30 min开放)、I/R+BrdU-mMSCs组(15只、夹闭双侧肾蒂30 min开放的同时尾静脉注射经BrdU标记的mMSCs).于建模后1d、2d、3d、7d、14d分别处死部分小鼠(每次每组均处死3只),留取动脉血及肾组织,检测血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)水平,观察肾组织病理变化,荧光组织化学及免疫组织化学观察MSCs在受体小鼠肾组织的分布并对其进行鉴定. 结果:经免疫组化证实BrdU标记mMSCs的阳性率可达(98.71±0.32)%.I/R组、I/R+Brdu-mMSCs组小鼠的BUN及SCr均显著高于正常对照组,但I/R+BrdU-mMSCs组小鼠的BUN及SCr水平却较同一时间点的I/R组为低,肾小管损伤程度评分也有着显著降低.免疫组化检测显示I/R+BrdU-mMSCs组小鼠肾脏中可检测到BrdU~+细胞的分布,以术后第3天最多[(19.36±6.94)%].经荧光组织化学及激光共聚焦显微镜观察证实该BrdU~+细胞定位于小鼠的肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)处,且表达RTECs特异性的标志物角蛋白18(cytokertain-18,CK18). 结论:小鼠发生I/R诱导的急性肾损伤后可诱导MSCs向损伤的肾小管上皮迁移并转化,参与RTECs的更新,促进肾损伤的修复.     

BMP-7对油酸诱导肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察骨形态发生蛋白（BMP）-7对油酸（OA）诱导的人肾小管上皮细胞转分化的拮抗作用。方法应用体外细胞培养技术培养人肾小管上皮细胞株HK-2。分别用不同浓度BMP-7（0、1、5、10、50ng／ml）和一定浓度的OA（400μmol／L）共刺激体外培养的HK-2 48h,收集细胞,采用ELISA法和RT-PCR法检测转化生长因子（TGF）-β1蛋白、mRNA的水平和表达变化,采用RT-PCR法检测α-平滑肌动蛋白（SMA）mRNA的表达变化。结果BMP-7可以显著减少OA诱导的HK-2中TGF-β1和α—SMA mRNA的表达（P〈0．01）。结论BMP-7可以拮抗OA诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

转化生长因子-β刺激人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子的表达

目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RTP-CR)和蛋白印迹技术,观察TGF-β1对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CTGFmRNA及其蛋白质表达的影响,同时观察肾小管上皮细胞形态改变。结果:HK2细胞有基础量的CTGFmRNA和蛋白质分子表达,在TGF-β1刺激下,其表达量显著增加,经不同浓度TGF-β1干预24h后,CTGFmRNA表达量明显升高,且呈剂量依赖性。1ng/mlTGF-β1刺激时,CTGFmRNA表达量开始显著增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降,CTGFmRNA表达量分别为对照组的2.40倍,3.34倍和2.73倍(P<0.05)。CTGFmRNA表达量呈时间依赖效应。TGF-β1(5ng/ml)干预30min后,CTGFmRNA表达量开始呈现增加趋势,为对照组的1.48倍(P>0.05),2h后出现显著差异,为对照组的2.14倍(P<0.05);CTGFmRNA表达量在24h达到高峰,持续至36h,分别为对照组的3.19倍和2.75倍(P<0.005);0.5ng/mlTGF-β1刺激时,CTGF蛋白表达量略有增加,5ng/ml时达到高峰,10ng/ml时略有下降。在TGF-β1(5ng/ml)干预下,HK2细胞由立方形铺路石样逐渐转变为长梭形长条样,免疫荧光检测见梭形细胞胞浆中有大量αSMA表达。大部分细胞转分化的时间(72h)明显晚于CTGFmRNA     

通过基因芯片研究苯那普利对HK-2细胞TEMT过程的影响作用

目的通过基因芯片探讨苯那普利对人肾近端小管上皮细胞(HK-2细胞)向间质肌成纤维细胞转分化(TEMT)过程中的影响作用。方法制备苯那普利含药血清,将HK-2细胞随机分为正常组、模型组、苯那普利(洛丁新)组。采用Illumina Bead Chip的人全基因组基因表达芯片(Human HT-12 v4),提取总RNA分离纯化后,经过逆转录、合成、杂交、洗片和扫描获得差异表达基因,并进行差异基因相关分析。结果通过基因芯片技术成功筛选差异表达基因,模型组与正常组比较差异表达基因80个,其中上调表达53个,下降表达27个;洛丁新组与模型组比较差异表达基因227个,其中上调表达118个,下降表达109个。通过基因GO分析,洛丁新组较模型组在细胞增殖、移动、转分化、连接酶活化等生物过程中有更多参与。结论本实验为更加全面阐明苯那普利对TEMT的调控作用提供了实验依据。     

Atrophy or hypertrophy in chronic renal ischemia: role of the IGF-I system

To examine the role of insulin-like growth factor–1 (IGF-1) in renal atrophy of rats with two-kidney, one-clip (2K1C), in which the clipped kidney atrophies, and in the one-kidney, one-clip (1K1C) model of renovascular hypertension, in which it hypertrophies, we studied levels of IGF-I, mRNA, and protein in 2K1C, 1K1C, and unilateral nephrectomy (NPX) in rats by solution-hybridization RNase protection, and radioimmunoassay, respectively, both cross-reactively and longitudinally at 3, 10, and 30 days after clipping. Three days after clipping, there were no differences in blood pressure or kidney size; however, 10 and 30 days postoperation, the clipped kidney shrank in the 2K1C model. The nonclipped 2K1C and the clipped 1K1C and unilateral nephrectomy kidneys increased in weight (P < .05. At day 3 the IGF-I levels were lower (557 ± 54, 335 ± 61 ng/g in control and clipped 2K1C, P < .05, v 1074 ± 186, 1109 ± 54, and 1154 ± 200 ng/g kidney, nonclipped 2K1C, 1K1C, and NPX, respectively). At 30 days the IGF-I levels were 300 ± 24 ng/g in control (P < .05) v clipped 2K1C, 160 ± 19, 218 ± 20 ng/g in nonclipped 2K1C and 406 ± 33 and 470 ± 34 ng/g in 1K1C and NPX, respectively (P < .05) v control and clipped 2K1C. Kidney mRNA was increased in the clipped 2K1C. In conclusion, the kidney that had higher IGF-I levels early in nonclipped 2K1C, 1K1C, and nephrectomy hypertrophied, and the kidney (clipped 2K1C) that failed to increase IGF-I atrophied. IGF-I levels are dissociated from the local mRNA message.